Summary
Här presenteras ett protokoll för in vivo helhjärnavbildning av larvzebrafiskar med hjälp av tredimensionell fluorescensmikroskopi. Den experimentella proceduren inkluderar provberedning, bildförvärv och visualisering.
Abstract
Som ett ryggradsdjur modelldjur används larvzebrafisk i stor utsträckning inom neurovetenskap och ger en unik möjlighet att övervaka hela hjärnaktiviteten vid cellulär upplösning. Här tillhandahåller vi ett optimerat protokoll för att utföra helhjärnavbildning av larvzebrafiskar med hjälp av tredimensionell fluorescensmikroskopi, inklusive provberedning och immobilisering, provinbäddning, bildförvärv och visualisering efter avbildning. Det nuvarande protokollet möjliggör in vivo-avbildning av strukturen och neuronaktiviteten hos en larval zebrafiskhjärna med en cellulär upplösning i över 1 timme med hjälp av konfokalmikroskopi och specialdesignad fluorescensmikroskopi. De kritiska stegen i protokollet diskuteras också, inklusive provmontering och positionering, förhindrande av bubbelbildning och damm i agarosgelen och undvikande av rörelse i bilder orsakade av ofullständig stelning av agarosgelen och förlamning av fisken. Protokollet har validerats och bekräftats i flera inställningar. Detta protokoll kan enkelt anpassas för avbildning av andra organ av en larval zebrafisk.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) har allmänt antagits som ett modellryggradsdjur inom neurovetenskapen på grund av dess optiska transparens i larvstadiet, dess snabba utveckling, dess låga underhållskostnader och tillgången på olika genetiska verktyg 1,2,3,4. I synnerhet ger larvernas optiska transparens i kombination med genetiskt kodade fluorescerande reportrar av biologiska händelser 5,6,7,8,9 en unik möjlighet att avbilda både neuronaktivitet och struktur på hela hjärnnivån 10,11,12,13,14 . Men även med ett mikroskop som stöder cellulär upplösning behåller de förvärvade bilderna inte nödvändigtvis informationen på encellsnivå; Den optiska bildkvaliteten kan försämras på grund av aberrationen som införs av agarosgelen som används för provmontering, fisken kan monteras i en vinkel, så de intressanta regionerna är inte helt inneslutna inom mikroskopets synfält, och fisken kan röra sig under inspelningen, vilket orsakar rörelseartefakter i bilderna eller hindrar exakt signalutvinning från bilderna.
Således behövs ett effektivt och reproducerbart protokoll för att förvärva högkvalitativa bilddata med minimalt brus och rörelse. Tyvärr beskriver offentligt tillgängliga protokoll för avbildning av en hel hjärna av larvzebrafisk in vivo 15,16,17,18,19 bara kortfattat proceduren, vilket lämnar väsentliga delar av detaljerna, såsom agarosstelning, exakta monteringstekniker och provpositionering med pincett, upp till varje experimentalist. Dessutom kan inkonsekvenser i agaroskoncentration och immobiliseringsmetoder 10,11,14,15,16,17,18,19 leda till utmaningar som uppstår vid fiskrörelser under avbildningsprocessen.
Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för helhjärnavbildning av larvzebrafiskar med hjälp av tredimensionell fluorescensmikroskopi. Figur 1 ger en grafisk översikt över protokollet: provberedning och immobilisering, provinbäddning, bildförvärv och visualisering efter avbildning. Den strukturella och funktionella avbildningen av larvens zebrafiskhjärna in vivo demonstreras med hjälp av ett kommersiellt konfokalmikroskop och ett specialdesignat fluorescensmikroskop. Detta protokoll kan skräddarsys av utövare för hjärnavbildning med vissa sensoriska stimuli eller beteendesammanhang beroende på experimentella behov och design.
