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Neuroscience

Tomografía fotoacústica, ecográfica y angiográfica integrada (PAUSAT) para imágenes cerebrales completas no invasivas del accidente cerebrovascular isquémico

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65319
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Este trabajo demuestra el uso de una plataforma de imágenes multimodal basada en ultrasonido para imágenes no invasivas de accidentes cerebrovasculares isquémicos. Este sistema permite la cuantificación de la oxigenación de la sangre a través de imágenes fotoacústicas y la perfusión deteriorada en el cerebro a través de la angiografía acústica.

Abstract

Aquí se presenta un estudio experimental de accidente cerebrovascular isquémico utilizando nuestro sistema de imágenes no invasivo recientemente desarrollado que integra tres tecnologías de imágenes acústicas: fotoacústica, ultrasonido y tomografía angiográfica (PAUSAT). La combinación de estas tres modalidades ayuda a adquirir la tomografía fotoacústica multiespectral (PAT) de la oxigenación de la sangre cerebral, las imágenes de ultrasonido de alta frecuencia del tejido cerebral y la angiografía acústica de la perfusión sanguínea cerebral. La plataforma de imágenes multimodales permite el estudio de los cambios de perfusión cerebral y oxigenación en todo el cerebro del ratón después de un accidente cerebrovascular. Se evaluaron dos modelos de accidente cerebrovascular isquémico comúnmente utilizados: el modelo de oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO) y el modelo fototrombótico (TP). PAUSAT se utilizó para obtener imágenes de los mismos cerebros de ratón antes y después de un accidente cerebrovascular y analizar cuantitativamente ambos modelos de accidente cerebrovascular. Este sistema de imágenes fue capaz de mostrar claramente los cambios vasculares cerebrales después del accidente cerebrovascular isquémico, incluida la reducción significativa de la perfusión sanguínea y la oxigenación en la región del infarto del accidente cerebrovascular (ipsilateral) en comparación con el tejido no lesionado (contralateral). Los resultados fueron confirmados por imágenes de contraste moteado láser y tinción de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC). Además, el volumen del infarto de accidente cerebrovascular en ambos modelos de accidente cerebrovascular se midió y validó mediante tinción TTC como la verdad fundamental. A través de este estudio, hemos demostrado que PAUSAT puede ser una herramienta poderosa en estudios preclínicos no invasivos y longitudinales de accidente cerebrovascular isquémico.

Introduction

La sangre transporta oxígeno (a través de la proteína hemoglobina) y otros nutrientes importantes a los tejidos de nuestro cuerpo. Cuando se interrumpe el flujo de sangre a través de los tejidos (isquemia), puede producirse un daño grave a los tejidos, cuyos efectos más inmediatos se deben a la falta de oxígeno (hipoxia). El accidente cerebrovascular isquémico es el resultado de un flujo sanguíneo interrumpido a cierta región del cerebro. El daño cerebral resultante de un accidente cerebrovascular isquémico puede ocurrir a los pocos minutos de la obstrucción de un vaso, y a menudo puede tener efectos debilitantes y duraderos 1,2. Una estrategia muy valiosa para evaluar la fisiopatología después del accidente cerebrovascular isquémico e identificar y probar nuevos tratamientos es el uso de modelos de animales pequeños en el laboratorio. Los tratamientos descubiertos en el laboratorio tienen como objetivo traducirse al uso clínico y mejorar la vida de los pacientes. Sin embargo, el uso de animales en la investigación biomédica debe evaluarse cuidadosamente de acuerdo con los principios de las 3R de Russell y Burch: reemplazo, reducción y refinamiento3. El objetivo del componente de reducción es reducir el número de animales sin comprometer la recopilación de datos. Con esto en mente, poder evaluar longitudinalmente la evolución de la lesión a través de imágenes no invasivas permite una gran ventaja en la reducción del número de animales requeridos, así como maximizar la información obtenida de cada animal4.

La tomografía fotoacústica (PAT) es una modalidad de imagen híbrida que combina el contraste de absorción óptica con la resolución espacial de imágenes de ultrasonido5. El mecanismo de imagen de PAT es el siguiente. Un pulso láser de excitación se ilumina en el objetivo que se está fotografiando. Suponiendo que el objetivo absorbe la luz en la longitud de onda del láser de excitación, aumentará su temperatura. Este rápido aumento de la temperatura da como resultado una expansión termoelástica del objetivo. La expansión hace que una onda de ultrasonido se propague desde el objetivo. Al detectar la onda de ultrasonido en muchas posiciones, el tiempo requerido para que la onda se propague desde el objetivo a los detectores se puede utilizar para crear una imagen a través de un algoritmo de reconstrucción. La capacidad de PAT para detectar la absorción óptica en regiones de tejido profundo diferencia PAT de la imagen de ultrasonido, que detecta límites de diferentes impedancias acústicas de los tejidos5. En los espectros visible e infrarrojo cercano, las principales biomoléculas altamente absorbentes que son abundantes en los organismos son la hemoglobina, los lípidos, la melanina y el agua7. De particular interés en el estudio del accidente cerebrovascular es la hemoglobina. Dado que la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina tienen diferentes espectros de absorción óptica, PAT se puede usar con múltiples longitudes de onda láser de excitación para determinar la concentración relativa de los dos estados de la proteína. Esto permite cuantificar la saturación de oxígeno de la hemoglobina (sO2), u oxigenación sanguínea, dentro y fuera de la región del infarto 8,9. Esta es una medida importante en el accidente cerebrovascular isquémico, ya que puede indicar el nivel de oxígeno en el tejido cerebral dañado después de la isquemia.

La angiografía acústica (AA) es un método de imagen de ultrasonido con contraste que es particularmente útil para obtener imágenes de la morfología de la vasculatura in vivo10. El método se basa en el uso de un transductor wobbler de doble elemento (un elemento de baja frecuencia y un elemento de alta frecuencia) junto con microburbujas inyectadas en el sistema circulatorio del sujeto de imágenes. El elemento de baja frecuencia del transductor se utiliza para transmitir a la frecuencia resonante de las microburbujas (por ejemplo, 2 MHz), mientras que el elemento de alta frecuencia se utiliza para recibir las señales superarmónicas de las microburbujas (por ejemplo, 26 MHz). Cuando se excitan a una frecuencia resonante, las microburbujas tienen una fuerte respuesta no lineal, lo que resulta en la producción de señales súper armónicas que los tejidos corporales circundantes no producen11. Al recibir con un elemento de alta frecuencia, esto asegura que solo se detecten las señales de microburbujas. Dado que las microburbujas están confinadas a los vasos sanguíneos, el resultado es una imagen angiográfica de la morfología de los vasos sanguíneos. AA es un método poderoso para obtener imágenes del accidente cerebrovascular isquémico, ya que las microburbujas que fluyen a través del sistema circulatorio no pueden fluir a través de los vasos bloqueados. Esto permite que AA detecte regiones del cerebro que no están perfundidas debido a un accidente cerebrovascular isquémico, lo que indica la región del infarto.

