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Biology

一种幼狨猴的人工饲养方法

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65296
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,3, 1,4, 1,2,4, 1,2,4
1Department of Neurology of the Second Affiliated Hospital and Interdisciplinary Institute of Neuroscience and Technology, School of Medicine, Zhejiang University, 2Key Laboratory of Biomedical Engineering of Ministry of Education, College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, 3Rehabilitation Medicine Center, Rehabilitation & Sports Medicine Research Institute of Zhejiang Province, Department of Rehabilitation Medicine, Zhejiang Provincial People’s Hospital, Affiliated People’s Hospital, Hangzhou Medical College, 4NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-Machine Integration, School of Brain Science and Brain Medicine, Zhejiang University

Summary

在这里，我们描述了一种在动物孵化器中饲养幼年狨猴的人工饲养方法。该方法大大提高了狨猴幼崽的存活率，为研究在不同产后环境中饲养的具有相似遗传背景的狨猴幼崽的发育提供了机会。

Abstract

普通狨猴（Callithrix jacchus）是一种小型且高度社会化的新世界猴子，具有很高的繁殖率，已被证明是生物医学和神经科学研究的引人注目的非人类灵长类动物模型。一些女性生下三胞胎;但是，父母不能全部抚养。为了拯救这些幼崽，我们开发了一种人工饲养方法，用于饲养新生狨猴。在该协议中，我们描述了食物的配方，喂养时间，温度和湿度的配置，以及人工饲养的婴儿对殖民地环境的适应。这种人工饲养方法显著提高了狨猴幼崽的存活率（不人工饲养：45%;人工饲养：86%），并为研究在不同产后环境中饲养的具有相似遗传背景的狨猴幼崽的发育提供了机会。由于该方法实用且易于使用，我们预计它也可以应用于其他使用普通狨猴的实验室。

Introduction

普通狨猴（Callithrix jacchus）是一种起源于南美洲和中美洲的小型树栖新世界猴子。在过去的几十年里，狨猴在生物医学研究中的使用迅速增长，因为与其他非人类灵长类动物 （NHP） 相比，狨猴的几个关键优势，包括它们的体型更小、更容易在圈养中处理和繁殖、妊娠时间更短、性成熟更早和人畜共患风险较低 1,2,3,4,5,6 .普通狨猴具有与人类相似的大脑结构和大脑功能，并表现出丰富的发声和具有丰富情感的高度社会行为。它是不同类型的神经科学研究的引人注目的 NHP 模型，例如感觉处理研究7、8、9、10、11、12、13、14、声音交流 15、16、17、18、19、脊髓损伤模型 20，21,22,23，帕金森病24,25,26,27,28和年龄相关疾病29。与其他非人灵长类相比，普通狨猴具有较高的繁殖率，可用于转基因修饰30,31,32。这种灵长类动物也广泛用于药理学、血管造影、病原体和免疫研究33、34、35、36、37、38、39。然而，狨猴的供应仍然非常有限，尤其是在中国，无法满足快速增长的科研需求。

在狨猴群落中，成年动物每天喂食一到两次，一些机构改变了幼年狨猴的饮食 40.一般来说，幼年狨猴通常会牢牢抓住父亲或哥哥姐姐的身体进行日常护理，每天多次交给母亲喝奶。一些雌性狨猴会生下三胞胎，在这种情况下，一两个婴儿由于缺乏乳汁而无法存活;此外，有些父母因为缺乏护理经验或其他未知原因而不照顾婴儿。这对许多实验室来说是一个巨大的损失。一些研究报告了圈养环境中成年狨猴的营养管理方法 40,41,42 利用具有不同常量营养素成分、维生素和矿物质的食物和配方，以及不同的富集喂养方案（捣碎、凝胶、纯化或罐装）2,41。之前的一项研究报道了一种针对狨猴三胞胎43 的协作饲养方法，其中照顾者每天带走一个婴儿，全天用手喂养它，并在第二天将其换成另一个三胞胎。虽然这种方法可以让婴儿得到父母的照顾，但它需要有经验的照顾者每天将婴儿从父母的身体中抓起，并且是劳动密集型的。到目前为止，还没有研究报告过对新生狨猴进行详细的、循序渐进的人工饲养方法。