Protocol
Alla zebrafiskexperiment godkändes av KAISTs kommitté för institutionell djurvård och användning (IACUC) (KA2021-125). Totalt 12 vuxna zebrafiskar med panneuronalt uttryck av kalciumindikatorn GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)] på en casper [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)] bakgrund användes för avel. Denna grupp bestod av åtta honor och fyra hanar, med åldrar som varierade från 3 till 12 månader. Bildexperiment utfördes på larvzebrafiskar 3-4 dagar efter befruktning (d.p.f.), ett stadium under vilket deras kön inte kan bestämmas.
1. Beredning av zebrafiskprov
- Samla embryon efter uppfödning av vuxna fiskar av en önskad transgen linje, såsom Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22, i en petriskål fylld med äggvatten (se Materialförteckning). Placera embryona i en inkubator vid 28 °C och höj dem till 3-4 d.p.f. larver23,24,25.
- Om zebrafiskbakgrunden inte är albino, för att hämma en bildning av pigmentering, överför embryona 24 timmar efter befruktning (h.p.f.) till petriskålen fylld med äggvatten innehållande 200 μM 1-fenyl-2-tiourea (PTU; se materialtabell)25,26. Var 24:e timme, överför fisken till en ny skål med färskt äggvatten innehållande 200 μM PTU.
OBS: Zebrafisken hålls under standardförhållanden vid 28 °C och en 14:10 h ljus: mörk cykel. PTU-behandlingen är känd för att påverka beteendet och sköldkörtelfunktionen hos larvzebrafisk27,28. Därför är det viktigt att använda PTU med försiktighet och att noggrant kontrollera potentiella förvirrande faktorer i eventuella experiment.
- Om zebrafiskbakgrunden inte är albino, för att hämma en bildning av pigmentering, överför embryona 24 timmar efter befruktning (h.p.f.) till petriskålen fylld med äggvatten innehållande 200 μM 1-fenyl-2-tiourea (PTU; se materialtabell)25,26. Var 24:e timme, överför fisken till en ny skål med färskt äggvatten innehållande 200 μM PTU.
- För att hitta provet som uttrycker fluorescerande proteiner av intresse (t.ex. panneuronal GCaMP7a), screena provet under ett epifluorescensmikroskop och välj ett prov med ett ljust uttryck.
- Förbered det valda 3-4 d.p.f. zebrafiskprovet i petriskålen fylld med äggvatten (figur 2A).
OBS: För att registrera spontan neuronal aktivitet rekommenderas det att använda prover mellan 80-100 h.p.f., eftersom nivån av spontan aktivitet är låg före 80 h.p.f. och pigmentutveckling, även med en casper bakgrund, kan försämra bildkvaliteten efter 100 h.p.f. - Bered en 0,25 mg/ml pankuroniumbromidlösning 14,19,29,30,31 genom att tillsätta 1 ml av en 2,5 mg/ml stamlösning (se Materialtabell) till 10 ml äggvatten. Alikvot pankuroniumbromidlösningen i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Överför det förskärmade provet till petriskålen med en överföringspipett.
OBS: Försök att överföra en minsta volym äggvatten med provet. - Överför 0,1 ml av pankuroniumbromidlösningen till petriskålen för förlamning.
OBS: Pankuroniumbromid har en potentiell dämpande effekt på neural aktivitet hos larvzebrafisk32. Det är viktigt att noggrant överväga koncentrationen och varaktigheten av exponeringen för pankuroniumbromid.
2. 2% (vikt/volym) agarosgelberedning
- Slå på ett värmeblock och ställ in måltemperaturen på 37 °C. Vänta tills enheten värms upp och balanserar vid inställd temperatur.
- Lös 0,2 g agarospulver med låg smältpunkt (se materialförteckning) i 10 ml äggvatten.
- Värm agaroslösningen i en mikrovågsugn och blanda den genom att skaka och virvla tills agarosen är helt upplöst.
- Alikvot agarosgelen i 1,5 ml mikrocentrifugrör och lagra mikrocentrifugrören på värmeblocket (figur 2B).
OBS: Kontrollera om bubblorna i agarosgelen har försvunnit.
