Summary
이 연구는 안저 전체의 다양한 자가형광 수준을 설명하면서 개별 관심 영역(예: 연령 관련 황반변성[AMD]의 드루젠 및 망막하 드루세노이드 침착물)의 자가형광 수준을 결정하고 비교하는 워크플로우를 설명합니다.
Abstract
안저 자가형광(FAF) 이미징을 통해 안구 안저, 특히 망막 색소 상피(RPE)의 고유 형광단을 비침습적으로 매핑할 수 있으며, 이는 이제 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경 기반 정량적 자가형광(QAF)의 출현으로 정량화할 수 있습니다. QAF는 일반적으로 연령 관련 황반 변성(AMD)에서 후극에서 감소하는 것으로 나타났습니다. QAF와 다양한 AMD 병변(드루젠, 망막하 드루세노이드 침착물) 사이의 관계는 아직 불분명합니다.
이 백서는 AMD에서 병변별 QAF를 결정하는 워크플로우에 대해 설명합니다. 스펙트럼 도메인 광간섭 단층촬영(SD-OCT) 황반 부피 스캐닝 및 QAF를 포함하되 이에 국한되지 않는 다중 모드 생체 내 이미징 접근 방식이 사용됩니다. 맞춤형 FIJI 플러그인을 사용하여 해당 QAF 이미지를 SD-OCT 스캔의 근적외선 이미지(특성 랜드마크, 즉, 선박 분기)와 정렬합니다. 시신경두의 중심와와 가장자리는 분석 그리드의 정확한 위치 지정을 위해 OCT 이미지에 표시되고 등록된 QAF 이미지로 전송됩니다.
그런 다음 AMD 특이적 병변을 개별 OCT BScan 또는 QAF 이미지 자체에 표시할 수 있습니다. 규범적 QAF 맵은 안저 전체에 걸쳐 QAF 값의 다양한 평균과 표준 편차를 설명하기 위해 생성됩니다(대표적인 AMD 그룹의 QAF 이미지를 평균화하여 규범적 표준 망막 QAF AMD 맵을 구축함). 플러그인은 X 및 Y 좌표, z-스코어(평균과의 표준 편차를 기준으로 AF 맵의 평균과 관련하여 QAF 값을 설명하는 수치 측정), 평균 강도 값, 표준 편차 및 표시된 픽셀 수를 기록합니다. 이 도구는 또한 표시된 병변의 경계 영역에서 z-점수를 결정합니다. 이 워크플로우와 분석 도구는 AMD의 병태생리학 및 임상 AF 이미지 해석에 대한 이해를 향상시킵니다.
Introduction
안저 자가형광(FAF) 영상은 안구 안저의 자연적 및 병리학적으로 발생하는 형광단에 대한 비침습적 매핑을 제공합니다1. 가장 흔한 청색(488nm 여기) 자가형광(AF)은 망막 색소 상피(RPE)의 리포푸신 및 멜라노리포푸신 과립을 여기시킵니다2,3,4. 과립의 분포와 증가/감소는 정상적인 노화와 연령 관련 황반 변성(AMD)을 포함한 다양한 망막 질환에서 중심적인 역할을 합니다5.
FAF, 정량적 안저 자가형광(QAF)의 추가 개발로 이제 지형학적으로 분해된 망막 AF 강도를 정확하게 측정할 수 있습니다 4,6. FAF 이미징 장치의 광학 경로에 기준을 통합하면 장치, 시점 및 피사체 간에 AF 강도를 비교할 수 있습니다. 이 기술은 AMD의 병리유전학적 인자로 추정되는 패러다임의 변화를 가져왔는데, 이는 오랫동안 RPE 세포의 과도한 리포푸신 축적 때문인 것으로 추측되었다7. 그러나 심방세동의 조직학적 및 임상적 정량화는 심방세동 8,9,10의 증가 대신 AMD의 심방세동 감소(자가형광 리포푸신 및 멜라놀리포푸신 과립의 재분포 및 손실로 인해)를 나타냈습니다.
심방세동 모니터링은 임상적 의미가 있습니다. Von der Emde et al. 등은 고위험군 중급 AMD 눈에서 심방세동이 감소할 뿐만 아니라 AMD의 진행 과정에서 더욱 감소한다는 것을 보여주었습니다 8,9. 또한, 조직학적 연구에 따르면 대부분의 AMD 영향을 받은 RPE 세포는 섭입, 슬라잉, 이동 또는 위축을 통한 RPE 세포 손실 이전에 과립 응집 및 압출과 함께 특징적인 거동을 보입니다13,14,15,16. 이는 심방세동 손실이 임박한 질병 진행의 방아쇠 또는 대리 신호일 수 있음을 나타냅니다.
지금까지의 QAF 연구는 조립식 그리드 극좌표계(예: QAF8/Delori Grid)를 사용하는 후극에서만 전 세계적으로 AF를 평가했습니다17. 조립식 격자를 사용하여 AF를 측정하면 피사체의 눈당 미리 결정된 영역에 여러 AF 값이 표시됩니다. 이러한 방식으로 AF 값을 조사하면 병리학적으로 변경된 AF가 있는 영역(예: 드루젠 또는 망막하 드루세노이드 침착물(SDD)의 상단 또는 그 근처에 있는 AMD의 국부적 변화를 놓칠 수 있습니다. 드루젠(Drusen)과 더 높은 수준의 SDD는 후기 AMD 및 시력 상실 발병 위험이 높습니다. 특히 드루젠은 수년에 걸쳐 크기가 커지는 전형적인 주기를 가지고 있으며 위축되기 전에 급격히 악화될 수 있습니다. 예를 들어, AMD에서는 전체 심방세동이 감소하지만, 이러한 특정 질병 관련 국소 병변 및 그 주변에서 증가하거나 심지어 더 감소한다고 생각할 수 있습니다.
