Summary
Denne undersøkelsen beskriver en arbeidsflyt for å bestemme og sammenligne autofluorescensnivåer fra individuelle interesseområder (f.eks. Drusen og subretinale drusenoidavsetninger i aldersrelatert makuladegenerasjon [AMD]) mens de regner med varierende autofluorescensnivåer gjennom fundus.
Abstract
Fundus autofluorescens (FAF) avbildning tillater ikke-invasiv kartlegging av inneboende fluoroforer av den okulære fundus, spesielt retinalpigmentepitelet (RPE), nå kvantifiserbar med bruk av konfokal skanning laser oftalmoskopibasert kvantitativ autofluorescens (QAF). QAF har vist seg å være generelt redusert ved bakre pol ved aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Forholdet mellom QAF og ulike AMD-lesjoner (drusen, subretinale drusenoidavleiringer) er fortsatt uklart.
Dette dokumentet beskriver en arbeidsflyt for å bestemme lesjonsspesifikk QAF i AMD. En multimodal in vivo bildebehandlingstilnærming brukes, inkludert, men ikke begrenset til, spektraldomene, optisk koherenstomografi (SD-OCT), makulært volumskanning og QAF. Ved hjelp av tilpassede FIJI-plugin-moduler justeres det tilsvarende QAF-bildet med det nær-infrarøde bildet fra SD-OCT-skanningen (karakteristiske landemerker, dvs. fartøybifurkasjoner). Foveola og kanten av synsnervehodet er markert på OCT-bildene (og overført til det registrerte QAF-bildet) for nøyaktig posisjonering av analysegitterene.
AMD-spesifikke lesjoner kan deretter merkes på individuelle OCT BScans eller selve QAF-bildet. Normative QAF-kart er laget for å ta hensyn til det varierende gjennomsnittet og standardavviket til QAF-verdier gjennom hele fundus (QAF-bilder fra en representativ AMD-gruppe ble gjennomsnittet for å bygge normative standard retinal QAF AMD-kart). Plugin-modulene registrerer X- og Y-koordinater, z-poengsum (et numerisk mål som beskriver QAF-verdien i forhold til gjennomsnittet av AF-tilordninger i form av standardavvik fra gjennomsnittet), gjennomsnittlig intensitetsverdi, standardavvik og antall merkede bildepunkter. Verktøyene bestemmer også z-skår fra randsonen av markerte lesjoner. Denne arbeidsflyten og analyseverktøyene vil forbedre forståelsen av patofysiologien og klinisk AF-bildetolkning i AMD.
Introduction
Fundus autofluorescens (FAF)-avbildning gir en ikke-invasiv kartlegging av naturlig og patologisk forekommende fluoroforer av okulær fundus1. Den vanligste blå (488 nm eksitasjon) autofluorescens (AF) eksiterer lipofuscin og melanolipofuscingranulat i retinalpigmentepitelet (RPE)2,3,4. Fordelingen og økningen/reduksjonen av granulat spiller en sentral rolle ved normal aldring og ulike netthinnesykdommer, inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)5.
En videreutvikling av FAF, kvantitativ fundus autofluorescens (QAF), tillater nå nøyaktig bestemmelse av topografisk oppløste retinale AF-intensiteter 4,6. Ved å innlemme en referanse i den optiske banen til FAF-bildeenheten, kan AF-intensiteter sammenlignes mellom enheter, tidspunkter og. Denne teknikken har resultert i et paradigmeskifte med hensyn til en antatt patogenetisk faktor i AMD, som lenge ble spekulert i å skyldes overdreven lipofuscinakkumulering i RPE-celler7. Histologisk og klinisk kvantifisering av AF har imidlertid vist en reduksjon i AF i AMD (på grunn av omfordeling og tap av autofluorescin lipofuscin og melanolipofuscingranulat), i stedet for den foreslåtte økningen i AF 8,9,10.
Overvåking av atrieflimmer har kliniske implikasjoner. Von der Emde et al. og andre har vist at AF ikke bare reduseres, men også ytterligere reduseres i løpet av AMD i høyrisiko, mellomliggende AMD-øyne 8,9. I tillegg tyder histologiske studier på at de fleste AMD-berørte RPE-celler viser en karakteristisk oppførsel med granulataggregering og ekstrudering før RPE-celletap via subduksjon, sloughing, migrasjon eller atrofi13,14,15,16. Dette indikerer videre at AF-tap kan være en utløser eller et surrogatsignal om forestående sykdomsprogresjon.
QAF-studier har så langt bare evaluert AF globalt ved de bakre polene ved hjelp av prefabrikkerte polarkoordinatsystemer (f.eks. QAF8/Delori Grid)17. Bruk av prefabrikkerte rutenett for å måle AF resulterer i flere AF-verdier på forhåndsbestemte områder per øye for et emne. Undersøkelse av AF-verdier på denne måten kan gå glipp av lokale endringer i områder med patologisk endret AF, for eksempel i AMD på toppen av eller nær drusen eller subretinale drusenoidavleiringer (SDD). Drusen, og i høyere grad SDD, er forbundet med høy risiko for å utvikle sen AMD og synstap. Drusen spesielt har en typisk syklus av økende i størrelse over mange år og kan forverres raskt før atrofi. Det kan tenkes at for eksempel global atrieflimmer reduseres ved AMD, men øker eller reduseres ytterligere i og rundt disse spesifikke sykdomsrelaterte fokale lesjonene.