3. Provmontering och positionering
- Kontrollera provet under ett stereomikroskop för att verifiera att larvernas rörelse har upphört och för att utvärdera provets hälsa visuellt genom att kontrollera dess hjärtslag (figur 2C). Om hjärtslaget är för långsamt, kassera provet.
OBS: Om hjärtslagen hos fisken som avbildas är för långsam (t.ex. under 60 slag per minut) kanske det inte är möjligt att utföra långvarig avbildning. För att bedöma fiskens välbefinnande kan hjärtfrekvensen kontrolleras visuellt genom att jämföra den med andra fiskar i samma petriskål. Detta kommer att bidra till att säkerställa att fisken som avbildas är frisk och stabil nog för bildproceduren. - Använd överföringspipetten och placera en enda larvzebrafisk i agarosgelen i 1,5 ml mikrocentrifugröret (figur 2D).
OBS: Se till att kassera pipetten efter överföring av provet. - Häll agarosgelen i petriskålen för att göra ett 1-2 mm lager. Överför provet i mikrocentrifugrören till petriskålen med överföringspipetten så att larven placeras i mitten av skålen.
OBS: Om det finns damm och bubblor i agarosgelen, ta bort dem med överföringspipetten. - Använd pincett för att placera provet i önskad riktning så att huvudet och svansen är plana (figur 2E).
- Rotera provet med pincett så att båda ögonen är jämna (figur 2F).
OBS: Justeringsprocedurer (position och rotation) bör slutföras innan agarosgelen börjar stelna. - Efter justeringen, vänta tills agarosgelen har stelnat (figur 2G,H).
OBS: Väntetiden för agarosgelen att stelna kan variera från 5-10 min, beroende på gelens volym och storlek. - Efter stelning av agarosgelen fyller du petriskålen med äggvatten och placerar petriskålen med det inbäddade provet på mikroskopsteget (figur 2I).
4. Bildinsamling
- Slå på mikroskopsystemet (t.ex. lasrar, konfokala styrenheter, mikroskop och dator, se materialförteckning) och kontrollera att hela systemet fungerar.
- Välj ett objektivobjektiv med låg förstoring och leta reda på provet i mitten av synfältet.
- Välj en objektivlins med vattendoppning eller vattendoppande objektiv med rätt förstoring (t.ex. 16x 0,8 objektiv med numerisk bländare (NA), se Materialförteckning). Gör finjusteringar av synfältet.
- Ställ in bildparametrarna (t.ex. bildstorlek, lasereffekt, exponeringstid, antal bilder) med hjälp av bildinsamlingsprogram.
Ställ in bildparametrarna för att uppnå bästa möjliga resultat för specifika behov (se inställningarna för bildinsamling i avsnittet representativa resultat). Om bilden är mättad, minska lasereffekten. - Hitta provets hjärna genom att flytta scenen och bestäm dess tjocklek med hjälp av livevisningsläge i programvaran genom att ändra fokalplanen manuellt upp och ner. Ställ in volymens nedre och övre gränser.
OBS: Se till att hela hjärnan är innesluten i synfältet längs både laterala och axiella riktningar. - Ställ in en z-stegstorlek med tanke på mikroskopets axiella upplösning.
OBS: Den optimala z-stegstorleken för avbildning av larvens zebrafiskhjärna beror på avbildningsmodaliteten och mikroskopets upplösning. Som ett exempel användes en z-stegstorlek på 5 μm med tanke på ljusplåtens tjocklek och cellkropparnas genomsnittliga diameter10. - Fortsätt med bildinsamlingen för det inställda synfältet.
- För volymetrisk strukturell avbildning, skaffa en 3D-bild (x, y, z) av hela hjärnan genom att ändra fokalplanen och få 2-D-bilder av varje z-plan sekventiellt.
- För funktionell avbildning av ett enda z-plan, skaffa tidsseriebilder (x, y, t) av hjärnans neuronala aktivitet på ett visst djup.