다양한 국소 심방세동 패턴도 질병 진행에 대한 예후 관련성을 가질 수 있습니다. 예를 들어, 자가형광 수준은 드루젠의 크기가 증가하고 있는지 또는 이미 위축으로 회귀하고 있는지 여부를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 지리적 위축에서 변경된 심방세동 주변 패턴은 시간이 지남에 따라 위축 진행에 큰 영향을 미친다는 것이 이미 밝혀졌다18. 또한 국소 자가형광 패턴은 RPE의 상태에 대한 추가 세부 정보를 나타낼 수 있습니다. 종종 광간섭 단층촬영(OCT)은 RPE 층이 손상되지 않은 것처럼 보이지만 맥락막에 대한 과반사를 보여줍니다. 국소 QAF 값과 OCT를 결합한 복합 접근법은 RPE 중단 및 임박한 위축의 위험이 높은 병변을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
연구에서 공간적으로 해석된 분석이 수행되지 않은 이유 중 하나는 가장 일반적으로 사용되는 제조업체의 소프트웨어가 이러한 유형의 분석을 위한 도구를 제공하지 않기 때문입니다. AMD 질병 단계에 따라 달라지는 다양한 병변의 심방세동 특성은 AMD의 발병 기전을 추가로 설명할 수 있습니다. 따라서 국소적 병변 특이적 AF를 측정하는 도구가 바람직할 것입니다. 망막 전체에 위치한 병변을 정확하게 비교하기 위해, 워크플로우는 인간 안저에서 다양한 정도의 AF를 설명할 수 있는 방법이 필요하다19. 가장 중심적으로, 심방세동은 황반 색소의 그림자 효과와 과립 수의 차이로 인해 특징적으로 낮습니다20,21.
심방세동은 ~9°(모든 방향에서 중심와까지의 거리)에서 최고조에 도달하고 주변부에서 더 많이 감소한다4. 따라서 소프트 드루젠(낮은 AF 영역의 중심와와 파라포에 위치)과 SDD(높은 AF 영역의 중심에 위치)의 AF 레벨의 절대값을 비교하면 결과는 비교할 수 없습니다22. Pfau et al.의 연구와 안저 제어 주변 측정에 대한 감도 손실(건강한 대조군의 시력 언덕[중심와까지의 거리에 따른 망막 민감도 감소]에 대해 AMD로 측정된 민감도 보정)의 개념에서 영감을 받아 AF는 황반 전체의 표준화된 AF 값과 비교됩니다23,24. 결과는 z-점수(관심 영역 값과 평균의 관계에 대한 수치 측정)로 보고됩니다.
이 연구의 목적은 AMD 환자의 다양한 유형의 병변에서 국소 QAF 수준을 측정하기 위한 새로운 도구의 사용을 평가하는 것입니다. 이 도구는 OCT 스캔에서 식별된 병변의 자가형광 수준을 측정하도록 설계되었습니다. 이를 통해 연질 드루젠 또는 SDD와 같은 병변의 국소 자가형광 수준을 평가할 수 있으며 시간 경과에 따른 병변의 AF 변화를 추적할 수 있습니다. 이 도구의 잠재적 유용성은 RPE의 상태를 추정하고 조사된 병변에 대한 예후 가치를 가질 수 있는 새로운 구조적 바이오마커를 가능하게 하는 것입니다.
Protocol
이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 본 대학교 윤리 위원회(프로토콜 코드 305/21)의 승인을 받았습니다. 연구에 참여한 모든 피험자로부터 서면 동의를 받았습니다. 동영상에 출연하는 모든 참가자는 온라인 동영상 제작에 자신의 초상과 개인 정보를 사용할 수 있는 권한을 부여하는 동의서에 서명해야 했습니다.
1. 정량적 자가형광(QAF) 이미지 획득
- QAF 장치로 정확한 이미지 획득을 위해 참가자가 장치 앞에 편안하게 앉을 수 있도록 하십시오. 참가자에게 턱과 이마를 턱과 머리 받침대에 대고 누르게 합니다. 측면 눈꺼풀 각도가 빨간색 표시와 같은 높이가 될 때까지 턱받침의 높이를 조정합니다.
- 작은 용기에 초점이 맞춰질 때까지 기록 장치의 휠을 돌려 근적외선 모드에서 이미지의 초점이 맞춰지는지 확인합니다. 이미지의 모서리가 고르게 비춰질 때까지 카메라를 앞으로 움직여 눈을 확대합니다. 일반적으로 초점을 구형으로 조정합니다. 청색 QAF는 더 짧은 파장을 사용하므로 QAF 이미징 전에 초점을 하나 또는 두 디옵터로 줄이고 QAF 장치의 모드를 근적외선에서 QAF 모드로 전환합니다.
- 중심와에 가장 가까운 작은 혈관에 초점이 맞춰지고 이미지가 빨간색 점 없이 밝게 조명될 때까지(과잉 조명을 나타냄) 조명을 재조정 및 확대하고 이미지의 초점을 미세 조정합니다. 이미지 획득 전에 QAF 모드에서 최소 30초 동안 기다렸다가 광색소를 표백하여 카메라 설정의 시야에서 광수용체 안료를 표백할 수 있도록 합니다.
- 이미지를 캡처하려면 이미징 장치의 터치 패드에서 이미지 획득 을 누르십시오. 획득 중 깜박이거나 갑작스러운 안구 움직임이 있는 경우 두 개 이상의 QAF 이미지를 캡처해야 합니다.