La investigación preclínica del accidente cerebrovascular isquémico generalmente se basa en el uso de histología y pruebas conductuales para evaluar la ubicación y la gravedad del accidente cerebrovascular. La tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) es un análisis histológico común utilizado para determinar el volumen del infarto sistólico. Sin embargo, solo puede ser utilizado en un punto final, ya que requiere que el animal sea sacrificado12. Las pruebas de comportamiento pueden ser utilizadas para determinar el deterioro de la función motora en múltiples puntos de tiempo, pero no pueden proporcionar valores anatómicos o fisiológicos cuantitativos13. La imagen biomédica proporciona un enfoque más cuantitativo para estudiar los efectos del accidente cerebrovascular isquémico de forma no invasiva y longitudinal 9,14,15. Sin embargo, las tecnologías de imagen existentes (como la resonancia magnética [MRI] de animales pequeños) pueden tener un alto costo, no pueden proporcionar información estructural y funcional concurrente o tienen una profundidad de penetración limitada (como la mayoría de las técnicas de imágenes ópticas).

Aquí, combinamos tomografía fotoacústica, ecográfica y angiográfica (PAUSAT; ver diagrama del sistema en la Figura 1), que permite información estructural y funcional complementaria de la perfusión sanguínea y la oxigenación después del accidente cerebrovascular isquémico16. Estos son dos aspectos importantes para evaluar la gravedad de la lesión y monitorear la recuperación o la respuesta a los tratamientos. El uso de estos métodos de imagen integrados puede aumentar la cantidad de información obtenida por cada animal, reduciendo el número de animales requeridos y proporcionando más información en el estudio de posibles tratamientos para el accidente cerebrovascular isquémico.

Figure 1
Figura 1: Diagrama PAUSAT. (A) Esquema completo del sistema PAUSAT, incluyendo el láser y el OPO utilizados para PAT. (B) Vista interior del sistema PAUSAT, incluidos dos transductores de ultrasonido. El transductor wobbler de doble elemento se utiliza tanto para ultrasonido en modo B como para AA, y el transductor de matriz lineal se utiliza para PAT. Ambos transductores están montados en la misma etapa motorizada 2D, lo que permite que el escaneo genere datos volumétricos. Esta cifra se ha modificado de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Duke y se llevaron a cabo de acuerdo con la Política sobre Cuidado Humanitario y Uso de Animales de Laboratorio del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos. Para estos estudios se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6J (ver Tabla de materiales). Se tomaron imágenes de un mínimo de tres animales por grupo modelo de accidente cerebrovascular. Consulte la figura 2 para ver el flujo de trabajo seguido en este protocolo.

Figure 2
Figura 2: Resumen del procedimiento experimental para la imagen PAUSAT aplicada al ictus. Creado con Biorender.com. La figura muestra el flujo de trabajo del procedimiento de imagen a partir de (A) los dos modelos principales de accidente cerebrovascular (pMCAO y accidente cerebrovascular PT). (B) Se debe realizar una inyección retroorbitaria de las microburbujas antes de colocar al animal en la membrana PAUSAT. (C) Una máscara que proporcione anestesia continua y una almohadilla térmica para mantener estable la temperatura corporal del animal se requieren en esta configuración. El cuerpo del animal se coloca en la almohadilla térmica mientras la cabeza descansa sobre la membrana del sistema. (D) El orden de adquisición de la imagen también se muestra en la figura. (E) La tinción TTC se realiza para validar nuestros resultados en este estudio. DPI: días después de la lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Inducir el modelo de ratón de trazo

