Summary
Dit werk demonstreert het gebruik van een multimodaal echografie-gebaseerd beeldvormingsplatform voor niet-invasieve beeldvorming van ischemische beroerte. Dit systeem maakt de kwantificering van bloedoxygenatie mogelijk door fotoakoestische beeldvorming en verminderde perfusie in de hersenen door akoestische angiografie.
Abstract
Hier wordt een experimentele ischemische beroertestudie gepresenteerd met behulp van ons nieuw ontwikkelde niet-invasieve beeldvormingssysteem dat drie akoestische beeldvormingstechnologieën integreert: fotoakoestische, ultrasone en angiografische tomografie (PAUSAT). Het combineren van deze drie modaliteiten helpt bij het verkrijgen van multispectrale fotoakoestische tomografie (PAT) van de bloedoxygenatie van de hersenen, hoogfrequente echografie van het hersenweefsel en akoestische angiografie van de cerebrale bloedperfusie. Het multimodale beeldvormingsplatform maakt de studie van cerebrale perfusie en oxygenatieveranderingen in het hele muizenbrein na een beroerte mogelijk. Twee veelgebruikte ischemische beroertemodellen werden geëvalueerd: het permanente middencerebrale arterie occlusie (pMCAO) model en het fototrombotische (PT) model. PAUSAT werd gebruikt om dezelfde muizenhersenen voor en na een beroerte in beeld te brengen en beide beroertemodellen kwantitatief te analyseren. Dit beeldvormingssysteem was in staat om de vasculaire veranderingen in de hersenen na ischemische beroerte duidelijk te laten zien, waaronder significant verminderde bloedperfusie en oxygenatie in het beroerte-infarctgebied (ipsilateraal) in vergelijking met het niet-gewonde weefsel (contralateraal). De resultaten werden bevestigd door zowel laser speckle contrast imaging en trifenyltetrazolium chloride (TTC) kleuring. Bovendien werd het infarctvolume van de beroerte in beide slagmodellen gemeten en gevalideerd door TTC-kleuring als de grondwaarheid. Door deze studie hebben we aangetoond dat PAUSAT een krachtig hulpmiddel kan zijn in niet-invasieve en longitudinale preklinische studies van ischemische beroerte.
Introduction
Bloed transporteert zuurstof (via het hemoglobine-eiwit) en andere belangrijke voedingsstoffen naar weefsels in ons lichaam. Wanneer de bloedstroom door weefsels wordt onderbroken (ischemie), kan ernstige schade aan de weefsels optreden, waarvan de meest directe effecten te wijten zijn aan een gebrek aan zuurstof (hypoxie). Ischemische beroerte is het gevolg van een onderbroken bloedtoevoer naar een bepaald gebied van de hersenen. De hersenschade als gevolg van een ischemische beroerte kan binnen enkele minuten na een vaatblokkade optreden en kan vaak slopende en blijvende effecten hebben 1,2. Een zeer waardevolle strategie om de fysiopathologie na ischemische beroerte te evalueren en nieuwe behandelingen te identificeren en te testen, is het gebruik van modellen met kleine dieren in het laboratorium. Behandelingen die in het lab worden ontdekt, zijn bedoeld om te worden vertaald naar klinisch gebruik en het leven van patiënten te verbeteren. Het gebruik van dieren in biomedisch onderzoek moet echter zorgvuldig worden geëvalueerd volgens de 3V-principes van Russell en Burch: vervanging, reductie en verfijning3. Het doel van de reductiecomponent is om het aantal dieren te verminderen zonder de gegevensverzameling in gevaar te brengen. Met dit in gedachten biedt het kunnen longitudinaal evalueren van de laesie-evolutie via niet-invasieve beeldvorming een groot voordeel bij het verminderen van het aantal benodigde dieren, evenals het maximaliseren van de informatie die van elk dier wordt verkregen4.
Fotoakoestische tomografie (PAT) is een hybride beeldvormingsmodaliteit die optisch absorptiecontrast combineert met ultrasone beeldvorming, ruimtelijke resolutie5. Het beeldvormingsmechanisme van PAT is als volgt. Een excitatielaserpuls wordt verlicht op het doel dat wordt afgebeeld. Ervan uitgaande dat het doelwit licht absorbeert op de golflengte van de excitatielaser, zal het in temperatuur toenemen. Deze snelle temperatuurstijging resulteert in een thermo-elastische uitzetting van het doelwit. De uitzetting zorgt ervoor dat een ultrasone golf zich voortplant vanuit het doelwit. Door de ultrasone golf op veel posities te detecteren, kan de tijd die nodig is om de golf van het doel naar de detectoren te verspreiden, worden gebruikt om een beeld te maken via een reconstructiealgoritme. Het vermogen van PAT om optische absorptie in diepe weefselgebieden te detecteren, onderscheidt PAT van echografie, die grenzen van verschillende akoestische impedanties van weefsels detecteert5. In de zichtbare en nabij-infrarode spectra zijn de primaire sterk absorberende biomoleculen die overvloedig aanwezig zijn in organismen hemoglobine, lipiden, melanine en water7. Van bijzonder belang bij de studie van beroerte is hemoglobine. Omdat oxyhemoglobine en deoxyhemoglobine verschillende optische absorptiespectra hebben, kan PAT worden gebruikt met meerdere excitatielasergolflengten om de relatieve concentratie van de twee toestanden van het eiwit te bepalen. Hierdoor kan de zuurstofverzadiging van hemoglobine (sO2), of bloedoxygenatie, worden gekwantificeerd in en buiten het infarctgebied 8,9. Dit is een belangrijke maat bij ischemische beroerte, omdat het het zuurstofgehalte in het beschadigde hersenweefsel na ischemie kan aangeven.
Akoestische angiografie (AA) is een contrastversterkte ultrasone beeldvormingsmethode die bijzonder nuttig is voor het in beeld brengen van de morfologie van vasculatuur in vivo10. De methode is gebaseerd op het gebruik van een twee-element wobbler-transducer (een laagfrequent element en een hoogfrequent element) in combinatie met microbubbels die in de bloedsomloop van de beeldvormende persoon worden geïnjecteerd. Het laagfrequente element van de transducer wordt gebruikt voor het uitzenden op de resonantiefrequentie van de microbubbels (bijv. 2 MHz), terwijl het hoogfrequente element wordt gebruikt om de superharmonische signalen van de microbubbels (bijv. 26 MHz) te ontvangen. Wanneer ze worden geëxciteerd met een resonantiefrequentie, hebben de microbubbels een sterke niet-lineaire respons, wat resulteert in de productie van superharmonische signalen die omliggende lichaamsweefsels niet produceren11. Door te ontvangen met een hoogfrequent element zorgt dit ervoor dat alleen de microbubbelsignalen worden gedetecteerd. Omdat de microbubbels beperkt zijn tot de bloedvaten, is het resultaat een angiografisch beeld van de morfologie van bloedvaten. AA is een krachtige methode voor het afbeelden van ischemische beroerte, omdat de microbubbels die door de bloedsomloop stromen niet door geblokkeerde bloedvaten kunnen stromen. Hierdoor kan AA gebieden van de hersenen detecteren die niet doordrenkt zijn als gevolg van ischemische beroerte, wat het infarctgebied aangeeft.