참고: 워크플로우에는 스펙트럼 도메인 광간섭 단층 촬영(SD-OCT) 이미지도 필요합니다. OCT 이미지 획득은 임상 실습에서 널리 사용되기 때문에 다른 곳에서 설명된다25.
2. 이미지 내보내기
- 이 분석 파이프라인의 경우 QAF 및 OCT 이미지가 XML(Extensible Markup Language) 파일 형식인지 확인합니다. HEYEX 뷰어에서 원하는 QAF/OCT 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 내보내기 | 드롭다운 메뉴에서 XML로 .
3. QAF 분석을 위한 오픈 소스 플러그인 - 파이프라인 설치
참고: 제시된 QAF 소프트웨어는 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ(FIJI 확장)26용으로 만들어진 "Spectralis pipeline"이라는 오픈 소스 플러그인입니다.
- 플러그인에 액세스하려면 FIJI를 열고 도움말 을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 업데이트를 선택한 다음 업데이트 사이트 관리를 클릭하여 기존 업데이트 사이트에 Creative Computation 업데이트 사이트 "https://sites.imagej.net/CreativeComputation/"를 추가합니다.
- 플러그인을 다운로드한 다음 FIJI를 다시 시작합니다. 이제 Spectralis Pipeline이 설치되었습니다. 다양한 Spectralis 플러그인은 드롭다운 메뉴 Plugins | Spectralis 또는 플러그인 | SpectralisBatch입니다.
4. 설정 - 데이터 저장
참고: 원활한 워크플로우를 위해서는 다음과 같이 폴더 구조를 설정하는 것이 좋습니다. 먼저 각 연구 주제에 대한 폴더를 설정합니다. 오큘러스 덱스터(OD)와 오큘러스 시니스터(OS)는 각각 오른쪽 눈과 왼쪽 눈을 의미하며, 이러한 약어는 이 워크플로 전체에서 사용됩니다.
- 각 연구 대상의 각 검사된 눈에 대해 각각 OD_OCT 및 OS_OCT라는 OCT용 폴더를 설정합니다. Spectralis 파이프라인이 "Mark_BScans_OCT" 플러그인의 출력을 이러한 폴더에 탭으로 구분된 값으로 자동으로 저장하도록 합니다.
- QAF 이미지의 경우 OD_QAF 및 OS_QAF라는 두 개의 폴더를 만듭니다.
- 다른 다중 모드 이미징 양식이 사용되는 경우 추가 폴더를 만듭니다. 결과 폴더 구조가 아래 나열된 구조와 유사한지 확인합니다.
CASE_ID
OD_OCT
OD_QAF
OD_other_imaging_modality
OS_OCT
OS_QAF
OS_other_imaging_modality
5. QAF XML 파일을 QAF 이미지로 변환(사용된 플러그인: QAF_xml_reader)
- Spectralis QAF XML 내보내기 파일은 RGB(red-green-blue) 형식으로 저장되며, 0에서 255 사이의 스케일(측정된 AF 값 표시)로 제한되며 "표준" 및 "검정색" 보정 영역을 포함합니다. "QAF_xml_reader" 플러그인은 QAF 이미지를 생성합니다. 이를 위해 플러그인 드롭다운 메뉴를 열고 Spectralis | QAF_XML_Reader 열고 시작 화면을 버립니다.
- Choose a directory containing a Spectralis XML QAF Export:(스펙트럼 XML QAF 내보내기:가 포함된 디렉토리 선택) 프롬프트를 표시하는 새 창이 나타납니다. 디렉토리를 선택하고 선택을 클릭합니다.
- QAF 장치의 기준 보정 계수(RCF)(QAF 이미지의 이미지 정보에 포함)와 이미지 촬영 당시 환자의 나이 를 입력합니다.
- 다음 창은 QAF 매개 변수입니다. 환자가 이미지 획득 시 가성식(pseudophakic)인 경우 대신 20세를 선택합니다(이렇게 하면 연령 보정을 적용하지 않는 효과가 있음). 확인을 클릭한 후 Map to 8bit라는 팝업이 나타나면 색상으로 구분된 QAF 이미지에 대한 최소 QAF(qafMin) 값과 최대 QAF(qafMax) 값을 입력합니다. qafMin 및 qafMax를 알 수 없는 경우 기본 설정을 사용하고 확인을 클릭한 다음 표시되는 원시 QAF 데이터라고 표시된 원본 이미지와 32비트 QAF 및 8비트 색상으로 구분된 QAF 이미지를 관찰합니다.
참고: 색상으로 구분된 QAF 이미지는 설명 목적으로만 사용됩니다. 실제 QAF 값이 있는 32비트 QAF 이미지가 추가 분석에 사용됩니다.
6. OCT 이미지에 QAF 이미지 등록하기(사용하는 플러그인: Register_OCT_2)
참고: 이 단계는 OCT 이미지를 QAF 이미지와 정확하게 정렬하여 QAF 이미지와 OCT BScan의 병변을 정렬하는 데 필요합니다.
- 드롭다운 메뉴를 통해 플러그인에 액세스 합니다 Plugins | Spectralis를 사용하거나 단축키를 만들어 사용된 다른 플러그인에 액세스할 수 있습니다. Register_OCT_2 이렇게 하려면 Plugins(플러그인) | 단축키 | 단축키를 추가하고 원하는 단축키를 선택합니다.
- 플러그인을 연 후 나타나는 첫 번째 창에서 확인을 클릭합니다. 그런 다음 Spectralis OCT XML 내보내기가 포함된 디렉토리를 선택합니다 . 기본 ImageJ 창에 나타납니다. Spectralis OCT XML 내보내기 가 포함된 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다.