  1. Oclusión permanente de la arteria cerebral media (pMCAO) con ligadura de la arteria carótida común (CCA).
    NOTA: Brevemente, realizar ligadura permanente del ACC derecho y electrocauterización posterior de la arteria cerebral media derecha (ACM)17. Este procedimiento limita el flujo sanguíneo cerebral en la corteza derecha del cerebro, causando un accidente cerebrovascular isquémico18.
    1. Inducir anestesia en una cámara de inducción utilizando una mezcla inhalatoria de isoflurano al 5,0% en 30% O2/70%N2 hasta la pérdida de conciencia (reconocida como pérdida del reflejo pedal).
    2. Intubar al animal con un catéter de 20 G (Tabla de materiales) y conectarlo a un ventilador automático. Establezca el caudal en función del peso corporal del animal y mantenga al animal anestesiado con isoflurano al 1,5% -2,0% en 30% O 2/70% N2.
    3. Usando una lámpara de calentamiento y una sonda rectal conectada a un dispositivo controlador de temperatura, mantenga la temperatura corporal del animal a 37 ° C.
    4. Ponga una gota de ungüento lubricante para los ojos en los ojos del ratón.
    5. Coloque al animal en posición supina y retire el pelo del área del cuello con un recortador de pelo.
    6. Limpie el área de la piel usando primero un hisopo de algodón con povidona yodada y luego usando una almohadilla estéril con etanol al 70%. Realice esto tres veces.
    7. Verifique la profundidad de la anestesia y la ausencia de dolor pellizcando ligeramente la pata posterior del animal.
    8. Haga una incisión sagital de 0,8 cm en la línea media del cuello y exponga el CCA derecho.
    9. Prepare una sutura para la ligadura CCA disociando una sutura de seda 4-0 en hilos más delgados que componen el hilo principal. Utilice una longitud de 1,5 cm de uno de los subhilos para ligar permanentemente el CCA.
      NOTA: Después de apretar el nudo, retire el exceso de hilo cortando la extensión a una distancia de 1-2 mm del nudo.
    10. Aplique una gota de bupivacaína antes de cerrar la herida.
    11. Cierre la incisión con suturas quirúrgicas de seda 4-0 interrumpidas y aplique ungüento antibiótico triple en la superficie para prevenir la infección.
    12. Mueva el ratón para exponer el lado lateral derecho del cuerpo del animal.
    13. Retire el vello en la región entre la oreja y el área de los ojos con un recortador de pelo.
    14. Desinfecte el área quirúrgica con un hisopo de algodón con povidona yodada, seguido de una almohadilla estéril con etanol al 70%. Repita este paso tres veces.
    15. Coloque una cortina estéril para asegurar el área quirúrgica. Luego, haga una incisión de 0,5 cm entre el ojo derecho y la oreja del animal, exponiendo la articulación entre el cráneo y el músculo temporal.
    16. Usando un bucle de cauterio, cauterizar el músculo para separarlo del cráneo y exponer el área del MCA.
    17. Perfore una ventana de 0.2 mm2 para exponer el MCA usando un taladro eléctrico, y use electrocauterio en el MCA para ocluir el flujo sanguíneo.
      NOTA: Un solo pulso al 80% de intensidad de potencia es suficiente para cauterizar el MCA.
    18. Usando una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 27G, aplique una gota de bupivacaína (Tabla de materiales) en el sitio quirúrgico.
    19. Cierre la incisión de la piel con suturas de monofilamento transparente 6-0 interrumpidas y aplique ungüento antibiótico triple en la superficie para prevenir infecciones.
    20. Después de completar la cirugía, transfiera el animal a una incubadora con temperatura controlada (32 ° C) y permita que el animal se recupere.
    21. Después de 2 h, transfiera al animal a su jaula de origen y proporcione comida y agua ad libitum.
  2. Accidente cerebrovascular fototrombótico (accidente cerebrovascular PT)
    NOTA: Brevemente, el accidente cerebrovascular PT se realiza iluminando Rosa de Bengala dentro de los vasos en el cerebro. La Rosa de Bengala se administra por vía intraperitoneal, y una vez que se ha distribuido bien por todo el cuerpo (5 min), se ilumina con una luz verde fría, que activa la Rosa de Bengala para generar especies reactivas de oxígeno (ROS). Estas ROS dañan la membrana de las células endoteliales, creando trombos dentro de toda el área iluminada y dando lugar a la interrupción del flujo sanguíneo cerebrallocal 19.
    1. Inducir anestesia en una cámara de inducción utilizando una mezcla inhalatoria de isoflurano al 5,0% en 30% O2/70%N2 hasta la pérdida de conciencia (reconocida como pérdida del reflejo pedal).
    2. Coloque al animal en un marco estereotáxico, manteniendo al animal anestesiado usando una máscara e isoflurano al 1.5% -2.0% en 30% O 2/70% N2.
    3. Mantener al animal a 37 °C utilizando un calentador de recirculación de agua caliente y una sonda rectal para medir la temperatura corporal del animal.
    4. Ponga una gota de ungüento lubricante para los ojos en los ojos del ratón.
    5. Afeite la cabeza del animal con un recortador de pelo.
    6. Limpie el área del cuero cabelludo afeitado tres veces, primero usando un hisopo de algodón con povidona yodada y luego usando una almohadilla estéril con etanol al 70%.
    7. Verifique la ausencia de dolor pellizcando ligeramente la pata posterior del animal.
    8. Haga una incisión sagital de 1,4 cm en la línea media del cuero cabelludo con un bisturí y exponga el cráneo.
    9. Usando un lápiz afilado, haga una marca a 1,5 mm desde el bregma hacia el lado derecho.
    10. Coloque un agujero circular de 2,5 mm de diámetro centrado en la marca de 1,5 mm.
      NOTA: Se puede hacer un cuadrado que contiene un agujero circular utilizando cinta negra de doble cara y haciendo una abertura de 2,5 mm de diámetro en el centro utilizando una herramienta perforadora de un solo orificio del tamaño mencionado.
    11. Coloque la luz fría verde en el agujero circular, manteniendo el espacio entre la luz y el agujero de alfiler al mínimo.
    12. Cubra el área con papel de aluminio para evitar la propagación de la luz.
    13. Una vez que la configuración esté lista, inyecte al animal por vía intraperitoneal con 10 mg / kg de Rosa de Bengala (10 mg / ml en 1x solución salina tamponada con fosfato [PBS]) y espere 5 minutos.
    14. Después de 5 minutos, encienda la fuente de luz fría (intensidad: 4.25) y mantenga la exposición durante 15 minutos.
    15. A continuación, apague la luz fría y verifique el accidente cerebrovascular a simple vista (se espera que el área sea más blanca que el área circundante) o utilizando dispositivos externos para medir el flujo sanguíneo cerebral (por ejemplo, mediante el uso de imágenes de contraste con moteado láser (Tabla de materiales; consulte el paso 5.1).
    16. Usando una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 27G, aplique una gota de bupivacaína (Tabla de materiales) en el sitio quirúrgico.
    17. Cierre la incisión de la piel con suturas de monofilamento transparente 6-0 interrumpidas y aplique ungüento antibiótico triple en la superficie para prevenir la infección.
    18. Después de completar la cirugía, transfiera el animal a una incubadora con temperatura controlada (32 ° C) y permita que el animal se recupere.
    19. Después de 2 h, transfiera al animal a su jaula de origen y proporcione comida y agua ad libitum.

2. Preparación de PAUSAT para imágenes

  1. Encienda el láser de 532 nm y déjelo encendido durante 15 minutos para calentar.
  2. Prepare la plataforma de imágenes para el animal anestesiado.
    1. Coloque una rampa personalizada (Figura 2C) unida a la etapa ajustable manualmente (Tabla de materiales) junto a la membrana de imágenes.
    2. Coloque un soporte para dientes de ratón con el tubo de respiración conectado a la rampa personalizada y asegure una almohadilla térmica en la superficie de la rampa.
  3. Después de que el láser se haya calentado, verifique que la trayectoria del láser y el acoplamiento en el haz de fibra estén bien alineados utilizando una tarjeta detectora de infrarrojo cercano (Tabla de materiales) colocando la tarjeta delante de la entrada del haz de fibra y asegurándose de que la luz láser ingrese al paquete.
    NOTA: Ajuste los espejos de trayectoria láser según sea necesario para asegurarse de que la entrada láser esté centrada con la entrada del haz de fibra.

3. Preparación del animal para PAUSAT

NOTA: PAUSAT se realiza 1 día después de la cirugía de accidente cerebrovascular PT o 3 días después de la cirugía pMCAO. La preparación de PAUSAT para imágenes (paso 2) dura aproximadamente 20 minutos y debe hacerse inmediatamente antes de preparar al animal para PAUSAT.