Preklinisch ischemisch beroerteonderzoek is over het algemeen afhankelijk van het gebruik van histologie en gedragstesten om de locatie en ernst van de beroerte te beoordelen. Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring is een veel voorkomende histologische analyse die wordt gebruikt om het slaginfarctvolume te bepalen. Het kan echter alleen op een eindpunt worden gebruikt, omdat het vereist dat het dier wordt geëuthanaseerd12. Gedragstests kunnen worden gebruikt om motorische functiestoornissen op meerdere tijdstippen te bepalen, maar ze kunnen geen kwantitatieve anatomische of fysiologische waarden opleveren13. Biomedische beeldvorming biedt een meer kwantitatieve benadering voor het bestuderen van de effecten van ischemische beroerte niet-invasief en longitudinaal 9,14,15. Bestaande beeldvormingstechnologieën (zoals magnetische resonantiebeeldvorming bij kleine dieren [MRI]) kunnen echter hoge kosten met zich meebrengen, niet in staat zijn om gelijktijdige structurele en functionele informatie te verstrekken of een beperkte penetratiediepte hebben (zoals de meeste optische beeldvormingstechnieken).
Hier combineren we fotoakoestische, ultrasone en angiografische tomografie (PAUSAT; zie systeemdiagram in figuur 1), die aanvullende structurele en functionele informatie van bloedperfusie en oxygenatie na ischemische beroerte mogelijk maakt16. Dit zijn twee belangrijke aspecten bij het beoordelen van de ernst van het letsel en het monitoren van het herstel of de reactie op behandelingen. Het gebruik van deze geïntegreerde beeldvormingsmethoden kan de hoeveelheid informatie die door elk dier wordt verkregen verhogen, waardoor het aantal benodigde dieren wordt verminderd en meer informatie wordt verstrekt in de studie van mogelijke behandelingen voor ischemische beroerte.
Figuur 1: PAUSAT-diagram . (A) Volledig schema van het PAUSAT-systeem, met inbegrip van de laser en OPO die voor PAT worden gebruikt. (B) Binnenaanzicht van het PAUSAT-systeem, inclusief twee ultrasone transducers. De dual-element wobbler transducer wordt gebruikt voor zowel B-mode echografie als AA, en de lineaire-array transducer wordt gebruikt voor PAT. Beide transducers zijn gemonteerd op dezelfde 2D-gemotoriseerde trap, waardoor scannen volumetrische gegevens kan genereren. Dit cijfer is gewijzigd van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Duke University Medical Center Animal Care and Use Committee en werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de United States Public Health Service inzake humane zorg en gebruik van proefdieren. Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J muizen (zie tabel met materialen) werden gebruikt voor deze studies. Per slagmodelgroep werden minimaal drie dieren in beeld gebracht. Zie figuur 2 voor de workflow die in dit protocol wordt gevolgd.
Figuur 2: Samenvatting van de experimentele procedure voor PAUSAT-beeldvorming toegepast op beroerte. Gemaakt met Biorender.com. De figuur toont de workflow van de beeldvormingsprocedure vanaf (A) de twee belangrijkste beroertemodellen (pMCAO en PT-beroerte). B) De microbubbels moeten retroorbitaal worden geïnjecteerd voordat het dier op het PAUSAT-membraan wordt geplaatst. (C) Een masker met continue anesthesie en een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van het dier stabiel te houden, zijn in deze opstelling vereist. Het lichaam van het dier wordt op het verwarmingskussen geplaatst terwijl het hoofd op het membraan van het systeem rust. (D) De volgorde van beeldacquisitie wordt ook weergegeven in de figuur. (E) TTC-kleuring wordt uitgevoerd om onze resultaten in deze studie te valideren. DPI: dagen na het letsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Het lijnmuismodel induceren
- Permanente occlusie van de middelste hersenslagader (pMCAO) met ligatie van de halsslagader (CCA).
OPMERKING: Voer in het kort permanente ligatie van de rechter CCA en posterieure elektrocauterisatie van de rechter middelste hersenslagader (MCA) uit17. Deze procedure beperkt de cerebrale bloedstroom in de rechter cortex van de hersenen, waardoor een ischemische beroerte ontstaat18.- Induceer anesthesie in een inductiekamer met behulp van een inhalatiemix van 5,0% isofluraan in 30% O 2/70% N2 tot bewustzijnsverlies (herkend als een verlies van de pedaalreflex).
- Intubeer het dier met behulp van een katheter van 20 G (Table of Materials) en sluit het aan op een automatische ventilator. Stel de stroomsnelheid in op basis van het lichaamsgewicht van het dier en houd het dier verdoofd met 1,5% -2,0% isofluraan in 30% O 2/70% N2.
- Houd met behulp van een verwarmingslamp en een rectale sonde die is aangesloten op een temperatuurregelaar de lichaamstemperatuur van het dier op 37 °C.
- Doe een druppel glijmiddel oogzalf op de ogen van de muis.
- Plaats het dier in rugligging en verwijder het haar uit het nekgebied met behulp van een haartrimmer.
- Reinig het huidgebied door eerst een wattenstaafje met povidon-jodium te gebruiken en vervolgens een steriel maandverband met 70% ethanol te gebruiken. Voer dit driemaal uit.
- Controleer de diepte van de anesthesie en de afwezigheid van pijn door de achterpoot van het dier lichtjes te knijpen.
- Maak een sagittale incisie van 0,8 cm op de middelste lijn van de nek en leg de rechter CCA bloot.
- Bereid een hechtdraad voor de CCA-ligatie voor door een 4-0 zijden hechtdraad te scheiden in dunnere draden die de hoofddraad vormen. Gebruik een lengte van 1,5 cm van een van de subthreads om het CCA permanent te ligateren.
OPMERKING: Verwijder na het aanspannen van de knoop overtollige draad door de verlenging op een afstand van 1-2 mm tot de knoop te snijden. - Breng een druppel bupivacaïne aan voordat u de wond sluit.
- Sluit de incisie met onderbroken 4-0 zijden chirurgische hechtingen en breng drievoudige antibiotische zalf aan op het oppervlak om infectie te voorkomen.
- Beweeg de muis om de rechter zijkant van het lichaam van het dier bloot te leggen.
-
Verwijder het haar in het gebied tussen het oor en de ogen met behulp van een haartrimmer.
-
Desinfecteer het operatiegebied met een wattenstaafje met povidon-jodium, gevolgd door een steriel maandverband met 70% ethanol. Herhaal deze stap drie keer.
-
Plaats een steriel gordijn om het operatiegebied vast te zetten. Maak vervolgens een incisie van 0,5 cm tussen het rechteroog en het oor van het dier, waardoor het gewricht tussen de schedel en de temporale spier wordt blootgesteld.