참고: 이제 OCT가 로드되며 사용 중인 컴퓨터의 처리 능력에 따라 최대 2분이 소요될 수 있습니다. - 그런 다음 등록된 이미지 저장 위치: 프롬프트가 포함된 창이 나타날 때까지 기다립니다. EnFaceStack (정렬된 이미지 파일)을 저장할 디렉토리를 선택하고 열기를 클릭합니다.
- Choose an image to add to the EnFaceStack:(EnFaceStack에 추가할 이미지 선택)이라는 메시지가 포함된 팝업 창이 나타날 때까지 기다렸다가 32비트 QAF 이미지를 선택하여 SD-OCT에 이미지를 정렬하고 열기를 클릭합니다. 이 EnFaceStack에 필요한 모든 이미지가 포함되어 있으면 취소를 선택합니다.
- 다음 창에서 사용자에게 EnFaceStack의 레이블을 선택하라는 메시지가 표시되면 미리 만들어진 QAF 레이블을 선택합니다. 또는 기타(Other) 상자에 원하는 모달리티 이름을 입력합니다. 확인을 선택하여 이미지를 등록합니다.
참고: 기타 필드에 공백이나 다른 문장 부호를 포함하지 마십시오. - 팝업되는 세 개의 창을 관찰합니다. 첫 번째는 로컬라이저로 레이블이 지정되고 SD-OCT를 왼쪽 눈(OS) 이미지로 표시합니다. 두 번째 창의 이름은 QAF 또는 이전에 원래의 왼쪽(OS) 또는 오른쪽(OD) 눈으로 선택한 다른 모달리티 중 하나입니다. 마지막 창은 랜드마크라고 하며, 각 이미지에서 1개에서 3개의 랜드마크를 선택하도록 요청합니다.
- 이미지-혈관 분기 또는 두 양식에 있는 다른 특성당 1개에서 3개의 랜드마크를 선택하여 두 이미지를 정렬합니다. 랜드마크를 선택하기 전에 확대(확대하려면 " +" 키보드 문자를 사용하고 축소하려면 " -"를 사용)합니다. 선택한 랜드마크가 이미지에서 세로와 가로로 모두 퍼져 있는지 확인합니다. 모든 랜드마크에 주석이 추가되면 랜드마크 탭에서 확인을 선택하고 다음 프롬프트에서 취소를 선택합니다.
- 결과를 보시겠습니까(Do you want to see the results) 창이 나타나면 예(Yes)를 선택하여 이미지가 올바르게 정렬되었는지 확인합니다. 작은 선박을 확대하고 그 옆에 커서를 놓은 다음 위 또는 아래로 스크롤하여 선박이 커서와 관련하여 얼마나 움직이는지 확인하면 됩니다. 정렬이 정확하지 않으면 OD_QAF 디렉토리에서 ".tiff" 파일을 삭제하고 2단계의 시작부터 프로세스를 다시 시작합니다.
참고: Mark_BScans_OCT의 표시가 정확해야 하므로 SD-OCT와 QAF 이미지 간의 정렬도 매우 정확해야 합니다. 대부분의 이미지에서 픽셀 단위의 완벽한 정렬을 달성할 수 있지만 경우에 따라 정렬이 3픽셀 또는 4픽셀의 정확도로 제한됩니다.
7. 비교를 위한 평균 QAF 이미지 생성(사용된 플러그인: StandardRetina/BatchStandardRetina)
참고: QAF 값은 망막 위치(예: 황반 색소로 인한 중앙 섀도잉)에 따라 크게 달라집니다. 따라서 drusen의 QAF 값은 동일한 영역의 표준 QAF 값과 비교되어야 합니다. 분석의 전제 조건으로 StandardRetina 는 평균 QAF 이미지(예: 연령 일치 대조군 코호트)의 엔페이스 맵을 생성합니다. 결과 표면 맵은 중심 망막에 대한 평균 QAF 값의 픽셀 단위 맵을 보여줍니다.
- Spectralis 파이프라인 내에서 표준 망막을 만드는 방법에는 두 가지가 있는데, 첫 번째 방법인 AddToStandardRetina_OCT는 한 번에 하나의 케이스를 엔페이스 맵에 추가할 수 있는 반면, 두 번째 방법인 BatchStandardRetina는 한 번에 여러 케이스를 추가합니다.
- 한 번에 하나의 이미지를 추가하려면 플러그인 | 스펙트랄리스 | AddToStandardRetina_OCT 을 클릭하고 시작 화면을 닫습니다. Choose a directory containing a Spectralis OCT XML export(Spectralis OCT XML 내보내기가 포함된 디렉토리 선택)라는 텍스트가 표시되는 창이 나타나면 폴더를 선택하고 Select(선택 )를 클릭하여 BScan을 엽니다.
- Choose a directory containing registered EnFace images:(등록된 EnFace 이미지가 포함된 디렉토리 선택) 프롬프트를 표시하는 새 창이 나타나면 해당 폴더를 선택하고 Select(선택)를 클릭합니다.
- 두 번째 단계에서 선택한 폴더의 스택 이미지를 표시하는 EnFaceStack 이라는 레이블이 지정된 세 개의 창, OCT BScan을 표시하는 Bscan Stack 이라는 레이블이 지정된 두 번째 창, Choose Modality라는 레이블이 중간에 나타나는 세 번째 창입니다. EnFaceStack에서 모달리티를 선택합니다.