  1. Inducir la anestesia en una cámara de inducción utilizando una mezcla de inhalación de isoflurano al 5% mezclado con 30% O2/70%N2 hasta la pérdida de conciencia (reconocida como una pérdida del reflejo pedal).
  2. Transfiera al animal a una plataforma calentada con un soporte de dientes y una máscara, y mantenga la anestesia al 1,5%-2,0% de isoflurano en 30% O2/70%N2.
  3. Utilice una lámpara de calentamiento y una sonda rectal conectada a un dispositivo controlador de temperatura para mantener la temperatura corporal del animal a 37 ° C.
  4. Recorte el pelo en la parte superior de la cabeza del animal usando una afeitadora eléctrica. Incluya la región desde cerca de los ojos hasta detrás de las orejas.
  5. Afeite el pelo en la parte superior de la cabeza del animal aplicando una crema depilatoria comercial para eliminar completamente el pelo corto restante. Dejar en la piel durante 5-6 minutos, luego limpiar con un hisopo de algodón frotado en agua para ayudar a eliminar completamente la crema. Repita hasta que la piel esté limpia de vello.
    NOTA: Para obtener imágenes 1 día después de la cirugía, estos pasos se pueden realizar antes de comenzar la cirugía; a 1 día después del accidente cerebrovascular PT, se pueden omitir. Cuando la adquisición de imágenes PAUSAT se realiza varios días después de la cirugía, se requiere críticamente que se realice este paso.
  6. Una vez que el animal y el sistema estén listos para la obtención de imágenes, y justo antes de transferir el animal a la plataforma del sistema, inyecte una solución de 100 μL de microburbujas en la concentración madre (Tabla de materiales) retroorbitalmente utilizando una aguja de 27 G.
    NOTA: Una vez que las burbujas están en circulación en el torrente sanguíneo, hay una cantidad limitada de tiempo para obtener imágenes sin una pérdida significativa de señal (~ 10 min).
  7. Ponga una gota de loción de protección ocular en los ojos del ratón.
    NOTA: No se recomienda aplicar lubricante ocular hasta que se realice la inyección retroorbitaria para evitar que sustancias extrañas lleguen al torrente sanguíneo del animal. Por lo tanto, la aplicación de la crema depilatoria debe realizarse lenta y cuidadosamente para evitar acercarse demasiado a los ojos (pero lo suficiente como para exponer la región de interés donde se espera el trazo). La depilación de la crema se realiza con un hisopo de algodón previamente untado en agua, evitando que la crema gotea, lo que puede dañar los ojos.

4. PAUSAT Imágenes

NOTA: Esto se hace para obtener imágenes de las regiones contralaterales e ipsilaterales del cerebro después del accidente cerebrovascular

  1. Transfiera el ratón a la plataforma de imagen PAUSAT (Tabla de materiales) integrada, colocando el ratón en posición supina en la rampa personalizada (Figura 2C).
  2. Llene la ventana de imágenes con suficiente agua destilada en la superficie para el acoplamiento acústico.
    NOTA: Se recomienda una rampa opcional -impresa con una impresora 3D- para evitar que el cuerpo del animal se moje durante la adquisición de la imagen y mejorar la comodidad del animal. También ayuda a mantener una temperatura corporal estable. Además, la rampa se puede conectar a una etapa manual (Tabla de materiales) para ajustar la profundidad focal del transductor wobbler de doble elemento en relación con la cabeza del ratón. El archivo de diseño de rampa personalizado está disponible a petición de los autores.
  3. Asegure la cabeza del ratón en el soporte del diente y asegure la anestesia y el flujo de aire adecuados.
  4. Usando una lámpara de calentamiento y una sonda rectal conectada a un dispositivo controlador de temperatura, mantenga la temperatura corporal del animal a 37 ° C.
  5. Abra la aplicación de imágenes (Tabla de materiales) y navegue hasta el ultrasonido en modo B.
  6. Utilice la ventana de ultrasonido en vivo para ajustar manualmente la cabeza del ratón a la posición deseada.
  7. Utilice la ventana de ultrasonido en vivo para ajustar la altura del escenario, de modo que la profundidad focal del transductor (19 mm) esté aproximadamente en el centro del área a fotografiar.
  8. Imágenes con ultrasonido en modo B
    1. Ajuste el valor de la frecuencia de transmisión de ultrasonido en modo B (para estos estudios, use 16 MHz).
    2. Introduzca la información del directorio de guardado en la aplicación de imágenes.
    3. Utilice la caja flotante para seleccionar la región deseada para la exploración en modo B del cerebro.
    4. Pulse el botón Adquirir estática .
    5. Verifique los resultados del escaneo en la aplicación una vez que se complete la adquisición de la imagen para asegurarse de que se haya obtenido la imagen de la región deseada.
      NOTA: Evite retrasos innecesarios en la adquisición de imágenes en modo B para garantizar que una concentración suficientemente alta de microburbujas permanezca en el torrente sanguíneo para el AA.
  9. Diagnóstico por imágenes con AA
    1. Volver a Adquisición de imágenes.
    2. Cambie al modo Angiografía acústica en la aplicación de imágenes (Tabla de materiales).
    3. Introduzca los parámetros del protocolo de escaneo deseados (el más importante de los cuales es el espaciado de fotogramas y el número de fotogramas por posición, que se estableció en 0,2 mm y 10, respectivamente, para estos estudios).
    4. Pulse el botón Adquirir estática .
      NOTA: La adquisición de AA toma más tiempo que el ultrasonido de modo B.
    5. Una vez completado el escaneo, verifique los resultados del escaneo en Análisis de imagen para asegurarse de que la calidad de la imagen sea la esperada.
      NOTA: Para el modo AA, se puede adquirir un volumen de todo el cerebro más representativo repitiendo una segunda exploración a una profundidad focal diferente dentro del cerebro y luego recombinando las imágenes con el posprocesamiento adecuado (ver Figura 3).
  10. Imagen con tomografía fotoacústica
    1. Abra la aplicación del oscilador paramétrico óptico (OPO) (Tabla de materiales) y configúrela en 756 nm.
      NOTA: Las OPO pueden salirse fácilmente de la calibración, por lo que antes del experimento, asegúrese de que la OPO esté calibrada correctamente utilizando un espectrómetro independiente.
    2. Traduzca manualmente el transductor de matriz lineal a las coordenadas previamente determinadas para asegurarse de que los volúmenes wobbler y los volúmenes de matriz lineal se registran automáticamente.
      NOTA: Es fundamental que se realice de antemano un experimento de registro conjunto utilizando una cuadrícula fantasma para determinar la distancia exacta necesaria para traducir la etapa, de modo que los datos resultantes de ambos transductores se registren conjuntamente en 3D.
    3. Abra la aplicación láser y encienda el láser de 532 nm.
    4. Usando un medidor de potencia láser, mida la energía de la salida del láser y asegúrese de que sea la energía deseada (~ 10 mJ por pulso se utilizó para estos estudios).
    5. Seleccione los parámetros de escaneo deseados para PAT (tamaño de paso de 0,4 mm, longitud de escaneo de 20 mm y 10 fotogramas promediados por posición).
    6. Abra el programa MATLAB (Table of Materials) del sistema de adquisición de datos de ultrasonido y pulse el botón Ejecutar .
    7. Adquiera el escaneo PAT presionando el botón Inicio .
    8. Una vez finalizado el análisis, abra el programa de guardado de MATLAB. Cambie el nombre de guardar al nombre de archivo deseado y pulse el botón Ejecutar .
    9. Cambie la longitud de onda OPO a 798 nm y repita los pasos de 4.10.3 a 4.10.8.
      NOTA: Para un estudio longitudinal, se recomienda permitir que el animal se recupere colocándolo en una incubadora y bajo observación durante unas horas (siguiendo los pasos 1.1.18 y 1.1.19). Si se desea validar el resultado, continúe con la sección 5 inmediatamente después de la obtención de imágenes PAUSAT.