本研究的目标是为那些对狨猴发育感兴趣但资源有限的人提供一种人工饲养方法。与以前的协作抚养方法43相比，现在的方法是一种对婴儿家庭造成较少干扰且易于学习的替代方案。本文基于母乳喂养的基本规则和5年的实践，描述了一种人工饲养幼狨猴的方法，包括食物的准备、喂养时间表、动物孵化器温度和湿度的配置，以及幼年动物对群体环境的适应。

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Protocol

所有实验程序均经浙江大学动物使用与护理委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南。

1. 住房和畜牧业44

  1. 将菌落室设置为12小时：12小时昼夜循环，温度为26-28°C，相对湿度为45%-55%。
  2. 将 2-6 岁的雄性和雌性狨猴配对，并将它们放在笼子 （850 mm x 800 mm x 800 mm） 中，具有足够的空间和新鲜空气，并配备 24 小时通风系统。
  3. 在笼子里提供休息板、秋千、栖木和吊床。
  4. 每天两次用淡水和 30-40 克食物喂养这对狨猴，包括谷物、鸡蛋、红薯、蜂蜜、水果、蔬菜和黄粉虫。
    注意：兽医和实验人员必须每天至少检查一次动物设施，以确保立即诊断和治疗任何病人。

2. 狨猴幼崽出生前的准备工作

  1. 照顾怀孕的狨猴
    注意：受孕时间是通过触诊（通常在胚胎期开始后 10-20 天）诊断的，我们还参考了动物受试者的生殖史。
    1. 为繁殖对提供更大的空间和最小的人为干扰。
    2. 用黄粉虫、鸡蛋、酸奶和干果等额外食物喂养繁殖对，以保证雌性的营养。
    3. 照顾并经常检查怀孕的狨猴，为它们的分娩做准备。
      注意：狨猴的妊娠期估计为 148 天± 4.3 天45。
  2. 准备以下物品：动物培养箱（855 mm [W] x 470 mm [L] x 440 mm [H]）、一次性尿布垫（M / L尺寸）、婴儿湿巾、毛绒玩具（图1A）、玩具滚轮（图1B）、攀爬架（图1B）、毯子（10厘米х10厘米，图1C）和电子秤（精度为0.2克，图1F）。
    注意： 为避免动物悬挂，毛绒玩具不应具有环形结构。
  3. 食品和喂食器具的制备
    1. 准备以下物品：婴儿配方奶粉（适合0-12个月）、婴儿米糊（适合0-6个月）、电水壶、烧杯（100毫升）、加热垫、塑料称量盘（80毫米×80毫米×22毫米，图 1D）、无菌离心管（50毫升）、一次性无菌注射器（1-5毫升）、静脉注射器（用于定制喂养奶嘴）（图1E）， 和拭子（80-100厘米）。
      注意：为了制作用于喂养的，从连接到注射器的静脉注射器末端切开1厘米（图1E）。
  4. 记录表格准备
    1. 为每只幼崽狨猴准备一份表格，通常长达数页，记录基本信息，如姓名、出生日期、出生体重、父母、其他感兴趣的基本信息，如头围和尾巴长度、繁殖信息，如繁殖日期和时间、食物摄入量（毫升）、排便状态（是/否， 硬/松）以及培养箱的温度和湿度。
      注意：通常，每天测量和记录体重两次，一次在第一餐前，一次在最后一餐前。

Figure 1
图 1：培养箱中的物品以及喂食工具和配件的照片。 （A） 毛绒玩具;（二）玩具滚轮和爬架;（三）毛毯;（四）塑料称量盘;（五）静脉注射器和注射器配有定制的喂食奶嘴;（六）电子秤;（七）护理人员配备个人防护用品。 请点击这里查看此图的较大版本.