Ulike lokale AF-mønstre kan også ha prognostisk relevans for sykdomsprogresjon. For eksempel kan autofluorescens nivåer brukes til å vurdere om drusen øker i størrelse eller er allerede i regresjon til atrofi. Det er allerede vist at endrede AF-perilesjonsmønstre ved geografisk atrofi i stor grad påvirker atrofiprogresjonen over tid18. I tillegg kan lokale autofluorescensmønstre avsløre ytterligere detaljer om helsen til RPE. Ofte viser den optiske koherenstomografien (OCT) hyperrefleksjon i choriocapillaris, selv om RPE-laget virker intakt. En multimodal tilnærming som kombinerer lokale QAF-verdier og OCT kan bidra til å skille lesjoner med høy risiko for RPE-forstyrrelser og forestående atrofi.
En grunn til at romlig oppløste analyser i studier ikke er utført, er at den mest brukte produsentens programvare ikke gir et verktøy for denne typen analyser. AF-egenskaper av forskjellige lesjoner avhengig av AMD-sykdomsstadiet kan ytterligere forklare patogenesen av AMD. Det vil derfor være ønskelig med et verktøy for å måle regional, lesjonsspesifikk atrieflimmer. For nøyaktig å sammenligne lesjoner som er lokalisert i hele netthinnen, trenger arbeidsflyten en måte å redegjøre for varierende grad av AF i human fundus19. Mest sentralt er AF karakteristisk lavere på grunn av skyggeeffektene av makulært pigment og forskjellige granulattall20,21.
AF når sitt høydepunkt ved ~9° (avstand til fovea i alle retninger) og avtar i større grad perifert4. Hvis man skulle sammenligne absolutte verdier av AF-nivåer fra bløt drusen (lokalisert ved fovea og parafovea i områder med lav AF) og SDD (plassert parasentralt i områder med høy AF), ville resultatene derfor ikke være sammenlignbare22. Inspirert av arbeidet til Pfau et al. og begrepet følsomhetstap (korrigering av følsomhet målt i AMD for synsfeltet [fallende retinal følsomhet med avstand til fovea] av friske kontroller) for funduskontrollert perimetri, sammenlignes AF med standardiserte AF-verdier gjennom makula23,24. Resultatene rapporteres som z-skår (numerisk måling av et område med interesseverdiens forhold til gjennomsnittet).
Hensikten med denne studien er å evaluere bruken av et nytt verktøy for å måle lokale QAF-nivåer i ulike typer lesjoner hos pasienter med AMD. Dette verktøyet er designet for å måle autofluorescensnivåer av lesjoner identifisert på OCT-skanninger. Dette muliggjør vurdering av lokale autofluorescensnivåer i lesjoner, som myk drusen eller SDD, og muliggjør sporing av AF-endringer fra lesjoner over tid. Den potensielle nytten av dette verktøyet er å aktivere en ny strukturell biomarkør som estimerer helsen til RPE og kan ha prognostisk verdi for de undersøkte lesjonene.
Protocol
Studien ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og godkjent av etikkomiteen ved Universitetet i Bonn (protokollkode 305/21). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene som var involvert i studien. Vi krevde at alle deltakerne i videoen signerte klareringsskjemaer som ga oss tillatelse til å bruke deres likhet og personlige informasjon i opprettingen av en online video.
1. Kvantitativ autofluorescens (QAF) bildeoppkjøp
- For nøyaktig bildeopptak med QAF-enheten, sørg for at deltakeren sitter komfortabelt foran enheten. La deltakeren presse haken og pannen mot haken og nakkestøtten. Juster høyden på hakestøtten til den laterale øyelokkvinkelen er i samme høyde som den røde markeringen.
- Forsikre deg om at bildet er fokusert i nær-infrarød modus ved å rotere hjulet på opptaksenheten til de små fartøyene er i fokus. Zoom inn på øyet ved å flytte kameraet fremover til hjørnene av bildet er jevnt opplyst. Som en tommelfingerregel, juster fokus til den sfæriske ekvivalenten. Reduser fokuset før QAF-avbildning med én eller to dioptre, siden blå QAF bruker kortere bølgelengde, og bytt modusen til QAF-enheten fra nær-infrarød til QAF-modus.
- Juster og oppskaler belysningen og finjuster fokuset i bildet til de små beholderne nærmest fovea er i fokus og bildet er sterkt opplyst uten røde prikker (indikerer overbelysning). Blek fotopigmentet ved å vente minst 30 s i QAF-modus før bildeopptak for å tillate fortsatt eksitasjon av blått lys å bleke fotoreseptorpigmentet i synsfeltet til kamerainnstillingene.
- For å ta bilder, trykk på bildeopptak på berøringsplaten på bildeenheten; sørg for å ta mer enn ett QAF-bilde i tilfelle blunking eller plutselige øyebevegelser under oppkjøpet.
MERK: Arbeidsflyten krever også SD-OCT-bilder (Spectral Domain Optical Coherence Tomography). OCT bildeopptak er forklart andre steder, da det er mye brukt i klinisk praksis25.
2. Eksport av bilder
- For denne analysepipelinen kontrollerer du at QAF- og OCT-bildene er i filformatet Extensible Markup Language (XML). I HEYEX viewer, høyreklikk på et ønsket QAF / OCT-bilde og velg Eksporter | som XML fra rullegardinmenyen.
3. Plugin-moduler med åpen kildekode for QAF-analyse – installering av pipelinen
MERK: Den presenterte QAF-programvaren er en plugin-modul med åpen kildekode kalt "Spectralis pipeline" opprettet for åpen kildekode-programvaren ImageJ (FIJI-utvidelse)26.
- For å få tilgang til plugin-modulen, åpne FIJI, velg Hjelp og deretter Oppdater fra rullegardinmenyen, og klikk deretter på Administrer oppdateringssider for å legge til Creative Computation Update Site "https://sites.imagej.net/CreativeComputation/" til de eksisterende oppdateringssidene.
