Summary
Nasonia vepseembryoer ble dissekert fra Lucillia sericata pupper etter parasitering i 12-24 timer og vasket med alkohol og 10% natriumhypoklorittoppløsning for å oppnå bakteriefrie embryoer. Etter å ha oppdrettet de bakteriefrie embryoene og forsynt dem med Nasonia oppdrettsmedium for å vokse og utvikle seg in vitro, ble bakteriefrie Nasonia voksne oppnådd.
Abstract
Aseptisk oppdrettsteknologi er en metode for dyrking av insekter under sterile eller nesten sterile forhold, som effektivt kan eliminere påvirkning av eksterne mikroorganismer på insektmikrobiota og dermed fremme den raske utviklingen av insektmikrobiotaforskning. Nasonia (vepseslekt) er et parasittisk vepseinsekt som har mange fordeler, for eksempel kort levetid, høy genetisk variasjon, enkel betjening, etc., og er mye brukt som et insektmodellsystem. I motsetning til antibiotikabehandling, som bare kan redusere antall mikroorganismer hos dyr, kan aseptiske oppdrettsteknikker kontrollere både sammensetningen og mengden mikroorganismer hos dyr, noe som ytterligere letter studiet av vertsmikrobeinteraksjoner. Tidligere versjoner av Nasonia rearing medium (NRM) har imidlertid noen feil og problemer, for eksempel en kompleks og tidkrevende prepareringsprosess, enkel forurensning av bakterier eller sopp og kort lagringstid. Derfor løser denne studien disse problemene ved å optimalisere verktøyene som brukes i NRM-forberedelsesprosessen, lagringsforhold og komponentforhold. Det optimaliserte mediet kan tillate lagring ved -20 °C i minst 3 måneder og eliminere muligheten for NRM-forurensning under fôring av sterile veps. Dette forbedrer overlevelsen og helsenivået til aseptisk Nasonia ytterligere, noe som er viktig for å bruke Nasonia som modell for mikrobiell forskning.
Introduction
Bakteriefrie dyr er dyr som ikke har påviselige levende mikroorganismer og parasitter1. Bakteriefrie embryoer kan fås ved å dissekere moren under aseptiske forhold og deretter heves i barrieresystemer2. Slike dyr kan brukes til å studere effekten av mikroorganismer på dyr, for eksempel på tarmmikrobiota, immunsystem og metabolisme1. Med visse tekniske midler kan mange insekter og til og med pattedyr gjøres sterile 3,4. Bakteriefrie dyr har en unik rolle og har vært mye brukt i ulike deler av mikrobiologisk forskning5. For eksempel har bruken av bakteriefrie Nasonia-veps avslørt at mikroorganismer kan hjelpe verter med å tilpasse seg nye miljøer under langvarig eksogent miljøstress 6,7.
Nasonia parasitoider er små parasittveps som injiserer eggene sine i puppene til fluer4. Det er fire kjente arter av Nasonia, inkludert Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti og Nasonia oneida8. N. vitripennis finnes over hele verden, mens de tre andre artene har begrenset utbredelse i Nord-Amerika4. Nasonia parasitoide veps regnes som ideelle modellinsekter på grunn av deres egenskaper, som lett dyrking, kort reproduksjonssyklus, sekvensert genom og langvarig diapause 8,9. De kan brukes til å studere ulike aspekter av insektevolusjon, genetikk, utvikling, atferd og symbiose10. Videre kan Nasonia parasitoid veps også bidra til å kontrollere skadelige fluer i landbruket og sykdom11. Den vellykkede etableringen av et sterilt insektsystem innebærer to hovedtrinn: (1) sterilisering av embryoene og (2) levering av steril mat til larver in vitro. For å få steril mat utviklet Brucker og Bordenstein 12 Nasonia oppdrettsmedium (NRMv1) i 2012 ved å bruke kjemikalier som antibiotika, blekemiddel og føtalt bovint serum for å drepe bakterier12. Den kjemiske steriliseringsmetoden resulterte imidlertid i lav overlevelse og eklosjonsrater av N. vitripennis13. Så, i 2016, utviklet Shropshire et al. NRMv2 ved å bruke en filtersteriliseringsmetode i stedet for en kjemisk steriliseringsmetode for å eliminere farene ved antibiotika og andre stoffer, og optimaliserte avlsprosessen13. Dessverre har denne metoden fortsatt noen ulemper, for eksempel utfordringene knyttet til å forberede og bruke mediet, samt risikoen for drukning, underernæring eller dehydrering for embryoer, larver og lukkede pupper14. Wang og Brucker14 forbedret nylig Nasonia rearing media versjon 3 (NRMv3) og bakteriefri oppdrett versjon 2 (GFRv2) protokoller. Disse forbedringene reduserte kostnadene og medieforbruket. NRMv3 har imidlertid svært kort lagringstid og er svært utsatt for forurensning.