3. 人工饲养程序

  1. 在预产期之前对房间进行清洁和消毒。
    1. 将次氯酸或75%乙醇喷洒在地板和桌子上，静置30秒，然后擦拭桌子，拖地。
  2. 将培养箱的温度设置为35°C，将湿度设置为40%。通常，为了模拟婴儿狨猴的基本温度要求，如 表1 所示，在出生后第14天（P14）之前，将培养箱温度保持在35°C，从P15开始，每3天降低0.5°C。保育箱内保持湿度在40%-45%，接近菌落湿度，保持婴儿皮毛干燥。
  3. 铺上一次性尿布垫以覆盖培养箱的底盘。
  4. 为了尽量减少婴儿的压力，在引入婴儿狨猴之前，在保育箱中放几条毯子和毛绒玩具，这些狨猴往往会模仿成年狨猴。
    注意：毯子和毛绒玩具在使用前将放在繁殖对的家庭笼子中 1 天。
  5. 将幼年狨猴放入保育箱中，并在家庭笼子中与父母分开后将它们放在毛绒玩具上。
    注意：为了避免社会孤立并符合动物福利，通常选择两个婴儿一起进行人工抚养。
    1. 喂食前穿戴消毒的个人防护装备（PPE， 图1G）。
    2. 将几条毯子加热至35°C。
    3. 用温暖的毯子轻轻地抱住幼年狨猴，并获得动物的体重作为出生体重。
    4. 用温暖的毯子将婴儿狨猴转移到保育箱中。
    5. 记录，如步骤 2.4 中所述。
  6. 混合食物成分并喂养幼年狨猴。
    1. 将5g婴儿配方奶粉溶解在50mL无菌离心管中的30mL 50°C开水中。
      注意：不同出生后年龄的婴儿狨猴需要不同的食物食谱。 表2 包括从P1到P60的出生后年龄婴儿配方奶粉、米糊和水的不同剂量。剂量通常足够1天。在第一餐前混合配料，并将其余食物存放在4°C冰箱中。每餐将食物加热至30-35°C。
    2. 用 1 mL 注射器取 1 mL 食物，并用定制的喂食奶嘴盖住注射器。
      注意： 选择合适尺寸的注射器，请参阅 表 2。
    3. 用加热垫将食物温度保持在 30-35 °C。
    4. 喂食前加热双手，在保育箱中用一只手用温暖的毯子轻轻握住幼咪狨猴。
    5. 将喂食奶嘴放入婴儿狨猴的嘴里，同时用照顾者握手的拇指和食指轻轻握住婴儿狨猴的头部，然后以恒定的速度缓慢地将食物从注射器中推出。
      注意： 切勿将食物推得比小狨猴吞咽的速度快。快速推动会导致窒息，食物从鼻子通过喉咙流出。这可能导致肺炎等疾病，甚至可能导致死亡。如果食物溢出，幼年狨猴会挣扎。每当发生这种情况时，请停止喂食并小心地擦拭动物脸上的食物。狨猴开始正常表现后继续喂食。
  7. 幼狨猴进食适量食物后，用温水棉签擦拭肛门，既能清洁肛门，又能促进排便。
  8. 观察动物几分钟，并检查动物的运动和排便。
  9. 记录喂食时间、进食量（mL）、排便状态（是/否、硬/松）以及培养箱温度和湿度。
    注意： 称重时用温暖的毯子包裹婴儿狨猴，以免婴儿着凉或受伤。
  10. 通过捡起固体粪便或更换新的一次性尿布垫来保持培养箱的底盘清洁。
  11. 在P50之前，按照步骤3.3-3.7喂养幼妞狨猴，并使用 表2所示的食物配料剂量和喂养时间和频率。
  12. 从 P50 开始，幼年狨猴通常可以自愿进食。
    1. 使用塑料称量盘代替注射器。将食物成分直接混合在盘子中来准备食物;金额见 表2 。
    2. 将食物盘放入培养箱中，并固定底部以防翻转。观察几分钟，确保幼狨猴吃掉食物。在最初的几次中，通过将动物引诱到食物盘中并引导其嘴多次触摸食物来引导动物自愿进食。
      注意： 切勿让动物的鼻子接触食物。通常，动物会在 1 天内学会自愿进食。