- 형식을 선택하고 StandardRetina가 포함된 디렉터리 선택 프롬프트와 함께 팝업되는 새 창을 관찰합니다. StandardRetina가 포함된 디렉터리가 아직 없는 경우 빈 폴더를 선택하여 새 StandardRetina를 만듭니다.
- 새 StandardRetina를 검사하고 위아래로 스크롤한 다음 커서를 이동하여 특정 위치에 대한 평균 및 표준 편차를 확인합니다. Accept? 버튼을 클릭하십시오. 을 클릭하여 StandardRetina 에 최신 사진을 추가하거나 삭제합니다.
- 한 번에 여러 이미지를 추가하려면 Batch_QAF_StandardRetina를 사용합니다.
- 먼저 사례 ID와 동일한 폴더에 "manifest.txt" 파일을 준비하고 .txt 파일의 위치에서 OCT 및 EnFaceStack까지의 상대 경로를 나열하는지 확인합니다. 두 개를 탭 공간으로 구분하고 이름 앞뒤에 추가 공백이 없는지 확인합니다. 파일은 다음 설정과 유사해야 합니다.
pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-10월>001/OD-QAF
pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-10월>002/OD-QAF - 스프레드시트 소프트웨어에서 파일을 만들고 txt 파일로 저장합니다. 매니페스트 파일이 제대로 작동하려면 모든 경로에 슬라이스(문자 문자) QAF 가 포함되어 있는지 확인합니다. 플러그인은 드롭다운 메뉴 아래에 있습니다 Plugins | Spectralis배치-배치 | QAF_StandardRetina.
- 시작 화면을 닫고 새 창이 열릴 때까지 기다렸다가 초기 표준 망막 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 기존 StandardRetina 가 있는 폴더를 선택하거나 빈 폴더를 선택하여 새 StandardRetina를 만듭니다.
- Select Modality(양식 선택)라는 프롬프트가 나타나는지 확인합니다. 기본값은 QAF입니다. 각 모달리티의 파일 이름이 매니페스트 파일에 명명된 모든 EnFaceStack의 조각 파일 이름과 정확히 일치하는지 확인합니다. 그런 다음 사용자에게 매니페스트 파일(앞에서 설명)을 선택하라는 창이 열리면 이 StandardRetina에 다른 매니페스트 파일을 추가하지 않으려면 취소를 클릭하거나 다른 매니페스트 파일을 선택합니다. 수락?이라는 레이블이 지정된 새 창에서 새 StandardRetina를 검사하고 StandardRetina에 최신 일괄 처리를 추가할지 아니면 최신 일괄 처리를 삭제할지 결정합니다.
참고: 모든 QAF를 StandardRetina 에 결합하는 과정은 시간이 걸릴 수 있습니다.
- 먼저 사례 ID와 동일한 폴더에 "manifest.txt" 파일을 준비하고 .txt 파일의 위치에서 OCT 및 EnFaceStack까지의 상대 경로를 나열하는지 확인합니다. 두 개를 탭 공간으로 구분하고 이름 앞뒤에 추가 공백이 없는지 확인합니다. 파일은 다음 설정과 유사해야 합니다.
8. 분석을 위해 관심 영역에 주석 달기(사용된 플러그인: Mark_BScans_OCT)
- 병변(예: drusen)을 표시하려면 Plugins | 스펙트랄리스 | Mark_BScans_OCT 시작 프롬프트를 닫습니다. Choose a directory containing a Spectralis OCT XML export to appear( Spectralis OCT XML 내보내기가 포함된 디렉터리 선택 )이라는 레이블이 지정된 새 창이 나타나는지 확인합니다. 원하는 OCT가 있는 폴더를 선택하고 확인을 클릭합니다.
- FIJI가 OCT를 로드한 후 Choose a directory containing registered en face images to appear(표시할 등록된 얼굴 이미지가 포함된 디렉터리 선택 ) 레이블이 있는 새 창을 확인합니다. EnFaceStack 이 포함된 디렉토리를 선택하고 선택을 클릭합니다.
- 이제 EnFaceStack, BscanStack, User Parameters라는 세 개의 새 창이 나타납니다.
- User Parameters(사용자 매개변수) 창에 Case ID(케이스 ID)를 입력하라는 메시지가 표시되며, 케이스 ID는 출력 csv 파일 이름, 대역폭(mm), 엔페이스 선 너비, BScan 선 너비 및 영역 마스크 불투명도에 표시됩니다.
- 매개변수 대역폭(mm)은 각 등선체의 너비(밀리미터)를 결정합니다. Enface line width를 사용하여 EnFaceStack이라는 레이블이 지정된 창에서 표시된 병변의 선 너비를 변경합니다.
- BScan 선 너비는 창 Bscan Stack의 선 너비를 결정합니다. 이 매개 변수를 1로 설정하는 것이 대부분의 경우 가장 좋은 선 너비 설정입니다.
- En Face Mask 또는 별도의 창에 표시되는 Distance Map 중에서 선택하여 내부 밴드를 채색할지 여부를 결정합니다. 그런 다음 플러그인의 Mark in BScan 창에서 완료를 클릭합니다.
- 그런 다음 기존 StandardRetina를 선택하라는 메시지가 표시되면 StandardRetina가 포함된 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다. StandardRetina를 선택하면 출력 Mark_BScans_OCT에서 모드 z-점수(StandardRetina와 비교하여 측정된 QAF 값)를 선택합니다. 원시 QAF 값을 선호하는 경우 취소를 클릭하고 결과가 z 점수가 아닌 원시 값이 될 것이라고 경고하는 메시지라는 새 창을 기다립니다.