- Gebruik een cautery-lus om de spier te dichtschroeien om deze van de schedel te scheiden en het gebied van de MCA bloot te leggen.
- Boor een venster van 0,2 mm2 om de MCA bloot te leggen met behulp van een elektrische boormachine en gebruik elektrocautery op de MCA om de bloedstroom af te sluiten.
OPMERKING: Een enkele puls met een vermogensintensiteit van 80% is voldoende om de MCA te dichtschroeien. - Gebruik een spuit van 1 ml die is bevestigd aan een naald van 27 G en breng een druppel bupivacaïne (tabel met materialen) aan op de chirurgische plaats.
- Sluit de huidincisie met onderbroken 6-0 heldere monofilament-hechtingen en breng drievoudige antibiotische zalf aan op het oppervlak om infectie te voorkomen.
- Breng het dier na het voltooien van de operatie over naar een couveuse met gecontroleerde temperatuur (32 °C) en laat het dier herstellen.
- Breng het dier na 2 uur over naar zijn thuiskooi en geef ad libitum voedsel en water.
- Fototrombotische beroerte (PT-beroerte)
OPMERKING: Kortom, PT-beroerte wordt uitgevoerd door Rose Bengal in de bloedvaten in de hersenen te verlichten. Rose Bengal wordt intraperitoneaal toegediend en zodra het goed door het lichaam is verdeeld (5 min), wordt het verlicht door een groen koud licht, dat de Rose Bengal activeert om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te genereren. Deze ROS beschadigen het membraan van endotheelcellen, waardoor trombi ontstaan in het gehele verlichte gebied en leiden tot lokale verstoring van de cerebrale bloedstroom19.- Induceer anesthesie in een inductiekamer met behulp van een inhalatiemix van 5,0% isofluraan in 30% O 2/70% N2 tot bewustzijnsverlies (herkend als een verlies van de pedaalreflex).
- Stel het dier in op een stereotaxisch frame, houd het dier verdoofd met behulp van een masker en 1,5% -2,0% isofluraan in 30% O 2/70% N2.
- Houd het dier op 37 °C met behulp van een warmwaterrecirculatieverwarmer en een rectale sonde om de lichaamstemperatuur van het dier te meten.
- Doe een druppel glijmiddel oogzalf op de ogen van de muis.
- Scheer het hoofd van het dier met een haartrimmer.
- Reinig het geschoren hoofdhuidgebied drie keer, eerst met een wattenstaafje met povidon-jodium en vervolgens met een steriele pad met 70% ethanol.
- Controleer de afwezigheid van pijn door de achterpoot van het dier lichtjes te knijpen.
- Maak een sagittale incisie van 1,4 cm op de middelste lijn van de hoofdhuid met behulp van een scalpel en leg de schedel bloot.
- Maak met een scherp potlood een markering op 1,5 mm van de bregma naar de rechterkant.
- Plaats een cirkelvormig gaatje met een diameter van 2,5 mm gecentreerd op de markering van 1,5 mm.
OPMERKING: Een vierkant met een cirkelvormig gaatje kan worden gemaakt door dubbelzijdige zwarte tape te gebruiken en een opening met een diameter van 2,5 mm in het midden te maken met behulp van een ponsgereedschap met één gat van de genoemde grootte. - Plaats het groene koude licht op het ronde gaatje en beperk de opening tussen het licht en het gaatje tot een minimum.
- Bedek het gebied met aluminiumfolie om verspreiding van het licht te voorkomen.
- Zodra de opstelling klaar is, injecteert u het dier intraperitoneaal met 10 mg / kg Rose Bengal (10 mg / ml in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS]) en wacht u 5 minuten.
- Zet na 5 minuten de koude lichtbron aan (intensiteit: 4,25) en houd de belichting gedurende 15 minuten aan.
- Schakel vervolgens het koude licht uit en controleer de slag met het blote oog (het gebied zal naar verwachting witter zijn dan het omliggende gebied) of met behulp van externe apparaten om de cerebrale bloedstroom te meten (bijvoorbeeld door laserspikkelcontrastbeeldvorming te gebruiken (tabel met materialen; zie stap 5.1).
- Gebruik een spuit van 1 ml die is bevestigd aan een naald van 27 G en breng een druppel bupivacaïne (tabel met materialen) aan op de chirurgische plaats.
- Sluit de huidincisie met onderbroken 6-0 heldere monofilament-hechtingen en breng drievoudige antibiotische zalf aan op het oppervlak om infectie te voorkomen.
- Breng het dier na het voltooien van de operatie over naar een couveuse met gecontroleerde temperatuur (32 °C) en laat het dier herstellen.
- Breng het dier na 2 uur over naar zijn thuiskooi en geef ad libitum voedsel en water.
2. PAUSAT voorbereiden voor beeldvorming
- Zet de 532 nm laser aan en laat hem 15 minuten aanstaan om op te warmen.
- Bereid het beeldvormingsplatform voor op het verdoofde dier.
- Plaats een aangepaste oprijplaat (figuur 2C) die is bevestigd aan het handmatig instelbare podium (materiaaltabel) naast het beeldmembraan.
- Bevestig een muistandhouder met de beademingsbuis aangesloten op de aangepaste oprijplaat en bevestig een verwarmingskussen op het oppervlak van de oprit.
- Nadat de laser is opgewarmd, controleert u of het laserpad en de koppeling in de vezelbundel goed zijn uitgelijnd met behulp van een nabij-infrarooddetectorkaart (Materiaaltabel) door de kaart voor de vezelbundelingang te plaatsen en ervoor te zorgen dat het laserlicht de bundel binnenkomt.
OPMERKING: Pas eventuele laserpadspiegels indien nodig aan om ervoor te zorgen dat de laserinvoer is gecentreerd met de vezelbundelingang.
3. Het dier voorbereiden op PAUSAT
OPMERKING: PAUSAT wordt uitgevoerd 1 dag na PT-beroertechirurgie of 3 dagen na pMCAO-operatie. Het voorbereiden van PAUSAT voor beeldvorming (stap 2) duurt ongeveer 20 minuten en moet onmiddellijk worden gedaan voordat het dier wordt voorbereid op PAUSAT.
- Induceer anesthesie in een inductiekamer met behulp van een inhalatiemix van 5% isofluraan gemengd met 30% O 2/70% N2 tot bewustzijnsverlies (herkend als een verlies van de pedaalreflex).
- Breng het dier over naar een verwarmd platform met een tandhouder en een masker en houd de anesthesie op 1,5% -2,0% isofluraan in 30% O 2 / 70% N2.
- Gebruik een verwarmingslamp en een rectale sonde die zijn aangesloten op een temperatuurregelaar om de lichaamstemperatuur van het dier op 37 °C te houden.
- Trim het haar op de bovenkant van het hoofd van het dier met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Neem het gebied op van dichtbij de ogen tot achter de oren.
- Scheer het haar op de bovenkant van het hoofd van het dier door een commerciële ontharingscrème aan te brengen om het resterende korte haar volledig te verwijderen. Laat 5-6 minuten op de huid zitten en veeg vervolgens af met een wattenstaafje dat in water is gedept om de crème volledig te verwijderen. Herhaal dit totdat de huid vrij is van haar.