- Last ned plugin-modulene og start deretter FIJI på nytt. Nå er Spectralis Pipeline installert. De forskjellige Spectralis plug-ins finner du under rullegardinmenyen Plugins | Spectralis eller plugins | SpectralisBatch.
4. Oppsett - datalagring
MERK: Hvis du vil tillate en sømløs arbeidsflyt, anbefales det å konfigurere mappestrukturen på følgende måte. Sett først opp en mappe for hvert studieemne. Oculus dexter (OD) og oculus sinister (OS) refererer til henholdsvis høyre og venstre øye, og disse forkortelsene brukes i hele denne arbeidsflyten.
- For hvert undersøkte øye for hvert studieemne, sett opp en mappe for en OCT, kalt henholdsvis OD_OCT og OS_OCT. La Spectralis-rørledningen automatisk lagre utdataene fra "_BScans_OCT"-plugin-modulen som tabulatorseparerte verdier i disse mappene.
- For QAF-bildene oppretter du to mapper med navnet OD_QAF og OS_QAF.
- Opprett flere mapper hvis andre multimodale bildemodaliteter brukes. Kontroller at den resulterende mappestrukturen ligner strukturen som er oppført nedenfor:
CASE_ID
OD_OCT
OD_QAF
OD_other_imaging_modality
OS_OCT
OS_QAF
OS_other_imaging_modality
5. Konvertering av QAF XML-filen til et QAF-bilde (plugin-modul brukt: QAF_xml_reader)
- Spectralis QAF XML-eksportfilene lagres i rød-grønn-blått (RGB)-format, begrenset til en skala fra 0 til 255 (som representerer målte AF-verdier) og inkluderer kalibreringsområder for standard og svart. Plugin-modulen "QAF_xml_reader" produserer et QAF-bilde. For dette, åpne rullegardinmenyen for plugin-moduler , velg Spectralis | QAF_XML_Reader, og forkast åpningsskjermen.
- Et nytt vindu vises med ledeteksten Velg en katalog som inneholder en Spectralis XML QAF Export:. Velg katalogen og klikk Velg.
- Angi referansekalibreringsfaktoren (RCF) til QAF-enheten (inkludert i bildeinformasjonen til QAF-bildet) og pasientens alder på tidspunktet bildet ble tatt.
- Det neste vinduet heter QAF Parameters. Hvis pasienten er pseudofakisk ved bildeopptak, velg alder 20 i stedet (dette har effekten av å ikke bruke alderskorreksjon). Når et popup-vindu merket Kart til 8bit vises, angir du minimum QAF-verdi (qafMin) og maksimumsverdi for QAF (qafMax) for et fargekodet QAF-bilde. Hvis qafMin og qafMax er ukjente, bruk standardinnstillingene, klikk OK, og observer det opprinnelige bildet merket Raw QAF Data som vises, samt 32-biters QAF og 8-biters fargekodet QAF-bilde.
MERK: Det fargekodede QAF-bildet brukes kun til illustrasjonsformål. 32-biters QAF-bilde med faktiske QAF-verdier brukes til videre analyse.
6. Registrere QAF-bilder med OCT-bildet (plug-in brukt: Register_OCT_2)
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å justere OCT-bildet nøyaktig med QAF-bildet, slik at lesjoner i QAF-bildene og OCT BScans er justert.
- Få tilgang til plugin-modulen via rullegardinmenyen Plugins | Spectralis, eller opprett en hurtigtast for å få tilgang til de forskjellige plugin-modulene som brukes. For å oppnå dette, velg Register_OCT_2 under Plugins | Snarveier | Legg til snarvei og velg ønsket hurtigtast.
- Etter å ha åpnet plugin-modulen, klikker du OK i det første vinduet som vises. Deretter vises et vindu som inneholder ledeteksten: Velg en katalog som inneholder Spectralis OCT XML-eksport: i hovedvinduet ImageJ. Velg mappen som inneholder Spectralis OCT XML Export og klikk på Åpne.
MERK: OCT lastes nå inn, noe som kan ta opptil 2 minutter avhengig av prosessorkraften til datamaskinen som brukes. - Deretter venter du på at et vindu som inneholder ledeteksten Lagre registrerte bilder til: dukker opp. Velg katalogen der EnFaceStack (justert bildefil) skal lagres, og klikk Åpne.
- Vent til et popup-vindu som inneholder ledeteksten Velg et bilde du vil legge til i EnFaceStack: for å vises, velg 32bit QAF-bildet for å justere bildet med SD-OCT, og klikk på Åpne. Hvis alle nødvendige bilder i denne EnFaceStack er inkludert, velger du Avbryt.
- Når neste vindu ber brukeren velge en etikett for EnFaceStack, velg den forhåndslagde QAF-etiketten ; alternativt kan du skrive inn ønsket navn på modaliteten i Annet-boksen. Velg OK for å registrere bildet.
MERK: Ikke inkluder mellomrom eller annen tegnsetting i Annet-feltet . - Legg merke til de tre vinduene som dukker opp. Den første er merket Localizer og viser SD-OCT som et venstre øye (OS) bilde. Det andre vinduet heter QAF eller en av de andre modalitetene som er valgt tidligere som det opprinnelige venstre (OS) eller høyre (OD) øyet. Det siste vinduet kalles landemerker, som ber om å velge ett til tre landemerker i hvert bilde.
- Juster de to bildene ved å velge ett til tre landemerker per bildefartøy, bifurkasjoner eller andre egenskaper som ligger på begge modaliteter. Zoom inn (bruk tastaturtegnet " +" for å zoome inn og " -" for å zoome ut) før du velger landemerket. Kontroller at de valgte landemerkene er spredt ut både loddrett og vannrett i bildet. Når alle landemerkene er annotert, velger du OK på Landemerker-fanen og Avbryt i neste ledetekst.