4. 幼狨猴返回殖民地前的适应

注意：通常，当幼年狨猴学会自己进食时，人工饲养就完成了。在将它们放回狨猴群落的家庭笼子之前，需要执行一些适应程序。

  1. 将幼咋猴从动物培养箱移至类似于鸟笼的小笼子（45 cm x 45 cm x 40 cm）中。在每个小笼子上挂一个水瓶（50 mL）。
  2. 将装有幼狨猴的小笼子转移到殖民地，并将它们放置在靠近家庭笼子的位置。
  3. 用塑料称重盘分别喂养幼咪狨猴1周，根据为整个群体准备的每日食谱混合食物。
  4. 每天记录一次体重和排便情况。

5. 幼年狨猴返回家庭笼子

注意：在小笼子里生活7-10天后，幼年狨猴通常能很好地适应群体环境，不再表现出焦虑。

  1. 早上将幼崽狨猴放回家庭笼子里。
  2. 观察动物至少 15 分钟，以确保家庭成员和新进入者之间没有咬人、打架或追逐。
    注意： 如果发生咬人、打架或追逐，请尽快将婴儿与其他婴儿分开;并尝试在另一天再次将婴儿送回家人身边。如果失败再次发生，请选择另一个家庭进行寄养。育儿经验丰富的家庭群体是寄养的首选。如果没有家人接受，就把毛绒玩具放在一个新的笼子里，陪伴小猴子。
  3. 停止单独喂养幼咪狨猴，并开始使用蜂群的饮食喂养它们。
  4. 在幼咬狨回到家庭笼子后 1 周内密切关注它们的活动。
  5. 每 2 天测量一次幼咪狨猴的体重，并做好记录。如果他们体重减轻，在家庭笼子里用注射器喂他们额外的营养食物。
  6. 为幼崽狨猴提供日常护理，就像殖民地中的狨猴一样。

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Representative Results

体重是动物身体发育的关键指标，在本协议中用作狨猴健康状况的指标。在这项工作中，人工饲养的动物的体重随着年龄的增长而逐渐增加（图2A，n = 16），类似于先前研究中新生婴儿的体重46。为了尽量减少对殖民地繁殖家庭的干扰，我们没有每天对殖民地中的幼年狨猴进行称重。我们获得了父母饲养的动物在出生后1个月及以后的体重，并将其与同龄人工饲养的婴儿的体重进行比较。父母抚养婴儿和人工饲养婴儿的体重差异无统计学意义（P30，人工饲养组，52.25 g ± 2.10 g，n = 18;群体组，57.34 g ± 2.77 g，n = 7;t = −1.3417，P = 0.1928; P60，人工饲养组，91.76 g ± 3.44 g，菌落组，93.06 g ± 4.68 g;t= −0.2019，P = 0.8424; 学生的t检验）（图2B）。

Figure 2
图2：人工饲养的幼咪狨猴和亲本 饲养的狨猴的体重。 （A） 每个人工饲养的婴儿的体重。灰线表示个体体重，橙色曲线表示人口平均值。（B） P30 和 P60 时人工饲养的婴儿（橙色）和父母抚养的婴儿（绿色）的体重比较。灰色圆圈代表个人。数据显示为平均值±SEM。 ns表示无显著差异。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1.动物培养箱中温度的配置。请按此下载此表格。