- User Parameters(사용자 매개변수) 창에 Case ID(케이스 ID)를 입력하라는 메시지가 표시되며, 케이스 ID는 출력 csv 파일 이름, 대역폭(mm), 엔페이스 선 너비, BScan 선 너비 및 영역 마스크 불투명도에 표시됩니다.
- 팝업되는 새 창을 찾습니다 저장된 데이터와 함께 저장된 상태가 포함된 디렉터리를 선택합니다 . 저장 파일이 있는 경우 슬라이스가 포함된 디렉토리를 클릭합니다. 선택. 진행 상황을 저장하지 않으려면 취소를 선택합니다. Mark in BScan이라는 새 창을 찾아 드롭다운 메뉴에서 저장, 무시, 완료 및 표시를 선택합니다.
- 마르크: 위에서 설명한 "Register_OCT_2" 플러그인에서와 유사한 명령을 사용하여 BScan의 관심 영역에 주석을 달기 시작합니다. 영역을 표시하려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 병변 끝으로 드래그하여 시작을 선택하고 B-Sscan의 표시 창에서 표시가 선택되었는지 확인한 다음 확인을 클릭합니다. 이제 관심 영역이 이 BScan에 표시됩니다.
- 무시하다: Mark in BScan 창에서 Ignore(무시)를 선택하고 OK(확인)를 클릭하여 Marking을 무시합니다.
- 구해내다: Mark in BScan 창에서 저장을 선택하고 OK를 클릭하여 상태를 저장할 디렉토리를 선택하라는 메시지가 포함된 새 창이 나타납니다. 기존 폴더를 선택하거나 새 폴더를 만듭니다. "Mark_BScans_OCT"를 시작하여 기존 파일을 열고 저장된 상태가 포함된 디렉터리 선택 창이 나타나면 저장 상태가 포함된 디렉터리를 선택합니다.
참고: 여러 저장 상태를 하나의 디렉토리에 저장할 수 없습니다. 한 로케일에서 다른 로케일로의 저장 상태는 쉽게 전환할 수 없습니다(예: GERMAN에서 USA로). - 수행: Mark in BScan 창에서 done을 선택하고 OK를 클릭하여 choose modality 레이블이 있는 새 창이 나타나도록 합니다.
- 면 스택 위에 올바른 모달리티를 가져오라는 프롬프트가 나타나면 "Register_OCT_2"를 사용하여 정렬된 QAF라는 모달리티를 맨 위로 가져옵니다. EnFaceStack을 스크롤하거나, En face Stack 창을 선택하거나, 왼쪽 또는 오른쪽 화살표를 클릭하여 이 작업을 수행합니다. 모달리티의 이름은 왼쪽 상단 모서리에 표시됩니다.
- 병변을 더 잘 검사하고 표시하려면 Bscan 창을 확대하십시오. B-스캔 창을 클릭하고 확대할 방향으로 마우스를 가리킨 다음 + 키를 누릅니다. 축소하려면 - 키를 누릅니다.
- 마우스에서 위 또는 아래로 스크롤하거나, 하단의 막대를 왼쪽 또는 오른쪽으로 드래그하여 스캔을 이동하거나, B-스캔 프레임을 선택하고 키보드의 왼쪽 및 오른쪽 화살표 키를 클릭하여 BScan 스택을 스크롤합니다. BScan 스택의 현재 영역에 대한 개요는 EnFaceStack 창의 빨간색 선과 BScan 번호(예: 31/120)가 표시되는 BScan 창의 왼쪽 상단에 표시됩니다.
- 확인을 클릭하여 해당 "OD_OCT" 또는 "OS_OCT" 폴더에 새 .tsv 파일을 만듭니다. .tsv 파일 이름은 "Mark_Bscans_OCT"와 입력한 케이스 ID, 측면 및 Mark_Bscans_OCT의 마지막 단계에서 선택한 형식으로 구성됩니다. 또한 드루젠의 색상으로 구분된 "iso-hulls"가 이제 EnFaceStack에 표시됩니다.
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결과를 적절하게 분석하고 결론을 도출하려면 Mark_Bscans_OCT의 출력 파일을 이해하는 것이 중요합니다. 처음 세 열은 사례 ID, 파일의 측면성 및 선택한 이미징 형식 뒤에 레이블이 지정됩니다. 네 번째 열은 모드별로 참조되며 z-점수로 표시됩니다. 이 글을 쓰는 시점에서 Mark BScans는 한 번에 모든 병변만 계산할 수 있습니다. 행은 병변의 바깥쪽 가장자리로부터의 거리가 스프레드시트의 아래쪽 및 위쪽 열에 지정되어 있는 iso-hull을 나타냅니다. Iso-hull은 병변을 둘러싼 지정된 둘레에서 AF를 z-점수(QAF의 경우)로 측정합니다. 등각선체에 있는 픽셀의 최소값은 min이라는 레이블이 붙은 열에서 찾을 수 있고, 중앙값, 최대, 평균, stdev로 레이블이 지정된 열에는 각각 등호선체에 있는 픽셀 값의 평균에 대한 중앙값, 최대값, 평균 및 표준편차가 포함됩니다. n 열에는 iso-hull의 총 픽셀 수가 포함됩니다. 그림 1은 중간 연령 관련 황반 변성(iAMD)을 앓고 있는 84세 남성 환자의 특이하고 뚜렷한 연한 드루젠을 보여줍니다.