5. Opcional: Validación de resultados

  1. Imágenes de contraste moteado láser (LSCI).
    1. Anestesiar al animal usando isoflurano al 1,5%-2,0% en 30% O2/70%N2.
    2. Coloque al animal en un marco estereotáxico, manteniendo al animal anestesiado con una máscara y la anestesia inhalatoria mencionada anteriormente.
    3. Mantener al animal a 37 °C utilizando un calentador de recirculación de agua caliente y una sonda rectal para medir la temperatura corporal del animal.
    4. Ponga una gota de loción de protección ocular en los ojos del ratón.
    5. Verifique la ausencia de dolor pellizcando ligeramente la pata posterior del animal.
    6. Retire el pelo del cuero cabelludo del animal con un recortador de pelo.
    7. Desinfecte el área quirúrgica con un hisopo de algodón con povidona yodada, seguido de una almohadilla estéril con etanol al 70%. Repita este paso tres veces.
    8. Haga una incisión sagital de 1,4 mm en la línea media del cuero cabelludo y exponga el cráneo. Use fórceps para sostener el cuero cabelludo y evitar que ocupe el área del cerebro para escanear.
    9. Aplique algunas gotas de solución salina en el cráneo y coloque el dispositivo del sistema de contraste de moteado láser (Tabla de materiales) sobre la cabeza del animal.
    10. En el menú Archivo , configure el dispositivo en modo en línea, incluido en el submenú Modo de trabajo.
    11. Seleccione la carpeta de almacenamiento de imágenes predeterminada en el menú Archivo y en el submenú Guardar configuración .
    12. En el menú Fuente de luz, conecte el láser guía ("Láser encendido") y la luz blanca ("Luz blanca encendida") para ubicar la ventana de imágenes en la posición correcta.
    13. En el menú Configuración , seleccione Configuración de ampliación, mueva el cursor manualmente a 2,5 y pulse Aplicar y Aceptar para guardar la configuración.
    14. Ajuste el enfoque moviendo manualmente la barra de enfoque ubicada en el submenú superior de la página principal.
    15. En el menú Configuración, seleccione Configuración de umbral de pseudocolor, ajuste el umbral como desee y pulse Aplicar y Aceptar para guardar la configuración.
    16. En el menú Fuente de luz, desconecte el láser guía ("Láser apagado") y la luz blanca ("Luz blanca apagada") antes de capturar la imagen.
    17. Capture la imagen seleccionando el símbolo Reproducir en el submenú superior de la página principal.
  2. Tinción de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)
    1. Anestesiar profundamente al animal utilizando isoflurano al 5% en 30% O2/70%N2.
    2. Una vez que el animal haya dejado de respirar, decapitarlo con unas tijeras afiladas.
    3. Retire toda la piel alrededor de la cabeza y los músculos en el área del cuello.
    4. Haga un corte sagital en la parte occipital del cráneo hasta que llegue al hueso parietal.
    5. Haga un corte horizontal (~5 mm) en el lado izquierdo y derecho debajo del vaso sanguíneo. Extraer el hueso occipital del cráneo con fórceps rectos.
    6. Haga un corte (~5 mm) en la sutura frontonasal del cráneo.
    7. Haga un corte sagital (~ 10-15 mm) en la línea media del cráneo, entre los hemisferios, y asegúrese de que estén completamente separados.
    8. Usando tijeras curvas de tamaño #7, retire los huesos parietales izquierdo y derecho del cráneo desde el centro hacia los lados.
    9. Transfiera el cerebro a un recipiente lleno con 5 ml de PBS 1x helado y manténgalo en hielo durante 10 minutos.
    10. Transfiera el cerebro a una matriz cerebral de acero inoxidable (secciones de 1 mm de espesor).
    11. Seccionar el cerebro en secciones coronales de 1 mm usando cuchillas de afeitar desechables (Tabla de materiales).
    12. Sosteniendo las cuchillas por sus lados, transfiéralas a un recipiente lleno de PBS helado 1x.
    13. Separe cuidadosamente las secciones de las cuchillas una por una.
    14. Transfiera las rebanadas de cerebro a una placa de Petri de 70 mm de diámetro que contenga 5 ml de TTC al 2% (Tabla de materiales, 3) en 1x PBS.
    15. Incubar durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente (R/T).
    16. Después de 15 minutos, deseche el TTC, reemplácelo con 3 ml de formalina e incube en la oscuridad durante al menos 30 minutos a R/T.
    17. Finalmente, transfiera las rebanadas de cerebro a una película de plástico transparente y escanee las muestras, incluida una regla en la imagen de escaneo como referencia para futuras mediciones.