OPMERKING: Voor beeldvorming 1 dag na de operatie kunnen deze stappen worden uitgevoerd voordat de operatie wordt gestart; op 1 dag na PT-beroerte kunnen ze worden weggelaten. Wanneer PAUSAT-beeldacquisitie enkele dagen na de operatie wordt uitgevoerd, is deze stap van cruciaal belang om te worden uitgevoerd. - Zodra het dier en het systeem klaar zijn voor beeldvorming en vlak voordat het dier naar het platform van het systeem wordt overgebracht, injecteert u een 100 μL-oplossing van microbubbels in de voorraadconcentratie (materiaaltabel) retro-orbitaal met behulp van een naald van 27 G.
OPMERKING: Zodra de bellen in de bloedbaan in omloop zijn, is er een beperkte hoeveelheid tijd om te fotograferen zonder een significant verlies van signaal (~ 10 min). - Doe een druppel oogbeschermingslotion op de ogen van de muis.
OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om oogglijmiddel aan te brengen totdat de retro-orbitale injectie is uitgevoerd om te voorkomen dat vreemde stoffen de bloedbaan van het dier bereiken. Daarom moet het aanbrengen van ontharingscrème langzaam en voorzichtig worden uitgevoerd om te voorkomen dat u te dicht bij de ogen komt (maar voldoende om het interessegebied bloot te leggen waar de beroerte wordt verwacht). Het verwijderen van de haarcrème wordt uitgevoerd met een wattenstaafje dat eerder in water is gedept, waardoor wordt voorkomen dat de crème druipt, wat de ogen kan beschadigen.
4. PAUSAT-beeldvorming
OPMERKING: Dit wordt gedaan om de contra- en ipsi-laterale gebieden van de hersenen na een beroerte in beeld te brengen
- Breng de muis over naar het geïntegreerde PAUSAT-beeldplatform (Table of Materials) en plaats de muis in rugligging op de aangepaste helling (figuur 2C).
- Vul het beeldvenster met voldoende gedestilleerd water op het oppervlak voor akoestische koppeling.
OPMERKING: Een optionele oprijplaat geprint met een 3D-printer wordt aanbevolen om te voorkomen dat het lichaam van het dier nat wordt tijdens de beeldacquisitie en om het comfort van het dier te verbeteren. Het helpt ook bij het handhaven van een stabiele lichaamstemperatuur. Bovendien kan de oprijplaat worden bevestigd aan een handmatig podium (Materiaaltabel) om de brandpuntsdiepte van de wobblertransducer met twee elementen ten opzichte van de muiskop aan te passen. Het aangepaste opritontwerpbestand is op aanvraag beschikbaar voor de auteurs. - Bevestig de muizenkop in de tandhouder en zorg voor een goede anesthesie en luchtstroom.
- Houd met behulp van een verwarmingslamp en een rectale sonde die is aangesloten op een temperatuurregelaar de lichaamstemperatuur van het dier op 37 °C.
- Open de beeldvormingstoepassing (Table of Materials) en navigeer naar B-modus echografie.
- Gebruik het live echografievenster om de muishop handmatig in de gewenste positie aan te passen.
- Gebruik het live ultrasone venster om de hoogte van het podium aan te passen, zodat de brandpuntsdiepte van de transducer (19 mm) zich ongeveer in het midden van het te fotograferen gebied bevindt.
- Beeldvorming met B-modus echografie
- Pas de waarde van de ultrasone transmissiefrequentie in B-modus aan (gebruik voor deze onderzoeken 16 MHz).
- Voer de opgeslagen mapgegevens in de afbeeldingstoepassing in.
- Gebruik het zwevende vak om het gewenste gebied te selecteren voor de B-modus scan van de hersenen.
- Druk op de knop Statisch verwerven .
- Controleer de resultaten van de scan in de toepassing zodra de beeldacquisitie is voltooid om er zeker van te zijn dat het gewenste gebied is afgebeeld.
OPMERKING: Vermijd onnodige vertragingen bij het verkrijgen van B-modus beeldvorming om ervoor te zorgen dat een voldoende hoge concentratie microbubbels in de bloedbaan blijft voor de AA.
- Beeldvorming met AA
- Terug naar Beeldacquisitie.
- Ga over naar de akoestische angiografiemodus in de beeldbewerkingstoepassing (materiaalopgave).
- Voer de gewenste scanprotocolparameters in (de belangrijkste daarvan is de frameafstand en het aantal frames per positie, dat voor deze onderzoeken is ingesteld op respectievelijk 0,2 mm en 10).
- Druk op de knop Statisch verwerven .
OPMERKING: De AA-acquisitie duurt langer dan de B-modus echografie. - Zodra de scan is voltooid, controleert u de resultaten van de scan onder Beeldanalyse om er zeker van te zijn dat de beeldkwaliteit is zoals verwacht.
OPMERKING: Voor de AA-modus kan een representatiever volume van de hele hersenen worden verkregen door een tweede scan te herhalen op een andere brandpuntsdiepte in de hersenen en later de beelden opnieuw te combineren met de juiste nabewerking (zie figuur 3).
- Beeldvorming met fotoakoestische tomografie
- Open de toepassing optische parametrische oscillator (OPO) (Materiaaltabel) en stel deze in op 756 nm.
OPMERKING: OPO's kunnen gemakkelijk uit de kalibratie komen, dus zorg er voorafgaand aan het experiment voor dat de OPO correct is gekalibreerd met behulp van een onafhankelijke spectrometer. - Vertaal de lineaire-arraytransducer handmatig naar de eerder bepaalde coördinaten om ervoor te zorgen dat de wobblervolumes en de lineaire-arrayvolumes automatisch worden gecoregistreerd.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat een co-registratie-experiment met behulp van een fantoomraster vooraf wordt uitgevoerd om de exacte afstand te bepalen die nodig is om het stadium te vertalen, zodat de resulterende gegevens van beide transducers co-geregistreerd zijn in 3D. - Open de lasertoepassing en schakel de 532 nm-laser in.
- Meet met behulp van een laservermogensmeter de energie van de laseruitgang en zorg ervoor dat deze de gewenste energie is (~ 10 mJ per puls werd gebruikt voor deze onderzoeken).
- Selecteer de gewenste scanparameters voor PAT (stapgrootte van 0,4 mm, scanlengte van 20 mm en gemiddeld 10 frames per positie).
- Open het matlab-programma voor ultrasone gegevensverzameling (materiaaltabel) en druk op de knop Uitvoeren .
- Verkrijg de PAT-scan door op de knop Start te drukken.
- Zodra de scan is voltooid, opent u het MATLAB-opslagprogramma. Wijzig de opslagnaam in de gewenste bestandsnaam en druk op de knop Uitvoeren .
- Wijzig de OPO-golflengte in 798 nm en herhaal de stappen van 4.10.3 tot 4.10.8.