- Når et vindu spør Vil du se resultatene vises, velger du Ja for å kontrollere om bildet er riktig justert. Gjør dette ved å zoome inn på et lite fartøy og plassere markøren ved siden av det, og rull deretter opp eller ned for å sjekke hvor mye fartøyet beveger seg i forhold til markøren. Hvis justeringen ikke er nøyaktig, sletter du ".tiff"-filen i OD_QAF-mappen og starter prosessen på nytt fra starten av trinn 2.
MERK: Siden markeringene på Mark_BScans_OCT må være presise, må justeringen mellom SD-OCT og QAF-bildet også være veldig nøyaktig. Pikselperfekt justering kan oppnås på de fleste bilder, selv om justeringen i noen tilfeller er begrenset til en nøyaktighet på tre eller fire piksler.
7. Opprette et gjennomsnittlig QAF-bilde for sammenligning (plugin-modul brukt: StandardRetina/BatchStandardRetina)
MERK: QAF-verdier er sterkt avhengig av retinalplasseringen (f.eks. Sentral skyggelegging forårsaket av makulært pigment). Derfor bør QAF-verdiene til drusen sammenlignes med standard QAF-verdier for samme region. Som en forutsetning for analyse oppretter StandardRetina et enface-kart over gjennomsnittlige QAF-bilder (for eksempel fra en alderstilpasset kontrollkohort). Det resulterende grensesnittet viser et piksel-for-piksel-kart med en gjennomsnittlig QAF-verdi for den sentrale netthinnen.
- Det er to måter å lage standard netthinner i Spectralis-rørledningen: den første, AddToStandardRetina_OCT, tillater en ny sak om gangen til enface-kartet, mens den andre, BatchStandardRetina, legger til flere tilfeller samtidig.
- Hvis du vil legge til ett bilde om gangen, velger du Pluginmoduler | Spektralis | AddToStandardRetina_OCT og avvise åpningsskjermen. Når et vindu dukker opp som viser teksten Velg en katalog som inneholder en Spectralis OCT XML-eksport, velg mappen og klikk Velg for å åpne BScan.
- Når et nytt vindu vises med ledeteksten Velg en katalog som inneholder registrerte EnFace-bilder:, velg riktig mappe og klikk Velg.
- Vær oppmerksom på de tre vinduene som dukker opp, en merket EnFaceStack som viser de stablede bildene fra mappen som er valgt i det andre trinnet, den andre merket Bscan Stack som viser OCT BScan, og et tredje vindu som vises i midten merket Velg modalitet. Velg en modalitet fra EnFaceStack.
- Velg en modalitet og følg det nye vinduet som dukker opp med ledeteksten Velg en katalog som inneholder StandardRetina. Hvis en katalog som inneholder en StandardRetina ikke allerede finnes, velger du en tom mappe for å opprette en ny StandardRetina.
- Undersøk den nye StandardRetina, bla opp og ned, og flytt markøren for å vise gjennomsnittet og standardavviket for det bestemte stedet. Klikk på knappen Godta? For å enten legge til det nyeste bildet til StandardRetina eller forkaste det.
- Hvis du vil legge til flere bilder samtidig, bruker du Batch_QAF_StandardRetina.
- Forbered først en "manifest.txt" -fil i samme mappe som saks-IDene og sørg for at den viser den relative banen fra plasseringen av .txt-filen til OCT og EnFaceStack. Skill de to med et tabulatormellomrom og sørg for at det ikke er ekstra mellomrom foran og bak navnene. Filen skal ligne på dette oppsettet:
pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OKT>001/OD-QAF
pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OKT>002/OD-QAF - Opprett filen i regnearkprogramvare og lagre den som en txt-fil. Kontroller at alle banene inneholder stykket (bokstavene) QAF for at manifestfilen skal fungere skikkelig. Plugin-modulene ligger under rullegardinmenyen Plugins | SpectralisBatch-batch | QAF_StandardRetina.
- Lukk åpningsskjermen og vent til et nytt vindu åpnes som viser ledeteksten Velg den første Standard Retina. Velg enten en mappe med en allerede eksisterende StandardRetina eller velg en tom mappe for å opprette en ny StandardRetina.
- Se etter en melding merket Velg Modalitet skal vises; standard er QAF. Forsikre deg om at filnavnet til den respektive modaliteten samsvarer nøyaktig med filnavnet for et stykke i hver EnFaceStack som er navngitt i manifestfilen. Deretter, når et vindu åpnes og ber brukeren om å velge en manifestfil (beskrevet tidligere), klikker du Avbryt hvis ingen annen manifestfil skal legges til denne StandardRetina , eller velger en annen manifestfil. Undersøk den nye StandardRetina i et nytt vindu merket Godta?, og bestem om du vil legge til den nyeste batchen i StandardRetina eller forkaste den nyeste batchen.
MERK: Prosessen med å kombinere alle QAFs til en StandardRetina kan ta en stund.
- Forbered først en "manifest.txt" -fil i samme mappe som saks-IDene og sørg for at den viser den relative banen fra plasseringen av .txt-filen til OCT og EnFaceStack. Skill de to med et tabulatormellomrom og sørg for at det ikke er ekstra mellomrom foran og bak navnene. Filen skal ligne på dette oppsettet:
8. Annotere områder av interesse for analyse (plug-in brukt:_BScans_OCT)
- For å markere lesjoner (for eksempel drusen), åpne plugins | Spektralis | _BScans_OCT og avvis åpningsledeteksten. Se etter et nytt vindu merket Velg en katalog som inneholder en Spectralis OCT XML-eksport som skal vises. Velg mappen som har ønsket OCT og klikk OK.