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Representative Results

Imágenes de la morfología de los vasos sanguíneos en el cerebro
AA genera imágenes de morfología de vasos sanguíneos excitando microburbujas en el sistema circulatorio a su frecuencia resonante y recibiendo la respuesta súper armónica de las microburbujas. Mediante el uso de la rampa personalizada (Figura 2C) conectada a una etapa ajustable manualmente, podemos obtener imágenes del cerebro del ratón con modo AA a dos profundidades focales diferentes. Cuando se dirigen regiones más profundas, las regiones más superficiales (como la corteza cerebral) muestran una resolución y una intensidad de señal más pobres (Figura 3A), y viceversa (Figura 3B). Sin embargo, al adquirir dos profundidades focales y combinarlas, las imágenes AA pueden proporcionar información sobre toda una sección coronal (Figura 3C, D). Además, al utilizar la etapa motorizada para escanear a lo largo de una tercera dimensión, PAUSAT puede registrar una serie de imágenes coronales que cubren la región de interés (ROI) definida por el usuario. Estas series de imágenes se pueden alinear y utilizar para visualizar una representación 3D de todo el cerebro, o el ROI definido por el usuario. Sin embargo, también se proporcionan aquí resultados adicionales que demuestran que otras medidas cuantitativas (como el volumen sistólico) pueden analizarse utilizando la información 3D de la compilación de imágenes adquiridas por PAUSAT.

Evaluación anatómica y funcional antes y después del accidente cerebrovascular isquémico
Para ilustrar el potencial del sistema PAUSAT en estudios preclínicos, estudiamos dos grupos de animales sometidos a uno de los modelos de ictus isquémico aquí analizados: pMCAO o PT ictus. Estos dos modelos de accidente cerebrovascular difieren en los principios por los cuales se crea la región isquémica. Brevemente, en el modelo pMCAO, la arteria cerebral media se electrocauteriza, deteniendo el suministro de sangre desde esta arteria al cerebro. Esta lesión desencadena una lesión secundaria, en la que el tejido circundante se vuelve isquémico, agrandando el área afectada por el accidente cerebrovascular. Decidimos obtener imágenes del ictus cerebral pMCAO en el tercer día después del ictus, porque este es el momento en el que se alcanza el área máxima que se espera que se vea afectada por el ictus. Sin embargo, en el accidente cerebrovascular PT, el área máxima de tejido afectada por el accidente cerebrovascular se logra después del primer día, por lo que decidimos obtener imágenes del accidente cerebrovascular PT el primer día después de que se realizó el accidente cerebrovascular. Aunque elegimos estos puntos de tiempo en nuestro estudio, PAUSAT se puede utilizar para la monitorización longitudinal del accidente cerebrovascular en cualquier punto de tiempo deseado.

Primero, se adquirió un escaneo en modo B para asegurar la posición correcta de la cabeza del animal e identificar los límites espaciales entre el cráneo y el cerebro (Figura 4A y Figura 5A). La parte más anterior del cerebro fotografiada incluye la sutura frontonasal del cráneo como punto de referencia. Un ROI de 20 mm (anterior a posterior) x 17,15 mm (lateral) cubriendo la izquierda (contralateral; CL) y el derecho (ipsilateral; IL) hemisferios se definió en los siguientes estudios para localizar la región del accidente cerebrovascular. Las imágenes de AA proporcionaron información sobre las estructuras de los vasos sanguíneos al dirigir la señal de las microburbujas circulantes. Nuestros resultados muestran que en el cerebro no lesionado (línea de base), ambos hemisferios presentan una distribución similar de vasos sanguíneos (Figura 4B y Figura 5B), como se esperaba en ausencia de lesión. Un resultado similar se observa para la distribución del mapa de oxigenación tisular basada en imágenes de PA obtenidas en dos longitudes de onda diferentes (Figura 4C y Figura 5C). Decidimos evaluar dos longitudes de onda diferentes basadas en la absorción óptica máxima local para hemoglobina desoxigenada (756 nm) y la longitud de onda en la que la hemoglobina desoxigenada y oxigenada presentó igual absorción óptica (798 nm)20. Al capturar estos dos estados de hemoglobina, podemos estimar con precisión la oxigenación del tejido (Figura 4D y Figura 5D).

Al día siguiente de adquirir la imagen basal del cerebro, realizamos una cirugía en el animal (pMCAO o PT ictus), como se describe en las secciones anteriores. Se adquirió un nuevo conjunto de imágenes en un momento específico después del accidente cerebrovascular (véase la figura 2A) para evaluar la ubicación y el tamaño del accidente cerebrovascular. Las imágenes AA adquiridas de ratones sometidos a pMCAO muestran una notable reducción en la intensidad de la señal en el lateral derecho de la corteza (Figura 4B). La misma región muestra una reducción en el mapa de oxigenación tisular de las imágenes de PA, lo que sugiere un área isquémica (Figura 4D). Para validar nuestros resultados, decidimos cosechar el cerebro y realizar la tinción TTC inmediatamente después de adquirir las imágenes del animal con accidente cerebrovascular. Nuestros resultados muestran que el área identificada como accidente cerebrovascular es similar cuando se compara con nuestros resultados por PAUSAT y la tinción TTC bien establecida (Figura 4B-E). También demostramos aquí que PAUSAT puede identificar áreas de accidente cerebrovascular en el cerebro utilizando un segundo modelo de accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular PT, evaluado en un momento anterior después de la inducción del accidente cerebrovascular (1 día). Como se muestra en la Figura 5B, pudimos identificar una región en la parte superior de la corteza con un suministro de flujo sanguíneo reducido y una disminución concomitante en la saturación de oxígeno (Figura 5D). Los resultados obtenidos de la tinción TTC coinciden con la ubicación y el tamaño del accidente cerebrovascular previamente identificado por PAUSAT (Figura 5B-E).

La edad del ratón que se está fotografiando puede afectar en gran medida la calidad de la imagen. El cráneo de un ratón se vuelve más grueso con la edad, y dado que el cráneo tiene una impedancia acústica significativamente diferente en relación con el tejido blando, un gran porcentaje de las ondas ultrasónicas se reflejan en el límite del cráneo. Debido a que estos sistemas de imagen integrados están todos basados en la acústica, esto conduce a una disminución en la profundidad de imagen para los ratones más viejos. Esto se puede ver claramente en la Figura 6, donde se tomaron imágenes de ratones de tres edades diferentes con AA en las mismas condiciones. Se esperan resultados similares de baja señal si no se sigue el procedimiento de imagen como se describió anteriormente.