OPMERKING: Voor een longitudinaal onderzoek wordt aanbevolen het dier te laten herstellen door het in een couveuse te plaatsen en gedurende enkele uren onder observatie te plaatsen (volgens de stappen 1.1.18 en 1.1.19). Als resultaatvalidatie gewenst is, ga dan onmiddellijk na de PAUSAT-beeldvorming verder met rubriek 5.
- Open de toepassing optische parametrische oscillator (OPO) (Materiaaltabel) en stel deze in op 756 nm.
5. Optioneel: Validatie van resultaten
- Laser spikkelcontrast beeldvorming (LSCI).
- Verdoof het dier met 1,5%-2,0% isofluraan in 30% O 2/70% N2.
- Stel het dier in op een stereotaxisch frame, waarbij het dier verdoofd blijft met behulp van een masker en de bovengenoemde inhalatie-anesthesie.
- Houd het dier op 37 °C met behulp van een warmwaterrecirculatieverwarmer en een rectale sonde om de lichaamstemperatuur van het dier te meten.
- Doe een druppel oogbeschermingslotion op de ogen van de muis.
- Controleer de afwezigheid van pijn door de achterpoot van het dier lichtjes te knijpen.
- Verwijder het haar op de hoofdhuid van het dier met behulp van een haartrimmer.
- Desinfecteer het operatiegebied met een wattenstaafje met povidon-jodium, gevolgd door een steriel maandverband met 70% ethanol. Herhaal deze stap drie keer.
- Maak een sagittale incisie van 1,4 mm op de middelste lijn van de hoofdhuid en leg de schedel bloot. Gebruik een tang om de hoofdhuid vast te houden en te voorkomen dat deze het gebied van de hersenen bezet om te scannen.
- Breng enkele druppels zoutoplossing aan op de schedel en plaats het laserspikkelcontrastsysteem (Table of Materials) over het hoofd van het dier.
- Stel het apparaat in het menu Bestand in onlinemodus in, in het submenu Werkmodus.
- Selecteer de standaardopslagmap voor afbeeldingen in het menu Bestand en het submenu Instellingen opslaan .
- Sluit in het menu Lichtbron de geleidingslaser ("Laser aan") en het witte licht ("Wit-licht aan") aan om het beeldvenster op de juiste positie te plaatsen.
- Selecteer in het menu Instellingen de optie Vergrotingsinstellingen, verplaats de cursor handmatig naar 2.5 en druk op Toepassen en OK om de instellingen op te slaan.
- Pas de focus aan door de focusbalk in het bovenste submenu van de hoofdpagina handmatig te verplaatsen.
- Selecteer in het menu Instelling de optie Pseudo-kleurdrempelinstelling, pas de drempelwaarde naar wens aan en druk op Toepassen en OK om de instellingen op te slaan.
- Koppel in het menu Lichtbron de geleidingslaser ("Laser uit") en het witte licht ("Witlicht uit") los voordat u de afbeelding vastlegt.
- Leg de afbeelding vast door het symbool Afspelen te selecteren in het bovenste submenu van de hoofdpagina.
- Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring
- Verdoof het dier diep met 5% isofluraan in 30% O 2/70% N2.
- Zodra het dier is gestopt met ademen, onthoofd het dan met een scherpe schaar.
- Verwijder alle huid rond het hoofd en de spieren in het nekgebied.
- Maak een sagittale snede in het achterhoofdsgedeelte van de schedel totdat deze het pariëtale bot bereikt.
- Maak een horizontale snede (~ 5 mm) in de linker- en rechterkant onder het bloedvat. Verwijder het achterhoofdsbeen van de schedel met een rechte tang.
- Maak een snee (~5 mm) bij de frontonale hechting van de schedel.
- Maak een sagittale snede (~ 10-15 mm) in de middellijn van de schedel - tussen hemisferen - en zorg ervoor dat ze volledig gescheiden zijn.
- Verwijder met een gebogen schaar maat # 7 de pariëtale linker- en rechterbotten van de schedel van het midden naar de zijkanten.
- Breng de hersenen over in een container gevuld met 5 ml ijskoud 1x PBS en houd het 10 minuten op ijs.
- Breng de hersenen over naar een roestvrijstalen hersenmatrix (1 mm dikke secties).
- Sectie de hersenen in 1 mm coronale secties met behulp van wegwerp scheermesjes (Tabel met materialen).
- Houd de messen aan hun zijkanten en breng ze over in een container gevuld met ijskoude 1x PBS.
- Scheid de secties zorgvuldig één voor één van de messen.
- Breng de hersenschijfjes over in een petrischaaltje met een diameter van 70 mm met 5 ml 2% TTC (Table of Materials, 3) in 1x PBS.
- Incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur (R/T).
- Gooi na 15 minuten de TTC weg, vervang deze door 3 ml formaline en incubeer in het donker gedurende ten minste 30 minuten bij R / T.
- Breng ten slotte de hersenplakken over op een transparante plastic film en scan de monsters, inclusief een liniaal in het scanbeeld als referentie voor toekomstige metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beeldvorming van de morfologie van bloedvaten in de hersenen
AA genereert beelden van bloedvatmorfologie door microbubbels in de bloedsomloop te prikkelen op hun resonantiefrequentie en de superharmonische respons van de microbubbels te ontvangen. Door gebruik te maken van de aangepaste helling (figuur 2C) die is bevestigd aan een handmatig instelbaar podium, kunnen we het muizenbrein met AA-modus op twee verschillende brandpuntsdiepten in beeld brengen. Wanneer diepere gebieden worden gericht, vertonen meer oppervlakkige gebieden (zoals de hersenschors) een slechtere resolutie en signaalsterkte (figuur 3A) en vice versa (figuur 3B). Door echter twee brandpuntsdieptes te verkrijgen en deze te combineren, kunnen AA-beelden informatie geven over een hele coronale sectie (figuur 3C, D). Bovendien kan PAUSAT, door de gemotoriseerde trap te gebruiken om langs een derde dimensie te scannen, een reeks coronale beelden registreren die de door de gebruiker gedefinieerde regio van belang (ROI) bestrijken. Deze reeksen afbeeldingen kunnen worden uitgelijnd en gebruikt om een 3D-weergave van het hele brein te visualiseren, of de ROI die door de gebruiker is gedefinieerd. Aanvullende resultaten die aantonen dat andere kwantitatieve metingen (zoals het slagvolume) kunnen worden geanalyseerd met behulp van de 3D-informatie uit de compilatie van afbeeldingen die door PAUSAT zijn verkregen, worden hier echter ook verstrekt.