- Etter at FIJI har lastet OCT, observer det nye vinduet med etiketten Velg en katalog som inneholder registrerte ansiktsbilder som skal vises. Velg katalogen som inneholder EnFaceStack og klikk Velg.
- Tre nye vinduer vises nå, en merket EnFaceStack, en merket BscanStack og en kalt brukerparametere.
- Vinduet Brukerparametere ber brukeren om å angi følgende parametere: Saks-ID, som da vises i navnet på utdata-csv-filen, båndbredde i mm, enface-linjebredden, BScan-linjebredden og regionmaskeopasiteten.
- Parameterbåndbredden i mm bestemmer bredden på hvert iso-skrog i millimeter (mm). Bruk Enface-linjebredde for å endre linjebredden til merkede lesjoner i vinduet merket EnFaceStack.
- BScan-linjebredden bestemmer linjebredden i vinduet Bscan Stack. Merk at å sette denne parameteren til 1 er den beste linjebreddeinnstillingen for de fleste tilfeller.
- Velg mellom en ansiktsmaske eller et avstandskart som vises i et eget vindu for å bestemme om innvendige bånd skal farges inn. Etterpå klikker du på ferdig i vinduet Merk i BScan i plugin-modulen.
- Deretter, når du blir bedt om å velge en allerede eksisterende StandardRetina, velger du mappen som inneholder StandardRetina og klikker Velg. Merk at hvis en StandardRetina velges, vil utgangen _BScans_OCT velge modus z-skår (for en målt QAF-verdi sammenlignet med StandardRetina). Hvis den rå QAF-verdien foretrekkes, klikker du på Avbryt og venter på et nytt vindu merket Melding som advarer om at resultatene vil være råverdier, ikke z-poengsummer.
- Vinduet Brukerparametere ber brukeren om å angi følgende parametere: Saks-ID, som da vises i navnet på utdata-csv-filen, båndbredde i mm, enface-linjebredden, BScan-linjebredden og regionmaskeopasiteten.
- Se etter et nytt vindu for å spørre Velg en katalog som inneholder den lagrede tilstanden med de lagrede dataene. Hvis det finnes en lagringsfil, klikker du på katalogen som inneholder stykkene | Velg. Hvis fremdriften ikke skal lagres, velger du avbryt. Se etter et nytt vindu merket Merk i BScan, og ut av en rullegardinmeny velger du lagre, ignorere, ferdig og merke.
- Markere: Begynn å kommentere interesseområdene i BScan, med lignende kommandoer som i "Register_OCT_2" -plugin-modulen forklart ovenfor. For å markere et område, velg start ved å høyreklikke og dra musepekeren til slutten av lesjonen, sørg for at merke er valgt i vinduet Merk i B-skanning , og klikk OK. Interesseområdet er nå markert i denne BScan.
- Ignorere: Velg Ignorer i vinduet Merk i BScan og klikk på OK for å ignorere merkingen.
- Lagre: Velg lagre i vinduet Merk i BScan og klikk OK for å få et nytt vindu til å vises, som inneholder ledeteksten velg en katalog for å lagre tilstand. Velg en allerede eksisterende mappe eller opprett en ny. Åpne allerede eksisterende filer ved å starte "_BScans_OCT" og velg katalogen som inneholder lagringstilstanden når vinduet Velg en katalog som inneholder den lagrede tilstanden vises.
MERK: Flere lagringstilstander kan ikke lagres i én katalog. lagre stater fra en nasjonal innstilling til en annen kan ikke enkelt byttes (f.eks. TYSK til USA). - Gjort: Velg ferdig i vinduet Merk i BScan og klikk på OK for å lage et nytt vindu med etiketten velg modalitet vises.
- Når en ledetekst merket bring the correct modality on top of the enface stack vises, ta med modaliteten kalt QAF øverst, som ble justert ved hjelp av "Register_OCT_2". Gjør dette enten ved å bla gjennom EnFaceStack, velge En face Stack-vinduet eller klikke på venstre eller høyre pil. Merk at navnet på modaliteten vises øverst til venstre.
- For bedre å inspisere og merke lesjonene, zoom inn i Bscan-vinduet. Klikk på B-Scan-vinduet , pek musen i retning for å zoome inn, og trykk på + -tasten; Hvis du vil zoome ut, trykker du på --tasten.
- Bla gjennom BScan-stakken ved å bla opp eller ned på musen, dra linjen nederst til venstre eller høyre for å gå gjennom skanningen, eller ved å velge B-Scan-rammen og klikke på venstre og høyre piltast på tastaturet. Merk at en oversikt over gjeldende område i BScan-stakken er gitt av den røde linjen i EnFaceStack-vinduet, og øverst til venstre i BScan-vinduet der BScan-nummeret (f.eks. 31/120) vises.
- Klikk på OK for å opprette en ny .tsv-fil i den tilsvarende "OD_OCT" eller "OS_OCT" -mappen. Vær oppmerksom på at TSV-filnavnet vil bestå av "_Bscans_OCT" pluss saks-IDen som ble angitt, lateraliteten og modaliteten som ble valgt i det siste trinnet i_Bscans_OCT. I tillegg vil fargekodede "iso-skrog" av drusen nå vises i EnFaceStack.