- För volymetrisk funktionell avbildning, skaffa en 4-D-bild (x, y, z, t) av neuronaktiviteten i hela hjärnan genom att erhålla 3-D-bilder sekventiellt.
Ställ in antalet bildrutor med hänsyn till datorns tillgängliga minnesstorlek. En förvärvstid på mindre än 1 h rekommenderas på grund av varaktigheten av effekten av pankuroniumbromid.
- Efter att ha hämtat bilder, spara resultaten och registrera bildparametrarna (t.ex. pixelstorlek, z-stegstorlek, bildhastighet, lasereffekt) för bildanalys.
- Exportera bilderna i ett lämpligt format för dataåtergivning och bildanalys.
Vi rekommenderar att du exporterar bilder i formatformatet Tagged Image File (TIF). TIF stöder förlustfri bildkomprimering och är kompatibel med de flesta bildbehandlingsprogram och programmeringsspråk. Dessutom stöder TIF-formatet inkludering av metadata, såsom förvärvsparametrar, bildupplösning och annan relevant information som kan underlätta datatolkning och reproducerbarhet.
5. Inställning för visualiseringar med napari
Napari är en flerdimensionell bildvisare med öppen källkod i en Python-miljö med GPU-baserad rendering33. Den napari-animation plugin ger en programmatisk skapande av filmer. Användning av Fiji, ett bildbehandlingsprogram med öppen källkod, rekommenderas för allmän bildbehandling, såsom filtrering och geometrisk transformation (se materialförteckning). Källkoden som används för visualiseringen med napari finns på GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).
- Installera napari och napari-animation med antingen pip eller conda. Efter installationen skapar du en ny jupyter notebook-fil.
Körning med jupyter notebook, som är ett interaktivt verktyg för Python, rekommenderas framför Python-skriptet. - Importera napari och napari-animation.
6. Visualisera strukturer med hjälp av napari
- För att visualisera bilder och skapa filmer av den renderade zebrafiskhjärnan, ladda 3D-bilden (x, y, z) och öppna napari-fönstret. Anslut plugin-programmet napari-animation (figur 3A).
- Ange parametrar som voxelstorlek, färgkarta och kontrastgränser i lagerkontrollerna.
- Justera visningsinställningarna (t.ex. perspektiv, vinklar) på arbetsytan.
- Om du vill hämta den återgivna bilden trycker du på hämtningsknappen i animeringsguiden.
- Om du vill generera filmer av den återgivna volymen ändrar du visningsinställningarna och lägger till nyckelrutor (bild 3B).
- När du har lagt till nyckelrutor anger du antalet bildrutor (steg) mellan nyckelrutorna i animeringsguiden. Spara den renderade animeringen.
7. Bildbehandling och visualisering av neuronaktivitet med hjälp av napari
OBS : För att visualisera tidsseriebilderna av neuronal aktivitet som överlagrade bilder av en statisk bakgrund och aktivitet måste en sönderdelningsalgoritm tillämpas på de råa bilderna. Använd en MATLAB-implementering av en sönderdelningsalgoritm som kallas BEAR24. MATLAB-versionen av BEAR finns på GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).
- För att sönderdela den statiska bakgrunden och neuronaktiviteten, applicera BEAR på de råa tidsseriebilderna (x, y, t eller x, y, z, t). Efter sönderdelningen, spara bilderna av bakgrunden och neuronaktiviteten som TIF-filer (Figur 3C).
- Ladda bakgrunds- och neuronaktivitetsbilderna och öppna napari-fönstret. Anslut plugin-programmet napari-animation.
- Använd en grå färgkarta för bakgrundsbilder och en aktiv färgkarta för neuronala aktivitetsbilder (bild 3C).
- Ange parametrar som opacitet och kontrastgränser i lagerkontrollerna.
- Om du vill generera filmer med neuronaktivitet ändrar du visningsinställningarna och lägger till nyckelrutor för att återge animeringen.