Anatomische en functionele evaluatie voor en na ischemische beroerte
Om het potentieel van het PAUSAT-systeem in preklinische studies te illustreren, bestudeerden we twee groepen dieren die werden onderworpen aan een van de hier geanalyseerde modellen van ischemische beroerte: pMCAO of PT-beroerte. Deze tweetaktmodellen verschillen in de principes waarmee het ischemische gebied wordt gecreëerd. Kortom, in het pMCAO-model wordt de middelste hersenslagader elektro-dichtgeschroeid, waardoor de bloedtoevoer van deze slagader naar de hersenen wordt gestopt. Deze verwonding veroorzaakt een secundaire verwonding, waarbij het omliggende weefsel ischemisch wordt, waardoor het gebied dat door de beroerte wordt beïnvloed, wordt vergroot. We besloten om de hersenen van de pMCAO-beroerte op dag drie na de beroerte in beeld te brengen, omdat dit het moment is waarop het maximale gebied dat naar verwachting door de beroerte zal worden beïnvloed, wordt bereikt. Bij de PT-beroerte wordt echter het maximale gebied van weefsel dat door de beroerte is aangetast, na de eerste dag bereikt, dus besloten we om PT-beroerte op dag één na de beroerte in beeld te brengen. Hoewel we deze tijdspunten in onze studie hebben gekozen, kan PAUSAT worden gebruikt voor longitudinale monitoring van beroerte op elk gewenst tijdstip.
Eerst werd een B-modus scan verkregen om de juiste positie van het hoofd van het dier te garanderen en de ruimtelijke grenzen tussen de schedel en de hersenen te identificeren (figuur 4A en figuur 5A). Het meest voorste deel van de hersenen dat in beeld wordt gebracht, omvat de frontonasale hechting van de schedel als referentiepunt. Een ROI van 20 mm (voor- naar achterste) x 17,15 mm (lateraal) naar links (contralateraal; CL) en rechts (ipsilateraal; IL) hemisferen werden gedefinieerd in de volgende studies om het beroertegebied te lokaliseren. AA-beelden gaven informatie over de bloedvatstructuren door zich te richten op het signaal van de circulerende microbubbels. Onze resultaten laten zien dat in de niet-gewonde hersenen (baseline) beide hemisferen een vergelijkbare verdeling van bloedvaten vertonen (figuur 4B en figuur 5B), zoals verwacht bij afwezigheid van letsel. Een vergelijkbaar resultaat wordt waargenomen voor de verdeling van de weefseloxygenatiekaart op basis van PA-beelden verkregen op twee verschillende golflengten (figuur 4C en figuur 5C). We besloten om twee verschillende golflengten te evalueren op basis van de lokale maximale optische absorptie voor gedeoxygeneerd hemoglobine (756 nm) en de golflengte waarop het gedeoxygeneerde en zuurstofrijke hemoglobine gelijke optische absorptie (798 nm)20 vertoonde. Door deze twee toestanden van hemoglobine vast te leggen, kunnen we de weefseloxygenatie nauwkeurig schatten (figuur 4D en figuur 5D).
De dag na het verkrijgen van het basislijnbeeld van de hersenen, voerden we een operatie uit op het dier (pMCAO- of PT-beroerte), zoals beschreven in de vorige secties. Een nieuwe reeks afbeeldingen werd verkregen op een specifiek tijdstip na de slag (zie figuur 2A) om de locatie en grootte van de slag te evalueren. De AA-beelden verkregen van muizen onderworpen aan pMCAO tonen een opmerkelijke vermindering van de intensiteit van het signaal in de rechter laterale van de cortex (figuur 4B). Hetzelfde gebied toont een vermindering van de weefseloxygenatiekaart van PA-beelden, wat een ischemisch gebied suggereert (figuur 4D). Om onze resultaten te valideren, hebben we besloten om de hersenen te oogsten en TTC-kleuring uit te voeren onmiddellijk na het verkrijgen van de beelden van het beroertedier. Onze resultaten tonen aan dat het gebied dat als beroerte is geïdentificeerd, vergelijkbaar is in vergelijking met onze resultaten door PAUSAT en de gevestigde TTC-kleuring (figuur 4B-E). We tonen hier ook aan dat PAUSAT beroertegebieden in de hersenen kan identificeren met behulp van een tweede model van beroerte, PT-beroerte, geëvalueerd op een eerder tijdstip na beroerte-inductie (1 dag). Zoals te zien is in figuur 5B, konden we een regio in het bovenste deel van de cortex identificeren met een verminderde bloedstroomtoevoer en een gelijktijdige afname van de zuurstofverzadiging (figuur 5D). De resultaten verkregen uit TTC-kleuring komen overeen met de locatie en grootte van de beroerte die eerder door PAUSAT is geïdentificeerd (figuur 5B-E).
De leeftijd van de muis die wordt afgebeeld, kan de beeldkwaliteit sterk beïnvloeden. De schedel van een muis wordt dikker met de leeftijd, en omdat de schedel een significant andere akoestische impedantie heeft ten opzichte van zacht weefsel, wordt een groot percentage van de ultrasone golven gereflecteerd op de schedelgrens. Omdat deze geïntegreerde beeldvormingssystemen allemaal akoestisch zijn gebaseerd, leidt dit tot een afname van de beelddiepte voor oudere muizen. Dit is duidelijk te zien in figuur 6, waar muizen van drie verschillende leeftijden onder dezelfde omstandigheden met AA werden afgebeeld. Vergelijkbare resultaten met een laag signaal worden verwacht als de beeldvormingsprocedure niet wordt gevolgd zoals eerder beschreven.
Kwantitatieve analyse van het slagvolume door PAUSAT
Zoals beschreven in de bovengenoemde resultaten, legt PAUSAT een reeks coronale beelden vast die gericht zijn op een ROI die door de gebruiker wordt beschreven. We analyseerden het slagvolume door het slaggebied binnen de verschillende coronale afbeeldingen en de afstand tussen afbeeldingen te berekenen. Het door PAUSAT berekende slagvolume vertoont geen statistisch verschil (p < 0,05) ten opzichte van het slagvolume berekend op basis van een vergelijkbare benadering met behulp van TTC-kleuringsafbeeldingen (figuur 7).