Representative Results
Vise utdataene
For å tilstrekkelig analysere og trekke konklusjoner fra resultatene, er det viktig å forstå utdatafilen til_Bscans_OCT. De tre første kolonnene er merket etter saks-IDen, filens lateralitet og avbildningsmodaliteten som ble valgt. Den fjerde kolonnen refereres til etter modus og er merket z-score. Merk at når du skriver denne teksten, kan BScans bare beregne alle lesjoner på en gang; Radene refererer til iso-skrog, hvis avstander fra ytre kanten av lesjonen er spesifisert i regnearkets nedre og øvre kolonner. Iso-skrog måler AF i z-score (ved QAF) i en spesifisert omkrets rundt lesjonen. Vær oppmerksom på at minimumsverdien for et bildepunkt i et iso-skrog finnes i kolonnene merket min, kolonnene merket median, maks, gjennomsnitt og stdev, inneholder henholdsvis median, maksimum, gjennomsnitt og standardavvik for gjennomsnittet av bildepunktverdiene i etiso-skrog. Kolonnen n inneholder totalt antall piksler i et iso-skrog. Figur 1 viser en entydig markert bløt drusen hos en 84 år gammel mannlig pasient med middels aldersrelatert makuladegenerasjon (iAMD).
Figur 2 viser venstre øye hos en representativ pasient med SDD-er merket med QAF-Workflow-verktøyet (figur 3). SDD hos denne pasienten var assosiert med redusert atrieflimmer (z-skår = -0,4 ± 0,2). På samme måte viste iso-skrogene rundt SDD redusert AF (f.eks. nærmeste iso-skrog = -0,3 ± 0,3) sammenlignet med StandardRetina. En plausibel forklaring på dette fenomenet kan være skyggeeffekter (redusert gjennomskinnelighet) av SDD-lesjoner på RPE. Bruken av SDD var eksemplarisk. Verktøyet gjør det mulig å vurdere lokale AF-nivåer i andre lesjoner, for eksempel drusen, også. Videre gjør verktøyet det mulig å spore AF-endringer fra lesjoner over tid.
Figur 1 Entydig markert bløt drusen av en 84 år gammel mannlig pasient med intermediær aldersrelatert makuladegenerasjon (iAMD). (A) QAF-bildet av et venstre øye med merket drusen. (B) Nærbilde av drusen: brunt senter som representerer de merkede drusen og fargede båndene som representerer de omkringliggende iso-skrogene. Tabellen nedenfor viser utdatafilen. QAF drusen verdier sammenlignes med tilsvarende QAF verdier av tilsvarende eksentrisitet fra StandardRetina. Dette resulterer i z-skår som representerer avvik fra gjennomsnittet av upåvirkede områder. Den blå boksen viser fra venstre til høyre: kasus-ID, øyets lateralitet, modalitet som brukes, og ønsket utgang (i dette tilfellet z-score). Kolonner i den oransje boksen viser grensene for det målte området i millimeter (nedre = nedre grense, øvre = øvre grense). Den grønne boksen merker kolonnene som viser QAF-målingene. Fra venstre mot høyre inneholder disse minimum, median, maksimum, antall piksler, gjennomsnitt og standardavvik for gjennomsnittet. Hver rad representerer et iso-skrog, rader i den blå boksen representerer verdier i lesjonen, og rader i den lilla boksen viser iso-skrogene rundt hver lesjon (fra topp til bunn med økende avstand til lesjonen). Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Markerte SDD-er i et QAF-bilde av en 80 år gammel kvinnelig pasient med tidlig AMD. (A) SDD-er kan sees på QAF-bildet. Det samme QAF-bildet vises med påtrykte merknader til SDD-er. (B) Rundt hver markert lesjon er iso-skrogene avbildet med fargekoding (lysegrønn, mørkegrønn og rød). (C) En forstørret versjon av det blå rektangelet. Den ytre kanten av hver SDD er merket med blått. Forkortelser: QAF = kvantitativ autofluorescens; AMD = aldersrelatert makuladegenerasjon; SDD = subretinal drusenoid innskudd. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Arbeidsflyt for å bestemme atrieflimmer for lesjoner. Denne illustrasjonen visualiserer programvaretilleggene som trengs for å bestemme lesjonsspesifikk AF. (A) Bildet viser et fargekodet QAF-bilde som kan brukes til å visualisere fordelingen av QAF-verdier, men som ikke skal brukes til videre analyse. (B) Et QAF-bilde i forgrunnen, med det infrarøde bildet fra SD-OCT-skanningen i bakgrunnen, vises. Dette skal visualisere justeringen ved hjelp av fartøybifurkasjoner. Dette kan gjøres ved hjelp av Register_OCT_2-plugin-modulen. (C) En StandardRetina som brukes til å måle z-score verdier av lesjoner. StandardRetinas kan opprettes ved hjelp av StandardRetina / BatchStandardRetina. (D) En BScan med blå piler som peker på SDDer, som er uthevet med gule linjer (merk: lesjoner er alltid merket under RPE uavhengig av plasseringen i z-retningen) er avbildet. (E) Alle markerte lesjoner er påtrykt et QAF-bilde (se figur 1). De to siste trinnene gjøres ved hjelp av den_BScans_OCT plugin-modulen. Forkortelser: AF = autofluorescens; QAF = kvantitativ autofluorescens; SDD = subretinal drusenoid innskudd; IR = infrarød; RPE = retinal pigmentepitel; SD-OCT = spektraldomenet optisk koherens tomografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne arbeidsflyten gir en trinnvis veiledning for å bruke FIJI-plugin-verktøy med åpen kildekode til å bestemme og sammenligne AF for AMD-spesifikke lesjoner. Plugin-modulene gir brukervennlige maler som ikke krever kodingskunnskap og kan brukes av leger uten teknisk støtte27. Så vidt vi vet, er disse verktøyene enestående for lesjonsspesifikk AF-kvantifisering.