- När du har lagt till nyckelrutor anger du antalet bildrutor (steg) mellan nyckelrutorna i animeringsguiden. Spara den renderade animeringen.
Representative Results
Strukturen och neuronaktiviteten hos larvernas zebrafiskhjärnor som uttrycker kalciumindikatorpanneuronal GCaMP7a (Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 med en casper (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 bakgrund avbildades vid 3-4 d.p.f. genom att följa det beskrivna protokollet.
För volymetrisk strukturell avbildning avbildades provet med hjälp av ett kommersiellt punktskanningskonfokalmikroskopisystem utrustat med en 16x 0,8 NA-objektivlins för vattendoppning. En 488 nm excitationslaser användes för både strukturell och funktionell avbildning. Bildhastigheten, bildupplösningen, pixelstorleken och axiell stegstorlek var 0,25 Hz, 2048 x 2048, 0,34 μm respektive 1,225 μm. Bildtagningen tog ca 1 h och 20 min. Det volymetriska synfältet för den förvärvade bilden täckte hjärnregionerna i framhjärnan, mellanhjärnan och bakhjärnan (figur 4A). Neuronala cellkroppar i medulla oblongata, cerebellarplattan, optisk tektum, habenula och dorsal telencephalon i hela hjärnan hos 4 d.p.f. larvzebrafiskar var tydligt synliga i konfokalmikroskopibilderna (figur 4B). 3D-renderingen av konfokalmikroskopibilderna utfördes med napari27 genom att följa ovannämnda protokoll (figur 4C och video 1).
För funktionell avbildning i 2-D avbildades provet med samma konfokalmikroskopisystem, utrustat med en 16x 0,8 NA-objektivlins för vattendoppning. Bildhastigheten, bildupplösningen och pixelstorleken var 2 Hz, 512 x 256 respektive 1,5 μm. De neuronala cellkropparna var tydligt synliga i både bakgrunden och den överlagrade neuronala aktiviteten (figur 5A, B).
För 3D-funktionell avbildning användes ett specialdesignat 3D-mikroskopisystem18 , som in vivo kunde avbilda neuronaktiviteten hos en hel zebrafiskhjärna med ett synfält på 1 040 μm × 400 μm × 235 μm och laterala och axiella upplösningar på 1,7 μm respektive 5,4 μm. Bildhastigheten var upp till 4,2 volymer per sekund. I likhet med att återge strukturella bilddata användes napari för 3D-rendering av kalciumavbildningsdata för hela hjärnan (figur 5C och video 2).
Figur 1: Översikt över försöksförfarandet. Beredning och förlamning av zebrafiskprov (steg 1). 2 % (vikt/volym) agarosgelpreparat (steg 2). Provmontering och positionering (steg 3). Bildinsamling (steg 4). Bildbehandling och visualisering av struktur och neuronaktivitet (steg 5-7). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Experimentellt förfarande för beredning av hela hjärnan . (A) Screenat zebrafiskprov som uttrycker panneuronal GCaMP7a i en petriskål fylld med äggvatten. (B) Utrustning och material som krävs för provmontering och positionering. (1) Värmeblock vid 37 °C; (2) 2 % (vikt/volym) agarosgel; (3) 1,5 ml mikrocentrifugrör; 4) Äggvatten. (5) 0,25 mg/ml pankuroniumbromidlösning; (6) petriskål; (7) pincett; (8) Överför pipett. (C) Stereomikroskopbild av det förlamade provet. Den svarta pilen pekar på provets hjärta. d) Provet i 1,5 ml mikrocentrifugröret överförs med hjälp av en pipett. Infällningen visar en förstorad vy av det inramade området. (E) Provet (svart pil) placeras i mitten av petriskålen med pincett. (F) Provet justeras med pincett. (G) Ett exempel på ett feljusterat inbäddat prov. (H) Ett exempel på ett justerat inbäddat prov. (I) Provet placeras på ett mikroskopsteg under objektivlinsen för bildinsamling. Skalstapel: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Visualisering av larvala zebrafiskars hjärnbilder . (A) 3D-rendering av en konfokalmikroskopibild av en larvzebrafiskhjärna (4 d.p.f) som uttrycker panneuronal GCaMP7a. napari, en flerdimensionell bildvisare med öppen källkod i en Python-miljö, användes för renderingen. Napari-fönstret består av lagerkontroller (röd ruta), en lagerlista (gul ruta), en arbetsyta (blå ruta) och en animeringsguide (grön ruta). (B) Nyckelbildrutor med flera visningsinställningar läggs till för återgivning av en animering. (C) Konfokalmikroskopibild av 2-D time-lapse-avbildning av neuronaktiviteten i larvens zebrafiskhjärna. Bilden sönderdelas till bakgrunden (vänster) och neuronal aktivitet (mitten) och överlagras sedan (höger). Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bildstruktur av en larval zebrafiskhjärna. (A) Maximal intensitetsprojektion (MIP) av en konfokalmikroskopibild av en larvzebrafiskhjärna (4 d.p.f.) som uttrycker panneuronal GCaMP7a. Överst: lateral MIP. Botten: axiell MIP. Varje gräns innehåller framhjärnan (röd), mellanhjärnan (gul) och bakhjärnan (blå). (B) Totalt 10 axiella skivor på flera djup från en volymetrisk bild av hjärnan (vid z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, räknat uppåt uppifrån och ner; z = 0 μm indikerar hjärnans övre yta). Varje vit låda representerar hjärnans region (medulla oblongata, cerebellär platta, optisk tektum, habenula och dorsal telencephalon). (C) Hela hjärnan återges med hjälp av napari. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Avbildning av neuronal aktivitet hos en larval zebrafiskhjärna. (A) Konfokalmikroskopibild av neuronal aktivitet i en larval zebrafisk (4 d.p.f.) hjärna som uttrycker panneuronal GCaMP7a. Skalstapel: 100 μm. (B) Förstorad bild av det boxade området i A som visar neuronaktiviteten i det optiska tektum vid flera tidpunkter. Skalstapel: 20 μm. (C) 3D-rendering av hela hjärnans neuronala aktivitet i larvens zebrafiskhjärna förvärvad med hjälp av ett specialdesignat mikroskop (vänster: t = 133 s; höger: t = 901 s). Den neuronala aktiviteten läggs på den statiska bakgrunden. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Timelapse-avbildning med och utan provdrift. (A) Time-lapse-avbildning av larvens zebrafiskhjärna som uttrycker panneuronal GCaMP7a med provdrift. Äggvatten tillsattes till provet före stelning av agarosgelen (steg 3.6-3.7). Fisken rörde sig i laterala och axiella riktningar. (B) Time-lapse-avbildning av en zebrafiskhjärna utan provdrift. Äggvatten tillsattes till provet efter stelning av agarosgelen (steg 3.6-3.7). Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: 3D-rendering av hela hjärnstrukturen hos en larval zebrafiskhjärna (4 d.p.f.) som uttrycker panneuronal GCaMP7a. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: 3D-rendering av neuronaktivitet i hela hjärnan i en larval zebrafisk (4 d.p.f.) hjärna som uttrycker panneuronal GCaMP7a. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Det nuvarande protokollet möjliggör in vivo-avbildning av hela hjärnan av larvzebrafiskar under en längre period (t.ex. längre än 1 timme) och visualiseringar av förvärvade strukturella och funktionella bilddata.
De mest kritiska stegen är provmontering och positionering. Under provinbäddning är det viktigt att förhindra bubbelbildning och undvika damm i agarosgelen. Om gelen innehåller luftbubblor och damm kan bildkvaliteten försämras kraftigt. När du placerar provet med pincett är det viktigt att se till att provet är jämnt både horisontellt och vertikalt. Annars kan de intressanta regionerna inte ingå i mikroskopets synfält. Dessutom bör denna positionering göras inom ett kort tidsfönster före stelning av agarosgelen för att undvika att skada dess yta, eftersom sådan skada äventyrar bildkvaliteten.