Figuur 3: Effect van de scherptediepte van de wobblertransducer op de kwaliteit van AA-beelden. Beelden met meerdere brandpuntsdiepten kunnen worden verkregen en later worden gecombineerd om de beste beeldvormingsresultaten voor de hele hersenen te produceren. (A) AA coronale sectie verkregen bij een diepere brandpuntsdiepte. (B) AA coronale sectie verkregen bij een meer oppervlakkige brandpuntsdiepte. (C) Resultaat van het samenvoegen van diepere focus (groen) en meer oppervlakkig gerichte (magenta) beelden. (D) Resultaat van het combineren van diepere focus en meer oppervlakkig gerichte afbeeldingen met een pixelschaalwaarde vergelijkbaar met (A) en (B). Dit cijfer is gewijzigd van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve PAUSAT-resultaten van een muizenbrein voor en na een pMCAO-beroerte . (A) Baseline en post-stroke B-mode echografie coronale beelden. (B) Baseline en post-beroerte AA coronale beelden. (C) Baseline en post-stroke PA coronale beelden bij 756 nm excitatie. (D) Zuurstofsaturatiekaart gebaseerd op excitatiebeelden van 756 nm en 798 nm. (E) TTC gekleurde delen van een muizenbrein, met hetzelfde gebied van beroerte. De afstand tussen de lijnen aan de onderkant van de afbeelding vertegenwoordigt 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve PAUSAT-resultaten van een muis voor en na PT-beroerte . (A) Baseline en post-stroke B-mode echografie coronale beelden. (B) Baseline en post-beroerte AA coronale beelden. (C) Baseline en post-stroke PA coronale beelden bij 756 nm excitatie. (D) Zuurstofsaturatiekaart gebaseerd op excitatiebeelden van 756 nm en 798 nm. (E) TTC gekleurde delen van een muizenbrein, met hetzelfde gebied van beroerte. De afstand tussen de lijnen aan de onderkant van de afbeelding vertegenwoordigt 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Effect van muisleeftijd op de kwaliteit van AA-beelden. Deze figuur toont het verschil in AA-signaalintensiteit en beelddiepte wanneer dieren van verschillende leeftijden onder vergelijkbare omstandigheden in beeld worden gebracht. Zoals te zien is in de figuur, produceert beeldvorming van oudere muizen (18 maanden) beelden van lagere kwaliteit vanwege de grootte en dikte van de schedel in vergelijking met jongere muizen (1,5 maanden), terwijl volwassen muizen een tussensignaal vertonen (6 maanden). Vanwege de grote akoestische impedantiemismatch tussen de schedel en het hersenweefsel, worden ultrasone golven die zich door de schedel voortplanten gereflecteerd en gebroken, wat leidt tot signaalverlies en resolutiedegradatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Analyse van het volume van de ischemische beroerte. (A) Voorbeeld van TTC-secties van PT-lijn en bijbehorende TTC-gesegmenteerde afbeeldingen, AA-afbeeldingen en AA-gesegmenteerde afbeeldingen op vergelijkbare coronale locaties. (B) Het slagvolume berekend op basis van TTC- en AA-beelden voor pMCAO- en PT-beroerte, zonder significante verschillen (p > 0,05). De grafiek toont het gemiddelde ± de standaarddeviatie (S.D.) (n = 3 dieren per groep). Dit cijfer is gewijzigd van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een paar essentiële aspecten van deze methode die, als ze verkeerd worden uitgevoerd, kunnen leiden tot een aanzienlijk verminderde beeldkwaliteit en kwantitatieve analyse. Het meest voorkomende gevolg van een gebruikersfout in PAUSAT-afbeeldingen is een gebrek aan signaal of een zeer lage signaalsterkte, die beide om verschillende redenen kunnen optreden. Een van die redenen is een probleem met de akoestische koppeling. Grote luchtbellen in het water rond het hoofd van de muis tijdens het beeldvorming kunnen vaak voorkomen dat de echografie van of naar de transducer reist, waardoor een schaduwgebied in het resulterende beeld ontstaat voor alle drie de modaliteiten van het systeem. Dit kan worden voorkomen door ervoor te zorgen dat er voldoende water aanwezig is tussen het systeemmembraan en het te fotograferen monster. Het kan ook voorkomen dat er een gebrek is aan AA-signaal, maar een verrassend hoog PA-signaal, onafhankelijk van de gebruikte golflengten. Dit kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van haar - vooral donker haar - dat de absorptie van het licht verstoort. Om dit te voorkomen, is het noodzakelijk om het hoofd van het dier eerder te hebben geschoren totdat er geen haar visueel identificeerbaar is.
Met betrekking tot AA-beelden is een ander probleem dat kan optreden en zou leiden tot het ontbreken van of een zeer laag signaal, een lage concentratie microbubbels in de bloedsomloop. Als de microbubbels te verdund zijn of als ze onjuist zijn geïnjecteerd, zal het resulterende signaal erg zwak zijn. De retro-orbitale injectie mag alleen worden uitgevoerd door goed opgeleid personeel. Een andere reden kan een lange periode zijn tussen microbubbelinjectie en het begin van beeldvorming, wat kan leiden tot een vermindering van de microbubbels in de bloedbaan. Om dit te voorkomen, wordt aanbevolen om het systeem voor te bereiden op beeldvorming voordat de microbubbels worden geïnjecteerd, zodat het dier onmiddellijk na injectie naar het PAUSAT-systeemmembraan kan worden overgebracht. Het is vermeldenswaard dat alternatieve intraveneuze routes (zoals staartaderinjectie) ook kunnen worden gebruikt zodra het dier al op het PAUSAT-systeemmembraan is geplaatst, waardoor de tijd tussen injectie en beeldvorming wordt verkort. Bovendien, in het belang van het handhaven van de maximale concentratie van microbubbels mogelijk, wordt het ook aanbevolen om de AA-beeldvorming uit te voeren vóór de PA-beeldvorming.
Het PA-signaal kan ook worden beïnvloed als de noodzakelijke stappen niet goed worden uitgevoerd. Een van de problemen betreft de kwaliteit van de excitatielaser. De twee belangrijkste componenten die de laserbron beschrijven zijn de pulsenergie en de golflengte. Het wordt ten zeerste aanbevolen om een onafhankelijke vermogensmeter en spectrometer te gebruiken om deze hoeveelheden te meten en ervoor te zorgen dat ze op de gewenste waarden zijn ingesteld. Als een onjuiste waarde wordt aangenomen, leveren de functionele berekeningen misleidende resultaten op.
Het is ook mogelijk dat wanneer AA- en PA-afbeeldingen worden gecombineerd, ze niet op één lijn liggen. De belangrijkste reden hiervoor is dat de coördinaten tussen de transducers niet nauwkeurig waren. Om dit te voorkomen, is het van cruciaal belang om vooraf de vereiste experimenten uit te voeren met behulp van een fantoomraster om de exacte coördinaten te bepalen voor een succesvolle co-registratie van AA- en PA-beelden. Een andere mogelijke bron van onnauwkeurigheid is te wijten aan een onjuiste kalibratie van de OPO. Om dit te beperken, moet de OPO correct worden gekalibreerd met behulp van een onafhankelijke spectrometer.
Er zijn nog belangrijke verbeterpunten, met name wat betreft de beeldkwaliteit van de PAT-component van dit geïntegreerde systeem. Het huidige PAT-systeem is gebaseerd op een lineaire configuratie voor scanning. We zijn in staat om grootschalige verschillen in de oxygenatie van infarct versus gezonde gebieden van de hersenen te observeren met behulp van verschillende beroertemuismodellen, maar de gedetailleerde vasculatuur (microvessels) is niet te zien. Er zijn twee belangrijke problemen die bijdragen aan deze lage beeldkwaliteit. Het eerste is het probleem van het beperkte zicht. Om een volledig gereconstrueerd beeld van een monster in PAT te maken, moet de detector het object volledig omringen (of een vaste hoek van 4π hebben). In de experimentele setting is dit echter moeilijk. Dit geeft aanleiding tot het beperkte zichtprobleem, wat leidt tot bloedvaten die orthogonaal zijn aan de transducerarray, die niet detecteerbaar zijn21. Er bestaan oplossingen om de effecten van het probleem met beperkt zicht in lineaire array-PAT te verminderen, waarvan het gebruik van microbubbels als virtuele puntbronnen de meest veelbelovende is22. Het tweede probleem van lineaire-array PAT is een slechte hoogteresolutie en gevoeligheid, vanwege de zwakke focus van de akoestische lens. Het is echter aangetoond dat het gebruik van single-slit diffractie in het hardwareontwerp van een lineair-arraysysteem isotrope resolutie en gevoeligheid creëert voor lineaire array PAT23,24. Van deep learning-benaderingen is ook aangetoond dat ze zowel het probleem met beperkt zicht als de slechte hoogteresolutie van lineaire array PAT25,26,27 gedeeltelijk oplossen. De combinatie van deze oplossingen zou de beeldkwaliteit van de PAT-component van ons geïntegreerde beeldvormingssysteem aanzienlijk verbeteren.