Ved å bygge på NRMv3 ble lagringsmetoden og næringsstoffforholdet til NRM-forberedelsesverktøyet optimalisert i denne studien. Denne metodologiske forfiningen gjør det mulig å bruke N. vitripennis som en modell for mikrobiomstudier. Sammenlignet med NRMv3 utviklet av Wang et al.14, forbedrer det forbedrede verktøyet for klemming av Sarcophaga bullata pupa, en av NRM-råmaterialene, produksjonseffektiviteten til S. bullata pupa vevsvæske sammenlignet med 60 ml sprøyten med et bunnhull brukt av Wang et al.14. Vi justerte næringsforholdet mellom NRM, noe som førte til en viss økning i overlevelsesraten for bakteriefrie Nasonia-veps uten å påvirke utviklingstiden. I tillegg ble NRM pakket inn i sentrifugerør med liten kapasitet (1,5 ml) og frosset i et kjøleskap på -20 °C for å forlenge lagringstiden. Det er verdt å merke seg at mens vi brukte husfluen Lucilia sericata som vert og kilde for NRM-forberedelse, kan denne protokollen sannsynligvis tilpasses andre Nasonia-verter som er tilgjengelige i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning av bakteriefritt Nasonia oppdrettsmedium
- Plasser de kommersielt tilgjengelige L. sericata-puppene (se materialfortegnelsen) på en overflate som har plass til alle puppene, for eksempel et brett eller et papirark. Kast eventuelle underutviklede larver, mørke gamle pupper, tomme puppeskjell, sagflis eller andre urenheter. Hold bare unge pupper som er brunrøde i fargen og overfør dem til et beger (ca. 3000-4000 pupper).
MERK: Etter å ha utført mange eksperimenter ble det funnet at mediet laget av de mørke gamle puppene lett ble mørkt og stoppet utviklingen av bakteriefrie veps. Dette fenomenet oppsto ikke ved bruk av de unge brunrøde puppene til å produsere medium. Årsaken til dette er fortsatt uklar og krever ytterligere undersøkelser for å bekrefte det. - Tilsett nok avionisert vann til begeret for å dekke hele overflaten av puppene. Pakk begerets munn med tinfoil eller gasbind, rist begeret for å rense urenheter på overflaten av puppene, og hell deretter ut vannet. Gjenta tre til fem ganger.
- Plasser de rensede L. sericata-puppene i filtertanken til en hvitløkspresse, klem hardt og samle vevsvæsken til L. sericata-puppene i et 50 ml sterilt sentrifugerør . Hell deretter ut puppedregs og legg nye pupper i filtertanken til hvitløkspressen til alle er presset.
MERK: Sammenlignet med nåleekstruderingsenheten som brukes av Wang et al.14, er hvitløkspressen mer praktisk og kan skille interstitialvæsken grundigere. Dette fremskrittet legger grunnlaget for storskala produksjon og langtidslagring av NRM. - Sentrifuger blandingen ved 4 °C (25 000 x g) i 10 minutter. Etter sentrifugering deles blandingen i tre lag fra bunn til topp: sedimentlag, proteinlag og fettlag (figur 1).