表2：饲喂配方。 “食品成分”下的栏目表示 1 天的牛奶配方。例如，在产后第1-14天，我们在第一餐前将5克婴儿奶粉和30毫升水混合，每次服用0.5-1.5毫升这种牛奶进行喂养。“婴儿奶粉”和“米糊”的用量是针对粉状的。 请按此下载此表格。

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Discussion

普通狨猴是生物医学和神经科学研究非常有用的非人灵长类模型。然而，狨猴资源太有限，无法满足快速增长的需求。在这项工作中，我们开发了一种人工饲养方法，不仅可以提高狨猴幼崽的存活率，还可以为研究它们的产后发育提供机会。这种人工饲养方法实用且易于学习，因此很容易适用于其他使用普通狨猴的实验室。

一些先天性缺陷通常在出生后的前 2 周内出现。到目前为止，我们已经发现了几例新生狨猴的眼睑、肺、肠和大脑有先天缺陷，它们很少存活到 P14。因此，P1-14是筛选出可通过人工饲养方法饲养的健康新生狨猴的关键期。此外，如果幼年狨猴因疏忽或缺乏牛奶而从父母体内掉落，它们将无法存活。因此，人工饲养方法有助于挽救他们的生命。在这项工作中，在没有人工饲养的情况下，存活率为45%（n=13/29），应用人工饲养方法后存活率提高到86%（n=25/29）。

有几个关键点需要注意。喂食过程中护理人员必须耐心等待;将注射器推得太快是不好的，因为它不允许婴儿狨猴吞咽，这可能导致窒息或肠梗阻，从而损害动物的呼吸系统或消化系统。照顾者在喂食过程中必须保持温柔和安静，以尽量减少对幼动物的压力，因为压力会显着影响肠道微生物组，并与狨猴的慢性腹泻有关47,48。在人工饲养过程中，幼狨猴附近的所有人都必须自始至终表现得温和。有时，匆忙打开保育箱的门会突然发出响亮的声音，这会吓到婴儿并导致应激反应。

必须每天监测动物的体重，因为体重是动物健康状况的关键指标。喂养不足、喂养过度、营养不良或消化不良可以通过体重变化快速检测。先前有报道称，体重轻的狨猴更容易同时患骨骼和胃肠道疾病49.一般来说，幼狨猴的体重在P1-5阶段保持不变，使用人工饲养方法时每天逐渐增加1-4克。从P5开始，如果在2天内没有观察到体重增加或逐渐减轻，护理人员必须保持警惕，并检查食物成分，以及动物的体温和排泄情况。在这种情况下，添加益生菌很有用。

没有必要在一夜之间喂养动物。我们尝试每 2 小时到 4 小时全天候喂食一次幼年狨猴，发现它并不能促进幼年狨猴的生长（数据未显示）。缺乏足够的体育锻炼或过度喂养可能会诱发代谢综合征，例如肥胖，这与狨猴血脂异常、葡萄糖代谢改变和胰岛素抵抗有关50,51,52。婴儿在喂养和称重时必须保持温暖，尤其是在出生后的头几天。我们发现，一名婴儿在感冒后出现腹泻;腹泻会迅速削弱动物的活力并减轻体重。

握力和体温是婴儿狨猴健康状况的主要指标，必须仔细监测。每当喂食幼咪狨猴时，它都会抓住毯子或喂食者的手指。当动物腹泻时，握力通常会减弱。一旦发生这种情况，应该在食物中加入豌豆大小的益生菌，并喂养受影响的婴儿 3 天，直到腹泻消失。如果腹泻持续超过 3 天，则应添加蒙脱石粉而不是益生菌。相反，如果婴儿便秘，应用蘸有温水的棉签轻轻擦拭肛门以促进排便，必要时应使用乳果糖。此外，幼年狨猴的体温通常高于人类。如果动物的体温低于正常水平，这通常与握力减弱有关，则必须密切监测动物的行为并相应地调整喂养。