그림 2는 QAF-Workflow 도구로 표시된 SDD가 있는 대표적인 환자의 왼쪽 눈을 보여줍니다(그림 3). 이 환자의 SDD는 심방세동 감소와 관련이 있었습니다(z-점수 = -0.4 ± 0.2). 마찬가지로, SDD 주변의 등선체는 StandardRetina에 비해 AF가 감소했습니다(예: 가장 가까운 등선체 = -0.3 ± 0.3). 이 현상에 대한 그럴듯한 설명은 RPE에 대한 SDD 병변의 그림자 효과(반투명도 감소)일 수 있습니다. SDD의 사용은 모범적이었습니다. 이 도구를 사용하면 드루젠과 같은 다른 병변의 국소 AF 수준도 평가할 수 있습니다. 또한 이 도구를 사용하면 시간 경과에 따른 병변의 AF 변화를 추적할 수 있습니다.
그림 1: 중간 연령 관련 황반 변성(iAMD)을 앓고 있는 84세 남성 환자의 특이 표시된 연성 드루젠. (A) 드루젠이 표시된 왼쪽 눈의 QAF 이미지. (B) 드루젠의 클로즈업: 갈색 중앙은 표시된 드루젠을 나타내고 컬러 띠는 주변 등선체를 나타냅니다. 아래 표는 출력 파일을 보여줍니다. QAF 드루젠 값은 StandardRetina의 해당 편심의 해당 QAF 값과 비교됩니다. 그 결과 영향을 받지 않는 영역의 평균에서 벗어난 z-점수가 생성됩니다. 파란색 상자는 왼쪽에서 오른쪽으로 케이스 ID, 눈의 측면, 사용된 모달리티 및 원하는 출력(이 경우 z-점수)을 표시합니다. 주황색 상자 안의 열은 측정 영역의 경계를 밀리미터 단위로 표시합니다(하한 = 하한, 상한 = 상한). 녹색 상자는 QAF 측정값을 표시하는 열에 레이블을 지정합니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 최소값, 중앙값, 최대값, 픽셀 수, 평균 및 평균의 표준 편차가 포함됩니다. 각 행은 등선체를 나타내고, 파란색 상자 안의 행은 병변 내의 값을 나타내고, 보라색 상자 안의 행은 각 병변을 둘러싼 등선체를 나타냅니다(병변까지의 거리가 증가함에 따라 위에서 아래로). 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 초기 AMD를 앓고 있는 80세 여성 환자의 QAF 이미지에서 표시된 SDD. (A) QAF 이미지에서 SDD를 볼 수 있습니다. 동일한 QAF 이미지가 SDD의 각인된 주석과 함께 표시됩니다. (B) 표시된 각 병변 주위에는 등선체가 색상 코딩(연한 녹색, 짙은 녹색 및 빨간색)으로 표시됩니다. (C) 파란색 사각형의 확대 버전. 각 SDD의 바깥쪽 모서리는 파란색으로 표시됩니다. 약어: QAF = 정량적 자가형광; AMD = 연령 관련 황반 변성; SDD = 망막하 드루제노이드 침착물. 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 병변의 AF를 결정하는 워크플로우. 이 그림은 병변별 AF를 결정하는 데 필요한 소프트웨어 플러그인을 시각화한 것입니다. (A) 이미지는 QAF 값의 분포를 시각화하는 데 사용할 수 있지만 추가 분석에 사용해서는 안 되는 색상으로 구분된 QAF 이미지를 보여줍니다. (B) 전경의 QAF 이미지와 배경의 SD-OCT 스캔의 적외선 이미지가 표시됩니다. 이것은 선박 분기를 사용하여 정렬을 시각화해야 합니다. 이 작업은 Register_OCT_2 플러그인을 사용하여 수행할 수 있습니다. (C) 병변의 z-점수 값을 측정하는 데 사용되는 표준 망막. StandardRetina/BatchStandardRetina를 사용하여 StandardRetinas를 만들 수 있습니다. (D) 노란색 선으로 강조 표시된 SDD를 가리키는 파란색 화살표가 있는 BScan이 표시됩니다(참고: 병변은 z 방향의 위치에 관계없이 항상 RPE 아래에 표시됨). (E) 표시된 모든 병변이 QAF 이미지에 각인되어 있는 것을 볼 수 있습니다(그림 1 참조). 마지막 두 단계는 Mark_BScans_OCT 플러그인을 사용하여 수행됩니다. 약어: AF = 자가형광; QAF = 정량적 자가형광; SDD = 망막하 드루세노이드 침착물; IR = 적외선; RPE = 망막 색소 상피; SD-OCT = 스펙트럼 도메인 광간섭 단층 촬영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 워크플로우는 오픈 소스 FIJI 플러그인 도구를 사용하여 AMD 특정 병변의 AF를 결정하고 비교하는 단계별 가이드를 제공합니다. 플러그인은 코딩 지식이 필요하지 않고 기술 지원 없이 의사가 적용할 수 있는 사용하기 쉬운 템플릿을 제공합니다27. 우리가 아는 한, 이러한 도구는 병변별 AF 정량화를 위한 종류 중 하나입니다.
QAF 값은 자연적으로 망막에 따라 다르며, 망막 내 리포푸신과 멜라놀리포푸신 분포가 고르지 않고, 혈관의 AF가 낮고, 황반 색소 분포가 고르지 않기 때문에 망막의 주변부에서 값이 높고 황반에서 낮습니다. 망막에서 자연적으로 발생하는 QAF 수준의 변동이 크기 때문에 병변의 절대 QAF 값을 직접 분석하는 것은 유망한 접근 방식이 아닙니다. 예를 들어, 말초의 저자가형광 병변은 황반의 생리학적 형광 수준보다 여전히 더 높은 절대 QAF 값을 가질 수 있습니다. StandardRetina를 사용하고 z-점수를 사용하여 드루젠의 형광 수준을 측정하면 자연적으로 발생하는 QAF 값의 분산을 정확하게 측정할 수 있습니다.
z-점수는 관심 영역 값과 StandardRetina의 평균과의 관계를 수치로 측정한 것입니다. 동일한 위치에 있는 StandardRetina의 평균에서 개인의 평균을 뺀 다음 결과를 표준 편차로 나누어 계산합니다. 이 표준화를 통해 z-점수는 값이 평균과 얼마나 다른지 표준 편차 수를 나타내기 때문에 서로 다른 QAF 이미지를 비교할 수 있습니다. 양수 z-점수는 값이 평균보다 높음을 나타내고 음수 z-점수는 평균보다 낮음을 나타냅니다.