- For å forhindre tilstopping under filtrering, aspirer proteinlaget med en 18 G steril nål og overfør det til et nytt 50 ml konisk sterilt sentrifugerør av polypropylen.
- Tilsett kommersielt flytende Drosophila-medium (se materialtabell) til proteinekstraktet i forholdet 1: 1.
MERK: Mer praktisk kommersialisert L. sericata ble brukt som vert og NRM råmateriale, sammenlignet med NRMv3. Derfor ble næringsratioen justert fra 1:2 til 1:1 basert på NRMv3, som var mer egnet for vekst og utvikling av steril Nasonia (figur 2). - Filtrer det blandede medium (Drosophila medium og proteinekstrakt av L. sericata pupa) ved hjelp av et vakuumfiltreringssystem med forskjellige porestørrelser (8, 1,2, 0,8 og 0,45 μm; se materialtabell) for å fjerne partikler av forskjellige størrelser. For å forhindre tilstopping, bytt filterpapir når strømmen avtar.
MERK: Bruk av et nytt 50 ml sterilt sentrifugerør er nødvendig for hver filtrering. - Sentrifuger væsken igjen ved 4 °C (15 000 x g) i 10 minutter og steriliser supernatantmediet gjennom et 0,22 μm sprøytefilter. Gjenta trinnene ovenfor én gang.
- Oppbevar dyrkningsmediet ved -20 °C etter alliking (figur 3A) for langtidsoppbevaring.
MERK: For å forhindre forurensning og gjentatt frysing og tining, anbefales det å åpne hver tube med NRM bare én gang ved bruk av dyrkningsmediet etter emballering (figur 3A).
2. Bakteriefri eggsamling
- For å sikre et stabilt forhold mellom menn og kvinner hos avkom, plasser puppene i et Drosophila-hetteglass under puppestadiet i et forhold på 50 hunner til 15 hanner på grunn av deres haploide genetiske egenskaper (hanner utvikler seg fra haploide celler, mens hunner utvikler seg fra diploide celler som skyldes befruktede egg)4,15.
- Etter å ha kommet frem til voksne, la hannene og hunnene parre seg i 1,5 dager, og legg deretter ca. 40 L. sericata-pupper inn i hetteglasset. Innen 12-24 timer etter parasitering, bruk en steril dissekerende nål for å forsiktig åpne den ene enden av puppestallet under et stereomikroskop (figur 4).
- Hold den andre enden for hånd og finn vepseembryoene. Bruk en dissekeringsnål for å overføre embryoer fra overflaten av L. sericata puppevev til en steril cellesil med fosfatbufret saltvann (PBS)14.
MERK: Eldre L. sericata pupper bør brukes til parasittisme fordi det tørre L. sericata puppevevet er lettere å overføre embryoer . For å sikre jevn overføring av egg fra L. sericata puppevevsoverflaten, prøv å være forsiktig så du ikke punkterer vevet når dissekeringsnålen åpner puppehuset slik at interstitialvæsken ikke strømmer ut.
- Plasser 20-30 embryoer på en cellesil og vask dem jevnt med 1000 μL 10% kommersiell natriumhypoklorittløsning (se materialfortegnelse), etterfulgt av en annen vask med 1000 μL 1x steril PBS. Vask deretter en gang med 1,000 μL 70% etanoloppløsning og vask tre ganger med 1,000 μL 1x steril PBS.
- Først plasserer du et 5 mm diameter polypropylennettark (se materialfortegnelse) som er forfuktet med 1x PBS i en 24-brønnsplate. Deretter, ved hjelp av en sterilisert liten børste, børst forsiktig vepseembryoene på cellesilen på polypropylennettarket. Dette kan gjøres for alle fire brønnene i en vertikal kolonne på 24-brønnsplaten.