QAF-verdiene varierer naturlig over netthinnen, med verdier høyere i periferien og lavere i makulaen på grunn av ujevn lipofuscin- og melanolipofuscinfordeling i netthinnen, lav AF i kar og ujevn makulærpigmentfordeling. På grunn av den høye variasjonen av naturlig forekommende QAF-nivåer i netthinnen, er det ikke en lovende tilnærming å analysere absolutte QAF-verdier av lesjoner direkte. For eksempel kan en hypoautofluorescerende lesjon i periferien fortsatt ha høyere absolutte QAF-verdier enn fysiologiske fluorescensnivåer i makulaen. Bruk av StandardRetina og bruk av z-score for å måle fluorescensnivåene av drusen korrigerer for denne naturlig forekommende variansen av QAF-verdier.
En z-skår er en numerisk måling av et område med interesseverdiens forhold til gjennomsnittet i StandardRetina. Det beregnes ved å trekke gjennomsnittet fra et individ fra gjennomsnittet fra StandardRetina på samme sted, og deretter dele resultatet med standardavviket. Denne standardiseringen gjør det mulig å sammenligne forskjellige QAF-bilder, ettersom z-poengsummen indikerer hvor mange standardavvik en verdi avviker fra gjennomsnittet. En positiv z-skår indikerer at verdien er over gjennomsnittet, mens en negativ z-poengsum indikerer at den er under gjennomsnittet.
Det er viktig å merke seg at det kan være potensielle fallgruver som bør vurderes. Selv om denne metoden står for den varierende mengden AF-nivåer gjennom fundus, kan det fortsatt ikke være den mest nøyaktige måten å måle og sammenligne en RPEs AF. Individer har forskjellige nivåer og topografi av makulært lutealt pigment, og lesjoner kan påvirke translucensen til den overliggende netthinnen også28,29. Det er derfor plausibelt at målt redusert AF i områder med SDD (se representative resultater) er en konsekvens av skyggeeffekter snarere enn reduserte fluoroforer i RPE30,31,32.
Vi jobber for tiden med en arbeidsflyt for å ta hensyn til retinal reflektivitet, tykkelse og kvantifisert makulært pigment (ved bruk av grønn og blå AF) med lineære blandede modeller. I tillegg bruker QAF så langt en aldersavhengig korreksjonsfaktor for å ta hensyn til lentikulær opasifisering som ser bort fra interindividuelle forskjeller i lentikulær opasifisering av deltakere i samme alder33. Vi jobber derfor for tiden med en arbeidsflyt for en personlig korreksjonsfaktor for lentikulær autofluorescens og opacifisering. For pålitelig å trekke ut informasjon om AF fra små lesjoner, er tilstrekkelig test-retest-pålitelighet av QAF-bilder nødvendig. For ytterligere å differensiere de QAF-bildene der mer detaljert analyse er levedyktig, undersøker vi "QAF image reliability indices" som kan forutsi test-retest-påliteligheten til QAF-bilder. På det nåværende stadiet er den forsiktige tilnærmingen å skaffe dupliserte bilder og undersøke retestpåliteligheten til lesjonsspesifikk AF.
Den presenterte metoden for i tillegg å analysere iso-skrogene av lesjoner var teknisk vanskelig å implementere, da iso-skrog av nærliggende lesjoner smelter sammen. Områder med sammenslåtte iso-skrog kan karakteriseres særegent avhengig av hvilken lesjon som vurderes. Vår løsning var å betrakte alle lesjoner av en type som en lesjon og å analysere periferien som et felles iso-skrog. Denne metoden reduserer imidlertid drastisk evnen til å måle iso-skrogene til individuelle drusen og kan betraktes som en ytterligere fallgruve ved denne teknikken. Mer teknisk sofistikerte metoder for å redegjøre for sammenslåtte iso-skrog eller suspendert rapportering av AF i områder med sammenslåtte iso-skrog kan lette analysen av AF i omkretsen av lesjoner i fremtiden.
Vi brukte AMD som modellsykdom i denne studien. Arbeidsflyten kan tilpasses for å studere lesjoner i andre sykdommer også. Så langt har QAF blitt brukt i mange chorioretinale sykdommer, inkludert recessiv Stargardt sykdom, Bestrophin-1 assosierte sykdommer, ulike former for retinitis pigmentosa, akutt zonal okkult ytre retinopati, pseudoxanthoma elasticum og andre 17,33,34,35,36,37. Siden denne arbeidsflyten bruker programvare med åpen kildekode, oppfordrer vi andre til å duplisere dette arbeidet ved bestemmelse av lesjonsspesifikk atrieflimmer og utvide vår kunnskap om netthinnelidelser. Oppsummert presenterer vi en arbeidsflyt for å bestemme og sammenligne AF-nivåer av forskjellige retinale lesjoner gjennom makulaen. Denne arbeidsflyten baner vei for mer dyptgående analyse av AF og kan legge til rette for utvikling av nye biomarkører i AMD og utover.
Disclosures
Leon von der Emde rapporterer å motta betalinger fra Heidelberg Engineering. Merten Mallwitz rapporterer ingen økonomiske avsløringer. Kenneth R. Sloan rapporterer heller ingen økonomiske avsløringer. Frank G. Holz rapporterer konsulent/personlige betalinger for Acucela, Alcon (C), Gyroskop Allergan Apellis, Bayer Bioeq/Formycon, CenterVue, Roche/Genentech, Geuder, Ivericbio, NightStarX, Novartis, Optos, Oxurion, Pixium Vision, Stealth BioTherapeutics, Zeiss og GRADE Reading Center. Thomas Ach rapporterer konsulenttjenester / personlige betalinger for Bayer, Apellis, Roche og Novartis.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av German Ophthalmologic Society (DOG) stipend for doktorgradsstudenter (MW) og NIH / NEI 1R01EY027948 (TA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BatchStandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| FIJI (Image J) | n.a. | n.a. | n.a. |
| Mark_Bscans_OCT plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Microspft office | Microsoft | n.a. | n.a. |
| QAF_xml_reader plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Register_OCT_2 plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
| Spectralis | Heidelberg Engineering | n.a. | QAF extension |
| StandardRetina plugin | n.a. | n.a. | n.a. |
References
- Schmitz-Valckenberg, S., et al.