En annan stor utmaning är att undvika rörelse i bilder som kommer från ofullständig stelning av agarosgelen (figur 6) och förlamning av zebrafisken. När äggvatten tillsätts provet före fullständig stelning av agorsegelen, rör sig fisken långsamt både lateralt och axiellt och manifesterar sig som provdrift i tidsseriebilderna (figur 6A). Om dosen av paralytika är otillräcklig eller effektens varaktighet slutar, kan provet försöka röra sig, vilket visas som snabba ryckningar i time-lapse-bilderna.
Trots vikten av de ovan nämnda stegen för att förvärva högkvalitativa bilder utan rörelseartefakter, ger offentligt tillgängliga protokoll 15,16,17,18,19 endast en kort översikt över experimentproceduren, utan dessa detaljer. Till exempel lider de förvärvade bilderna utan immobiliseringsprotokoll11 av betydande rörelseartefakter som gör nedströms bildanalys utmanande. Genom att integrera viktiga komponenter, såsom agarosgelstelning och provförlamning, förbättrar vårt protokoll avsevärt konsistensen i kvaliteten på förvärvade bilder samtidigt som rörelseartefakter minimeras.
Sammanfattningsvis beskrivs en optimerad och reproducerbar experimentell procedur för in vivo-avbildning av larvens zebrafiskhjärna. Giltigheten och reproducerbarheten av detta protokoll för in vivo-avbildning av hjärnaktivitet och struktur har bekräftats i flera inställningar14,18,29,30,31. Det nuvarande arbetsflödet fokuserade på hela hjärnans avbildning av larvzebrafiskar, men det kan enkelt tillämpas för att avbilda andra organ av larvzebrafisk35,36.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Zebrafisklinjerna som används för kalciumavbildning tillhandahölls av Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Korea. Denna forskning stöddes av National Research Foundation of Korea (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
| 50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
| Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
| Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
| Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
| Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
| Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
| NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
| Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
| Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
| Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
| Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
| Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |
References
- Choi, T. -Y., Choi, T. -I., Lee, Y. -R., Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Experimental & Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).
- Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Piatkevich, K. D., et al. A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. Nature Chemical Biology. 14 (4), 352-360 (2018).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Looger, L., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Biorxiv. , (2021).
- Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nature Methods. 10 (5), 413-420 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11 (7), 727-730 (2014).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).
- Ahrens, M. B., Engert, F.
- Yoon, Y. -G., et al. Sparse decomposition light-field microscopy for high speed imaging of neuronal activity. Optica. 7 (10), 1457-1468 (2020).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Cong, L., et al. Rapid whole brain imaging of neural activity in freely behaving larval zebrafish (Danio rerio). eLife. 6, e28158 (2017).
- Bruzzone, M., et al. Whole brain functional recordings at cellular resolution in zebrafish larvae with 3D scanning multiphoton microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 11048 (2021).
- Cho, E. -S., Han, S., Lee, K. -H., Kim, C. -H., Yoon, Y. -G. 3DM: deep decomposition and deconvolution microscopy for rapid neural activity imaging. Optics Express. 29 (20), 32700-32711 (2021).
- Zhang, Z., et al. Imaging volumetric dynamics at high speed in mouse and zebrafish brain with confocal light field microscopy. NatureBiotechnology. 39 (1), 74-83 (2021).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Current Biology. 23 (4), 307-311 (2013).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233 (2), 329-346 (2001).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Morsch, M., et al. Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Han, S., Cho, E. -S., Park, I., Shin, K., Yoon, Y. -G. Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , Springer International Publishing. 595-604 (2021).
- Shin, C., et al. Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network. Medical Image Analysis. 82, 102600 (2022).
- Eom, M., et al. Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data. bioRxiv. , (2022).
- Johnston, L., et al. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (81), e51065 (2013).
- Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , 3555620 (2022).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Voleti, V., et al. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).