当幼年狨猴开始攀爬时，必须在饲养员的监督下，在保育箱中为它们提供攀爬架和玩具滚轮。从P25开始，动物可以在每餐前后练习攀爬。在P50时，幼年狨猴可以很好地攀爬和跳跃，这是自愿进食的先决条件。幼年狨猴喜欢通过咬毯子、毛绒玩具或一次性尿布垫来磨牙，但这些可能会形成小环，由于自我勒死而威胁到它们的生命。因此，应及时清洁撕裂的碎片和线，以免受伤或死亡。

有时，由于食欲、活力和环境条件的差异，喂养程序可能会略有改变。如果一只幼年狨猴足够强壮，它可能会在 P25 之前开始练习攀爬，在 P50 之前学习自愿进食，甚至在 P60 之前回到家庭。同时，我们每天或每 2 天将孵化器中的温度降低 0.5 °C，以便幼狨猴在最终返回笼子之前可以适应与蜂群中相同的温度。如果幼年狨猴在一段时间内食欲不振，则每餐必须提供较少的食物，但每天提供的食物频率较高，并且保育箱必须保持比蜂群更长的时间。在目前的研究中，88.9%（n = 16/18）的婴儿被亲生父母成功接受，11.1%（n = 2/18）被其他家庭寄养，没有一个被拒绝。

研究具有不同家庭结构的幼年狨猴揭示了它们在社会和智力发展方面的差异;事实上，父母与孩子之间以及同龄人之间的社会互动在发育过程中可能会塑造社会大脑功能53,54,55。因此，选择一只或两只动物进行人工饲养取决于实验的目的。如果可能的话，我们的实验室通常会人工抚养两只婴儿，以满足动物福利需求并帮助更多婴儿生存。狨猴三胞胎43的协同饲养方法也是一个不错的选择。亲子互动有限的人工饲养的狨猴可能不适合用于社会行为研究的实验。

总之，本研究中的人工饲养方法为如何喂养P1至P60的幼年狨猴提供了指导。使用此方案，有经验的饲养员手动喂养一只幼勨需要 ~15 分钟。手术的成功取决于多种因素，包括食物和环境的适当温度、喂食时间和技术以及动物饭后排泄。这种方法可行且易于学习。经过5年的实践，不断优化。该方法可应用于其他使用普通狨猴的实验室。

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Disclosures

作者没有要披露的利益冲突。

Acknowledgments

作者要感谢李明轩对本手稿早期版本的语法和润色。这项工作得到了中国浙江省自然科学基金（LD22H090003）的支持;国家自然科学基金（32170991 32071097），STI2030重大专项2021ZD0204100（2021ZD0204101）和2022ZD0205000（2022ZD0205003）;以及浙江大学教育部脑科学与脑机集成前沿科学中心。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animal incubator RCOM, Korea MX - BL600N, 855 mm (W) x 470 mm (L) x 440 mm (H)
baby milk powder Meadjohnson, America suitable for 0-12 months of age, executive standard - GB25596
baby rice paste HEINZ, China suitable for 0-6 months of age, executive standard - GB10769
baby wipes babycare, China soft
beaker ShuNiu, China 100 mL
blankets Grace, China 10 cm × 10 cm, soft
climbing frame WowWee, China firm and no small circular structures
disposable diaper pads Hi Health Pet, China either M or L size
disposable sterile syringe Cofoe, China 1 mL, 2.5 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL
electronic scale YouSheng, China measuring range from 0 to 6,000 g with precision of 0.2 g
intravenous injector HD, China 0.55 mm x 20 mm needle
kettle FGA, China warm-keeping kettle 1,500 mL
lactulose BELCOL, China to solve constipation
plastic weighing dish SKSLAB, China 80 mm x 80 mm x 22 mm, used as a bowl
plush toy Lebiyou, China soft
probiotic powder G-Pet, China to regulate gastrointestinal environment
sterile centrifuge tube NEST, China 50 mL
swab OYEAH, China 80 - 100 mm
toy roller WowWee, China firm and no small circular structures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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