3. Bakteriefri vepseoppdrett
- Tilsett 50 μL NRM til hver brønn i en laminær strømningshette. For å opprettholde et fuktig miljø for vekst, tilsett 1 ml sterilt vann mellom hver brønn i 24-brønnplaten. Et lite beger som inneholder 30 ml sterilt vann kan også plasseres i den 5 l sterile plastboksen med 24-brønnplaten.
- Gjennom hele forsøket må du holde den sterile plastboksen og 24-brønnsplaten i et klimakammer ved en konstant temperatur på 25 ± 2 °C og under konstant lys.
- Før du overfører og legger til NRM hver dag, tine den frosne NRM på en laminær strømningsbenk. I et sterilt miljø, bruk alkohol-desinfisert pinsett for å overføre polypropylennettet med larver på den fra en brønn til en annen. Til slutt, tilsett 50 μL NRM som har blitt likevektet til romtemperatur (figur 3B). Gjenta ovennevnte operasjoner hver dag til pupper blir observert.
MERK: Med utviklingen av veps, bør mengden NRM økes på riktig måte for å sikre at de bakteriefrie vepsene har tilstrekkelig ernæring. For eksempel ble de fjerde stjernelarvene forsynt med 60 til 70 μL NRM. Siden forskjellige utviklingsstadier kan sameksistere i samme brønn, bruk en sterilisert børste for å overføre ut puppene. Legg til en liten mengde NRM til de resterende larver. Bruk aseptiske teknikker for å unngå mikrobiell invasjon og forurensning. - Etter fôring i 9 til 11 dager utvikler mer enn 80% av larvene seg til hvite eller gule pupper. På dette tidspunktet flytter du filteret til en ren brønnplate og slutter å legge til kulturmedium for å vente på eclosion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forberedelseseffektiviteten til NRM ble kraftig forbedret ved å forbedre prepareringsverktøyene. I tillegg ble problemet med NRM-forurensning i fôringsprosessen eliminert ved å optimalisere strategien og bevaringsmetoden. Samtidig hadde justert NRM et mer egnet næringsforhold for vekst og utvikling av bakteriefrie veps med L. sericata som vert. Overlevelsen av bakteriefrie veps fra larver til pupper var signifikant forbedret sammenlignet med bakteriefrie veps oppdrettet med NRMv3 ved bruk av GFRv2 (figur 2). Videre var generasjonsperioden ikke forskjellig mellom de aseptiske vepsene og de konvensjonelt oppdrettede vepsene (ca. 14 dager i generasjonen) (figur 5). Disse forbedringene er svært viktige for å utvikle Nasonia-modellorganismen og studere vertsmikroorganismeinteraksjonsmekanismen.