Análisis cuantitativo del volumen sistólico por PAUSAT
Como se describe en los resultados mencionados anteriormente, PAUSAT captura una serie de imágenes coronales dirigidas a un ROI descrito por el usuario. Se analizó el volumen del trazo calculando el área del trazo dentro de las diferentes imágenes coronales y la distancia entre imágenes. El volumen sistólico calculado por PAUSAT no muestra diferencia estadística (p < 0,05) en comparación con el volumen sistólico calculado en base a un enfoque similar utilizando imágenes de tinción TTC (Figura 7).

Figure 3
Figura 3: Efecto de la profundidad focal del transductor wobbler en la calidad de las imágenes AA. Las imágenes a múltiples profundidades focales se pueden adquirir y luego combinar para producir los mejores resultados de imágenes de todo el cerebro. (A) Sección coronal AA adquirida a una profundidad focal más profunda. (B) Sección coronal AA adquirida a una profundidad focal más superficial. (C) Resultado de fusionar imágenes de enfoque más profundo (verde) y más superficialmente enfocadas (magenta). (D) Resultado de combinar un enfoque más profundo e imágenes más enfocadas superficialmente con un valor de escala de píxeles comparable a (A) y (B). Esta cifra se ha modificado de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos de PAUSAT de un cerebro de ratón antes y después del accidente cerebrovascular pMCAO . (A) Imágenes coronales de ultrasonido basales y posteriores al accidente cerebrovascular en modo B. (B) Imágenes coronales AA basales y posteriores al accidente cerebrovascular. (C) Imágenes coronales de PA basales y posteriores al accidente cerebrovascular con excitación de 756 nm. (D) Mapa de saturación de oxígeno basado en imágenes de excitación de 756 nm y 798 nm. (E) Secciones teñidas de TTC de un cerebro de ratón, mostrando la misma región de accidente cerebrovascular. La distancia entre las líneas en la parte inferior de la imagen representa 1 mm. Esta cifra se ha modificado de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos de PAUSAT de un ratón antes y después del accidente cerebrovascular PT. (A) Imágenes coronales de ultrasonido basales y posteriores al accidente cerebrovascular en modo B. (B) Imágenes coronales AA basales y posteriores al accidente cerebrovascular. (C) Imágenes coronales de PA basales y posteriores al accidente cerebrovascular con excitación de 756 nm. (D) Mapa de saturación de oxígeno basado en imágenes de excitación de 756 nm y 798 nm. (E) Secciones teñidas de TTC de un cerebro de ratón, mostrando la misma región de accidente cerebrovascular. La distancia entre las líneas en la parte inferior de la imagen representa 1 mm. Esta cifra se ha modificado de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Efecto de la edad del ratón en la calidad de las imágenes AA. Esta figura muestra la diferencia en la intensidad de la señal AA y la profundidad de la imagen cuando se obtienen imágenes de animales de diferentes edades en condiciones comparables. Como se ve en la figura, las imágenes de ratones más viejos (18 meses) producen imágenes de menor calidad debido al tamaño y grosor del cráneo en comparación con los ratones más jóvenes (1,5 meses), mientras que los ratones adultos muestran una señal intermedia (6 meses). Debido al gran desajuste de impedancia acústica entre el cráneo y el tejido cerebral, las ondas de ultrasonido que se propagan a través del cráneo se reflejan y refractan, lo que lleva a la pérdida de señal y la degradación de la resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Análisis del volumen del accidente cerebrovascular isquémico. (A) Ejemplo de secciones TTC de trazo PT e imágenes segmentadas TTC correspondientes, imágenes AA e imágenes segmentadas AA en ubicaciones coronales comparables. (B) El volumen sistólico calculado en base a imágenes TTC y AA para pMCAO y PT stroke, no mostrando diferencias significativas (p > 0,05). El gráfico muestra la media ± la desviación estándar (DE) (n = 3 animales por grupo). Esta cifra se ha modificado de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay algunos aspectos vitales de este método que, si se hacen incorrectamente, pueden conducir a una disminución significativa de la calidad de imagen y el análisis cuantitativo. El resultado más común del error del usuario en las imágenes PAUSAT es la falta de señal o la intensidad de señal muy baja, los cuales pueden ocurrir por una variedad de razones. Una de esas razones es un problema con el acoplamiento acústico. Las grandes burbujas de aire en el agua que rodea la cabeza del ratón durante la obtención de imágenes a menudo pueden bloquear el viaje del ultrasonido hacia o desde el transductor, causando una región de sombra en la imagen resultante para las tres modalidades del sistema. Esto se puede prevenir asegurando que haya suficiente agua presente entre la membrana del sistema y la muestra que se va a fotografiar. También podría ocurrir que haya una falta de señal AA, pero una señal PA sorprendentemente alta, independientemente de las longitudes de onda utilizadas. Esto podría deberse a la presencia de cabello, especialmente cabello oscuro, que interfiere con la absorción de la luz. Para evitarlo, es necesario haber afeitado previamente la cabeza del animal hasta que no haya pelo visualmente identificable.

Con respecto a las imágenes AA, otro problema que podría ocurrir y conduciría a la falta o muy baja señal es una baja concentración de microburbujas presentes en el sistema circulatorio. Si las microburbujas están demasiado diluidas o se inyectaron incorrectamente, la señal resultante será muy débil. La inyección retroorbitaria debe ser realizada únicamente por personal bien entrenado. Otra razón podría ser un largo período de tiempo entre la inyección de microburbujas y el inicio de la imagen, lo que puede conducir a una reducción de las microburbujas en el torrente sanguíneo. Para evitar esto, se recomienda preparar el sistema para la obtención de imágenes antes de inyectar las microburbujas, de modo que el animal pueda transferirse a la membrana del sistema PAUSAT inmediatamente después de la inyección. Vale la pena mencionar que también se pueden usar rutas intravenosas alternativas (como la inyección de venas de la cola) una vez que el animal ya está posicionado en la membrana del sistema PAUSAT, acortando el tiempo entre la inyección y la imagen. Además, en aras de mantener la máxima concentración de microburbujas posible, también se recomienda realizar la imagen AA antes de la imagen PA.