Hier hebben we een nieuwe niet-invasieve multimodale beeldvormingsmethode gepresenteerd voor de structurele en functionele kwantificering van ischemische beroerte in de preklinische setting. Door middel van AA is duidelijke morfologie en perfusiekartering van bloedvaten in het muizenbrein mogelijk. Een lokaal gedefinieerd gebrek aan signaal kan wijzen op een infarctgebied waar sprake is van verminderde bloedperfusie, waardoor het infarctvolume niet-invasief en longitudinaal kan worden geschat. Via PAT kan de zuurstofverzadiging van hemoglobine worden gemeten in- en buiten het beroertegebied, waarbij de hypoxische toestand van hersenweefsels in het infarctgebied wordt weergegeven. Deze methode van beeldvorming van de hele hersenen is goedkoop met betrekking tot sommige alternatieven, zoals MRI van kleine dieren. Bovendien maakt het de combinatie van functionele en structurele informatie in diep weefsel mogelijk die andere preklinische beeldvormingsapparaten niet kunnen bereiken. In vergelijking met histologische analyses maakt deze methode het mogelijk om deze metrieken longitudinaal en op meerdere tijdstippen te meten, in tegenstelling tot op een enkel eindpunt. Het vermogen om dit te doen zal ongekende kwantitatieve details bieden in de preklinische studie van ischemische beroerte. Bovendien kan het structurele en functionele beeldvormingsvermogen van dit systeem worden toegepast op veel preklinische studies na ischemische beroerte28. Elke ziektetoestand of biologisch fenomeen dat het vasculaire systeem beïnvloedt, kan diepgaand worden bestudeerd met behulp van PAUSAT, waardoor het een krachtig preklinisch beeldvormingsinstrument is dat kan worden vertaald naar vele andere preklinische velden (bijv. Kanker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling in dit werk.
Acknowledgments
De auteurs willen het engineeringteam van SonoVol Inc. bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk gesponsord door de American Heart Association Collaborative Sciences Award (18CSA34080277), aan J. Yao en W. Yang; De National Institutes of Health (NIH) van de Verenigde Staten verleent R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; De CAREER Award van de United States National Science Foundation (NSF) 2144788; de Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178), aan J. Yao; en NIH verleent R21NS127163 en R01NS099590 aan W. Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
References
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 87 (1), 179-197 (2007).
- Vander Worp, H. B., van Gijn, J. Clinical Practice. Acute ischemic stroke. The New England Journal of Medicine. 357 (6), 572-579 (2007).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Hochrainer, K., Yang, W. Stroke proteomics: from discovery to diagnostic and therapeutic applications. Circulation Research. 130 (8), 1145-1166 (2022).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nature Methods. 13 (8), 627-638 (2016).
- Aldrich, J. E.
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37-R61 (2013).
- Li, M., Tang, Y., Yao, J. Photoacoustic tomography of blood oxygenation: a mini review. Photoacoustics. 10, 65-73 (2018).
- Menozzi, L., Yang, W., Feng, W., Yao, J. Sound out the impaired perfusion: Photoacoustic imaging in preclinical ischemic stroke. Frontiers in Neuroscience. 16, 1055552 (2022).
- Gessner, R. C., Frederick, C. B., Foster, F. S., Dayton, P. A. Acoustic angiography: a new imaging modality for assessing microvasculature architecture. International Journal of Biomedical Imaging. 2013, 936593 (2013).
- Dayton, P. A., Rychak, J. J. Molecular ultrasound imaging using microbubble contrast agents. Frontiers in Bioscience. 12, 5124-5142 (2007).
- Isayama, K., Pitts, L. H., Nishimura, M. C. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyitetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts. Stroke. 22 (11), 1394-1398 (1991).
- Ruan, J., Yao, Y. Behavioral tests in rodent models of stroke. Brain Hemorrhages. 1 (4), 171-184 (2020).
- Parthasarathy, A. B., Kazmi, S. M. S., Dunn, A. K. Quantitative imaging of ischemic stroke through thinned skull in mice with Multi Exposure Speckle Imaging. Biomedical Optics Express. 1 (1), 246-259 (2010).
- Hingot, V., et al. Early ultrafast ultrasound imaging of cerebral perfusion correlates with ischemic stroke outcomes and responses to treatment in mice. Theranostics. 10 (17), 7480-7491 (2020).
- Menozzi, L., et al. Three-dimensional non-invasive brain imaging of ischemic stroke by integrated photoacoustic, ultrasound and angiographic tomography (PAUSAT). Photoacoustics. 29, 100444 (2022).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments. (89), e51729 (2014).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Labat-Gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments. (76), e50370 (2013).
- Matsumoto, Y., et al. Visualising peripheral arterioles and venules through high-resolution and large-area photoacoustic imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14930 (2018).
- Xu, Y., Wang, L. V., Ambartsoumian, G., Kuchment, P.
- Yal Tang,, et al. High-fidelity deep functional photoacoustic tomography enhanced by virtual point sources. Photoacoustics. 29, 100450 (2023).
- Zheng, W., Huang, C., Zhang, H., Xia, J. Slit-based photoacoustic tomography with co-planar light illumination and acoustic detection for high-resolution vascular imaging in human using a linear transducer array. Biomedical Engineering Letters. 12 (2), 125-133 (2022).
- Wang, Y., et al. Slit-enabled linear-array photoacoustic tomography with near isotropic spatial resolution in three dimensions. Optics Letters. 41 (1), 127-130 (2016).
- Vu, T., Li, M., Humayun, H., Zhou, Y., Yao, J. A generative adversarial network for artifact removal in photoacoustic computed tomography with a linear-array transducer. Experimental Biology and Medicine. 245 (7), 597-605 (2020).
- Zhang, H., et al. Deep-E: A fully-dense neural network for improving the elevation resolution in linear-array-based photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (5), 1279-1288 (2022).
- Hauptmann, A., et al. Model-based learning for accelerated, limited-view 3-D photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (6), 1382-1393 (2018).
- Li, M., et al. Three-dimensional deep-tissue functional and molecular imaging by integrated photoacoustic, ultrasound, and angiographic tomography (PAUSAT). IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (10), 2704-2714 (2022).