고려해야 할 잠재적인 함정이 있을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 방법은 안저 전체에 걸쳐 다양한 양의 AF 레벨을 설명하지만 여전히 RPE의 AF를 측정하고 비교하는 가장 정확한 방법은 아닐 수 있습니다. 개인마다 황체 황체 색소의 수준과 지형이 다르며, 병변은 망막 위에 놓인 망막의 반투명도에도 영향을 미칠 수 있다28,29. 따라서 SDD 영역에서 측정된 감소된 AF는 RPE(30,31,32)에서 감소된 형광단이 아니라 섀도잉 효과의 결과라는 것이 타당하다.
우리는 현재 선형 혼합 모델에서 망막 반사율, 두께 및 정량화된 황반 색소(녹색 및 청색 AF 사용)를 설명하기 위한 워크플로우를 연구하고 있습니다. 또한 지금까지 QAF는33세의 유사한 참가자의 렌티큘러 혼탁에서 개인 간 차이를 무시하는 렌티큘러 혼탁을 설명하기 위해 연령 의존적 보정 인자를 사용합니다. 따라서 우리는 현재 렌티큘러 자가형광 및 불투명화의 개인화된 보정 인자를 위한 워크플로우를 연구하고 있습니다. 작은 병변에서 AF 정보를 안정적으로 추출하려면 QAF 이미지의 적절한 테스트-재테스트 신뢰성이 필요합니다. 보다 자세한 분석이 가능한 QAF 이미지를 더욱 차별화하기 위해 QAF 이미지의 테스트-재테스트 신뢰도를 예측할 수 있는 "QAF 이미지 신뢰도 지수"를 조사하고 있습니다. 현재 단계에서 신중한 접근 방식은 중복 이미지를 획득하고 병변 특이적 AF의 재검사 신뢰성을 조사하는 것입니다.
병변의 동선체를 추가로 분석하는 제시된 방법은 인접 병변의 동선체가 합쳐지기 때문에 기술적으로 구현하기 어려웠습니다. 병합된 등선체의 영역은 어떤 병변을 고려하느냐에 따라 뚜렷하게 특성화될 수 있습니다. 우리의 해결책은 한 가지 유형의 모든 병변을 하나의 병변으로 간주하고 그 주변을 관절 등선체로 분석하는 것이었습니다. 그러나 이 방법은 개별 드루젠의 등선체를 측정하는 능력을 크게 감소시키며 이 기술의 또 다른 함정으로 간주될 수 있습니다. 병합된 등선체 또는 병합된 등선체 영역에서 AF의 일시 중단된 보고를 설명하기 위한 보다 기술적으로 정교한 방법은 향후 병변 둘레에서 AF 분석을 용이하게 할 수 있습니다.
이 연구에서는 AMD를 모델 질병으로 사용했습니다. 워크플로우는 다른 질병의 병변을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 지금까지 QAF는 열성 스타가르트병, 베스트로핀-1 관련 질환, 다양한 형태의 색소성 망막염, 급성 구역 잠복 외망막병증, 가성 황색종 탄성체 등을 포함한 많은 융모막 질환에 사용되었습니다 17,33,34,35,36,37. 이 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하기 때문에 다른 사람들도 병변 특이적 심방세동을 결정하는 데 이 작업을 복제하고 망막 질환에 대한 지식을 확장하도록 권장합니다. 요약하면, 황반 전체에 걸쳐 다양한 망막 병변의 AF 수준을 결정하고 비교하는 워크플로우를 제시합니다. 이 워크플로우는 심방세동에 대한 보다 심층적인 분석을 위한 길을 열어주며 AMD 및 그 이상의 분야에서 새로운 바이오마커의 개발을 촉진할 수 있습니다.
Disclosures
Leon von der Emde는 Heidelberg Engineering으로부터 지불을 받았다고 보고합니다. Merten Mallwitz는 재무 공개를 보고하지 않습니다. 케네스 R. 슬론(Kenneth R. Sloan)은 또한 재무 공개를 보고하지 않습니다. Frank G. Holz는 Acucela, Alcon (C), Gyroscope Allergan Apellis, Bayer Bioeq/Formycon, CenterVue, Roche/Genentech, Geuder, Ivericbio, NightStarX, Novartis, Optos, Oxurion, Pixium Vision, Stealth BioTherapeutics, Zeiss 및 GRADE Reading center에 대한 컨설팅/개인 지불을 보고합니다. Thomas Ach는 Bayer, Apellis, Roche 및 Novartis에 대한 컨설팅/개인 지불을 보고합니다.
Acknowledgments
이 연구는 박사 과정 학생(MW)을 위한 독일 안과학회(DOG) 보조금과 NIH/NEI 1R01EY027948(TA)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BatchStandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| FIJI (Image J) | n.a. | n.a. | n.a. |
| Mark_Bscans_OCT plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Microspft office | Microsoft | n.a. | n.a. |
| QAF_xml_reader plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Register_OCT_2 plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Spectralis | Heidelberg Engineering | n.a. | QAF extension |
| StandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
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