La señal de PA también puede verse afectada si los pasos necesarios no se realizan correctamente. Uno de los problemas involucra la calidad del láser de excitación. Los dos componentes principales que describen la fuente láser son la energía del pulso y la longitud de onda. Se recomienda encarecidamente utilizar un medidor de potencia y un espectrómetro independientes para medir estas cantidades y asegurarse de que estén configuradas en los valores deseados. Si se asume un valor incorrecto, los cálculos funcionales proporcionarán resultados engañosos.

También es posible que cuando las imágenes AA y PA se combinan, no estén alineadas. La razón principal de esto es que las coordenadas establecidas entre los transductores no eran precisas. Para evitar esto, es fundamental realizar los experimentos requeridos utilizando una cuadrícula fantasma de antemano para determinar las coordenadas exactas para un registro conjunto exitoso de imágenes AA y PA. Otra fuente potencial de inexactitud se debe a una calibración incorrecta de la OPO. Para mitigar esto, el OPO debe calibrarse correctamente utilizando un espectrómetro independiente.

Quedan importantes áreas de mejora, particularmente con respecto a la calidad de imagen del componente PAT de este sistema integrado. El sistema PAT actual se basa en una configuración de matriz lineal de barrido. Podemos observar diferencias a gran escala en la oxigenación del infarto versus regiones sanas del cerebro utilizando varios modelos de ratón con accidente cerebrovascular, sin embargo, la vasculatura detallada (microvasos) no se puede ver. Hay dos problemas principales que contribuyen a esta baja calidad de imagen. El primero es el problema de la visión limitada. Para crear una imagen reconstruida de vista completa de una muestra en PAT, el detector debe rodear completamente el objeto (o tener un ángulo sólido de 4π). Sin embargo, en el entorno experimental, esto es difícil. Esto da lugar al problema de la visión limitada, lo que lleva a que los vasos sanguíneos que son ortogonales a la matriz del transductor, sean indetectables21. Existen soluciones para reducir los efectos del problema de visión limitada en PAT de matriz lineal, la más prometedora de las cuales es el uso de microburbujas como fuentes puntuales virtuales22. El segundo problema de la matriz lineal PAT es la mala resolución de elevación y sensibilidad, debido al enfoque débil de la lente acústica. Sin embargo, se ha demostrado que el uso de la difracción de una sola rendija en el diseño de hardware de un sistema de matriz lineal crea resolución isotrópica y sensibilidad para la matriz lineal PAT23,24. También se ha demostrado que los enfoques de aprendizaje profundo resuelven parcialmente tanto el problema de visión limitada como la mala resolución elevacional de la matriz lineal PAT25,26,27. La combinación de estas soluciones mejoraría significativamente la calidad de imagen del componente PAT de nuestro sistema de imagen integrado.

Aquí, hemos presentado un nuevo método de imagen multimodal no invasivo para la cuantificación estructural y funcional del accidente cerebrovascular isquémico en el entorno preclínico. A través de AA, es posible una morfología clara y un mapeo de perfusión de los vasos sanguíneos en el cerebro del ratón. Una falta de señal definida localmente puede indicar una región del infarto donde hay disminución de la perfusión sanguínea, lo que permite la estimación del volumen del infarto de forma no invasiva y longitudinal. A través de PAT, la saturación de oxígeno de la hemoglobina se puede medir dentro y fuera de la región del accidente cerebrovascular, mostrando el estado hipóxico de los tejidos cerebrales en la región del infarto. Este método de imágenes de todo el cerebro es de bajo costo con respecto a algunas alternativas, como la resonancia magnética de animales pequeños. Además, permite la combinación de información funcional y estructural en el tejido profundo que otros dispositivos de imagen preclínicos no pueden lograr. En comparación con los análisis histológicos, este método permite la medición de estas métricas longitudinalmente y en múltiples puntos de tiempo, en lugar de en un solo punto final. La capacidad de hacerlo proporcionará detalles cuantitativos sin precedentes en el estudio preclínico del accidente cerebrovascular isquémico. Además, la capacidad de imagen estructural y funcional de este sistema se puede aplicar a muchos estudios preclínicos más allá del accidente cerebrovascular isquémico28. Cualquier estado de enfermedad o fenómeno biológico que afecte al sistema vascular podría estudiarse en profundidad utilizando PAUSAT, lo que la convierte en una poderosa herramienta de imagen preclínica traducible a muchos otros campos preclínicos (por ejemplo, cáncer).

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses en este trabajo.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al equipo de ingeniería de SonoVol Inc. por su soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente patrocinado por el Premio de Ciencias Colaborativas de la Asociación Americana del Corazón (18CSA34080277), a J. Yao y W. Yang; Los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NIH) otorgan R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (Iniciativa BRAIN), R01 NS111039, R01 EB028143; El premio CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (NSF) 2144788; la Beca de la Iniciativa Chan Zuckerberg (2020-226178), a J. Yao; y los NIH otorgan R21NS127163 y R01NS099590 a W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 GA catheter BD Insyte Autoguard Winged 381534 For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma T8877 Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser Quantel Q-smart 850 Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr. Kent Scientific RV-JR To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP Surgical Specialties SP116 Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine Hospira 0409-1159-18 Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice Jackson Lab #000664 Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture Ethicon 8606 Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED Schott KL 1600 Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade Accutec Blades 74-0002 For sectioning mouse brain
Electric drill JSDA JD-700 Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool Wet-Field Wet-Field Bipolar-RG Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel Veet 8282651 Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip BOVIE Medical Corporation REF AA03 Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card Thorlabs VRC5 Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter Ophir StarBright, P/N 7Z01580 Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System RWD Life Science Co. RFLSI-III Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment Soothe AB31336 Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage Thorlabs L490 Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System Perkin Elmer LLA00061 System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator Quantel versaScan-L532 Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System Verasonics Vantage 256 Used for PAT part of system
Rose Bengal Sigma 330000 Necessary to induce PT stroke
Suture LOOK SP116 Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller Physitemp TCAT-2 Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles Perkin Elmer P-4007001 Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)

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References

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Neurociencia Número 196
Tomografía fotoacústica, ecográfica y angiográfica integrada (PAUSAT) para imágenes cerebrales completas no invasivas del accidente cerebrovascular isquémico
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Menozzi, L., del Águila, Á., Vu, T., Ma, C., Yang, W., Yao, J. Integrated Photoacoustic, Ultrasound, and Angiographic Tomography (PAUSAT) for NonInvasive Whole-Brain Imaging of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (196), e65319, doi:10.3791/65319 (2023).

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