Figur 1: Blanding separert ved sentrifugering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Overlevelse av larver til pupper i hver transwell. Overlevelsesraten forbedret seg signifikant sammenlignet med bakteriefrie hunner oppdrettet på NRMv3 med GFRv2 (to uavhengige utvalg T-tester, *p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk diagram over NRM-dispensering og bakteriefri vepseoppdrett. (A) Den filtrerte NRM fra 50 ml sentrifugerøret ble alisert i sterile 1,5 ml sentrifugerør og frosset. Hvert rør av NRM ble bare åpnet en gang. (B) Det var et polypropylennettark under embryoene til Nasonia-vepsene. Sentrifugerøret inneholdt den pakkede NRM. "Dag 14-ish" betyr voksen fremvekst oppstår på omtrent den 14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bilder av overførte vepseegg under stereomikroskopet. Eggene som legges av Nasonia-vepsen er innenfor den rødstiplede boksen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av utviklingstid. Utviklingstiden for bakteriefrie hunner (ca. 14 dager) var ikke signifikant forskjellig fra den for konvensjonelt oppdrettede veps ved bruk av forbedret NRM i denne studien (to uavhengige utvalg T-tester, ns, ikke signifikant, p > 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved bruk av høykapasitetsdeteksjonsteknologier som genomikk og metabolomikk har forskere gradvis innsett at det er stort genetisk mangfold og metabolsk kompleksitet i tarmmikrobiota16. Disse symbiotiske bakteriene er nært knyttet til ulike fysiologiske eller patologiske tilstander, for eksempel vertens ernæringsmessige metabolisme, svulster, immunitet og aldring gjennom komplekse interaksjoner med verten17. Imidlertid er forskningen knyttet til nettverket av sammensetningen og funksjonen til den mikrobielle befolkningen i verten svært vanskelig fordi sammensetningen av mikroorganismer i hvert naturlig individ ikke er nøyaktig det samme16. Derfor er det nødvendig med en ideell modell for å utforske samspillet og relaterte mekanismer mellom mikroorganismer og verter. Nasonia-veps kan brukes som en ideell modell i mikrobiomfeltet på grunn av dens mange biologiske fordeler og egenskapene til bakteriefrie veps6. Sammenlignet med antibiotikabehandling gir bruk av sterile dyr kontroll over sammensetningen og mengden mikroorganismer, noe som er avgjørende for å studere mikrobiell funksjon. I tillegg kan antibiotikabehandling føre til flere bivirkninger, inkludert antibiotikaresistens, tarmdysfunksjon og tarmbarriereskade18. Derfor er utvikling av en mer effektiv metode for å oppnå bakteriefrie veps av stor betydning for å studere vertsmikrobiominteraksjoner.
Oppkjøpet av bakteriefri Nasonia omfatter hovedsakelig to trinn - å skaffe sterile embryoer og gi steril mat. Embryoene ble oppnådd ved å dissekere L. sericata pupper 12-24 timer etter N. vitripennis parasitisering under et stereoskop13. Dette trinnet krevde nok ferdigheter til å flytte embryoene raskere og uten å skade dem til cellesilen. Basert på erfaring er det mer praktisk å dissekere de gamle L. sericata-puppene som er svarte. Imidlertid foretrekkes unge røde L. sericata-pupper for å forberede NRM.
Videre var den normale utviklingen av sterile embryoer avhengig av produksjonen av steril mat og operasjonsprosessen med å bytte medium hver dag12. Vi fant at hovedkilden til forurensning for oppdrett av bakteriefrie veps av Wang et al. 's14 GFRv2 var NRM. Derfor ble dyrkingen pakket og oppbevart i kjøleskapet ved -20 °C i denne studien, slik at hvert medium bare åpnes én gang. Dette hadde ikke bare ingen effekt på vekst og utvikling av Nasonia-veps , men forlenget også kulturmediets lagringstid og eliminerte sjansen for NRM-forurensning. Totalt økte denne metoden ytterligere overlevelsesgraden for aseptiske veps.
Imidlertid har den nåværende metoden fortsatt noen ulemper. For eksempel kan den daglige overføringen av sterile embryoer i en 24-brønnsplate øke risikoen for forurensning. I tillegg er prosessen med å klemme en masse fluepupper også tidkrevende og arbeidskrevende. Hvis de spesifikke næringsstoffene som spiller en rolle i fluepupper kan identifiseres, kan de kjøpes og tilsettes direkte til mediet, noe som vil forbedre effektiviteten av NRM-forberedelsen. Det forventes at denne metoden vil bli ytterligere optimalisert i fremtidig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation of China (32270538), National Key R &D Program of China (2022YFF0710603), Natural Science Foundation of Beijing (6222046), og CAS strategiske finansiering via CAS-CSIRO finansieringsordningen (152111KYSB20210011) tildelt G.H.W. Forfatterbidrag: alle forfattere utviklet omfanget og fokuset for gjennomgangen og bidro til skrivingen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