- Bermond, K., et al. Autofluorescent granules of the human retinal pigment epithelium: phenotypes, intracellular distribution, and age-related topography. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (5), 35 (2020).
- Bermond, K., et al. Autofluorescent organelles within the retinal pigment epithelium in human donor eyes with and without age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 63 (1), 23 (2022).
- Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (13), 9379-9390 (2011).
- Fleckenstein, M., et al.
- Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (8), 5684-5693 (2013).
- Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
- vonder Emde, L., et al. Natural history of quantitative autofluorescence in intermediate age-related macular degeneration. Retina. 41 (4), 694-700 (2021).
- Reiter, G. S., et al. Longitudinal changes in quantitative autofluorescence during progression from intermediate to late age-related macular degeneration. Retina. 41 (6), 1236-1241 (2021).
- Gliem, M., et al. Quantitative fundus autofluorescence in early and intermediate age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
- Hussain, R. M., Gregori, N. Z., Ciulla, T. A., Lam, B. L. Pharmacotherapy of retinal disease with visual cycle modulators. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 19 (5), 471-481 (2018).
- Ammar, M. J., Hsu, J., Chiang, A., Ho, A. C., Regillo, C. D. Age-related macular degeneration therapy: a review. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 215-221 (2020).
- Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
- Zanzottera, E. C., Messinger, J. D., Ach, T., Smith, R. T., Curcio, C. A. Subducted and melanotic cells in advanced age-related macular degeneration are derived from retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3269-3278 (2015).
- Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
- Zanzottera, E. C., et al. The Project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3253-3268 (2015).
- Sparrow, J. R., Duncker, T., Schuerch, K., Paavo, M., de Carvalho, dR. L. Lessons learned from quantitative fundus autofluorescence. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100774 (2020).
- Schmitz-Valckenberg, S., et al. Correlation between the area of increased autofluorescence surrounding geographic atrophy and disease progression in patients with AMD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (6), 2648-2654 (2006).
- Ach, T., Bermond, K. Autofluorescence of the human retinal pigment epithelium in normal aging and in age-related macular degeneration: histology and clinical correlation. Klinische Monatsblatter Fur Augenheilkunde. 236 (5), 672-681 (2017).
- Pollreisz, A., et al. Visualizing melanosomes, lipofuscin, and melanolipofuscin in human retinal pigment epithelium using serial block face scanning electron microscopy. Experimental Eye Research. 166, 131-139 (2018).
- Bernstein, P. S., et al. meso-zeaxanthin: The basic and clinical science underlying carotenoid-based nutritional interventions against ocular disease. Progress in Retinal and Eye Research. 50, 34-66 (2016).
- Göbel, A. P., Fleckenstein, M., Heeren, T. F. C., Holz, F. G., Schmitz-Valckenberg, S. In-vivo mapping of drusen by fundus autofluorescence and spectral-domain optical coherence tomography imaging. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (1), 59-67 (2016).
- Pfau, M., et al. Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in geographic atrophy secondary to age-related macular degeneration. Retina. 40 (1), 169-180 (2020).
- vonder Emde, L., et al. Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (1), 7 (2018).
- Aumann, S., Donner, S., Fischer, J., Müller, F. Optical coherence tomography (OCT): principle and technical realization. High Resolution Imaging in Microscopy and Ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Cham (CH), Springer. 59-85 (2019).
- Schindelin, J., et al. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kleefeldt, N., et al. Quantitative fundus autofluorescence: advanced analysis tools. Translational Vision Science and Technology. 9 (8), 2 (2020).
- Hong, I. H., Jung, W. H., Lee, J. H., Chang, I. B. Macular pigment optical density in the Korean population: a cross sectional study. Journal of Korean Medical Science. 35 (5), e30 (2020).
- Putnam, C. M. Clinical imaging of macular pigment optical density and spatial distribution. Clinical and Experimental Optometry. 100 (4), 333-340 (2017).
- Zweifel, S. A., Spaide, R. F., Curcio, C. A., Malek, G., Imamura, Y. Reticular pseudodrusen are subretinal drusenoid deposits. Ophthalmology. 117 (2), 303-312 (2010).
- Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
- Spaide, R. F. Outer retinal atrophy after regression of subretinal drusenoid deposits as a newly recognized form of late age-related macular degeneration. Retina. 33 (9), 1800-1808 (2013).
- Reiter, G. S. Influence of lens opacities and cataract severity on quantitative fundus autofluorescence as a secondary outcome of a randomized clinical trial. Scientific Reports. 11 (1), 12685 (2021).
- Gliem, M., et al. Quantitative fundus autofluorescence in pseudoxanthoma elasticum. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (14), 6159-6165 (2017).
- Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2841-2852 (2014).
- Armenti, S. T., Greenberg, J. P., Smith, R. T. Quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases. Journal of Visualized Experiments. (109), 53577 (2016).
- Pröbster, C., et al. Quantitative fundus autofluorescence in the developing and maturing healthy eye. Translational Vision Science and Technology. 10 (2), 15 (2021).
- Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in PRPH2/RDS- and ABCA4-associated disease exhibiting phenotypic overlap. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3159-3170 (2015).
