Summary
在这里,我们提出了一个描述细胞核制备的协议。在将心脏组织进行显微切割和酶解离成单细胞后,冷冻祖细胞,然后分离纯活细胞,用于单核RNA测序和单核测定,用于转座酶可接近染色质和高通量测序分析。
Abstract
发育中的心脏是一个复杂的结构,包含由复杂调节机制控制的各种祖细胞。检查单个细胞的基因表达和染色质状态可以识别细胞类型和状态。单细胞测序方法揭示了心脏祖细胞异质性的许多重要特征。然而,这些方法通常仅限于新鲜组织,这限制了具有不同实验条件的研究,因为必须在同一次运行中立即处理新鲜组织以减少技术可变性。因此,该领域需要简单灵活的程序来生成来自单核RNA测序(snRNA-seq)和转座酶可接近染色质的高通量测序(snATAC-seq)等方法的数据。在这里,我们提出了一种快速分离细胞核的协议,用于随后的单核双组学(组合snRNA-seq和snATAC-seq)。该方法允许从心脏祖细胞的冷冻样品中分离细胞核,并且可以与使用微流体室的平台结合使用。
Introduction
在出生缺陷中,先天性心脏缺陷(CHD)是最常见的,每年约有1%的活产婴儿发生1,2。仅在少数病例中发现基因突变,这意味着其他原因,例如基因调节异常,与冠心病2,3的病因有关。心脏发育是多种多样和相互作用的细胞类型的复杂过程,使得鉴定因果非编码突变及其对基因调控的影响具有挑战性。心脏的器官发生始于产生不同亚型心脏细胞的细胞祖细胞,包括心肌细胞、成纤维细胞、心外细胞和心内膜细胞4,5。单细胞基因组学正在成为研究心脏发育和评估细胞异质性对健康和疾病的影响的关键方法6。用于同时测量不同参数的多组学方法的发展和计算管道的扩展促进了正常和患病心脏中细胞类型和亚型的发现6。本文描述了一种可靠的单核分离方案,用于从小鼠胚胎获得的冷冻心脏祖细胞,该方案与下游snRNA-seq和snATAC-seq(以及snRNA-seq和snATAC-seq组合)兼容7,8,9。
ATAC-seq是一种稳健的方法,可以鉴定调节性开放染色质区域和定位核小体10,11。该信息用于得出有关转录因子的位置、身份和活性的结论。因此,可以分析染色质因子(包括重塑剂)的活性以及RNA聚合酶的转录活性,因为该方法对于测量染色质结构1,2的定量变化具有高度敏感性。因此,ATAC-seq提供了一种稳健而公正的方法来揭示控制特定细胞类型中转录调控的机制。ATAC-seq协议也已经过验证,可以测量单细胞中的染色质可及性,揭示细胞群中染色质结构的变异性10,12,13。
尽管近年来在单细胞领域取得了显着进展,但主要困难是处理进行这些实验所需的新鲜样品14。为了规避这一困难,已经进行了各种测试,目的是用冷冻的心脏组织或细胞进行分析,例如snRNA-seq和snATAC-seq15,16。
几个平台已被用于分析单细胞基因组学数据17。广泛使用的单细胞基因表达和ATAC分析平台是用于多个微流体液滴封装的平台17。由于这些平台使用微流体室,碎屑或聚集体会堵塞系统,导致数据不可用。因此,单细胞研究的成功取决于单个细胞/细胞核的准确分离。
这里介绍的方案使用与最近使用snRNA-seq和snATAC-seq的研究类似的方法来了解先天性心脏缺陷18,19,20,21,22,23。该过程利用新鲜显微解剖的心脏组织的酶解离,然后冷冻保存小鼠心脏祖细胞。解冻后,活细胞被纯化并处理以进行核分离。在这项工作中,该协议成功地用于从小鼠心脏祖细胞的相同核制剂中获得snRNA-seq和snATAC-seq数据。
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Protocol
本研究中采用的动物程序已获得艾克斯-马赛大学动物伦理委员会(C2EA-14)的批准,并根据指定的国家动物实验伦理委员会(国家教育部,高等和研究部;授权阿帕菲斯号33927-2021111715507212)。
1. 在解剖前设置定时交配
- 为了产生小鼠胚胎,在心脏区域分离前9.5天在成年小鼠之间进行定时交配。在该过程中,使用2-6个月的野生型C57BL / 6J小鼠,并在夜间进行定时交配。
- 第二天早上,检查雌性小鼠是否有阴道塞。考虑将插头确定为胚胎日(E)0.5的日期考虑。
2. 组织制备和细胞分离
- 在受孕后第 9.5 天通过 CO 2 对 2-6 个月大的孕妇 C57BL/6J 实施安乐死,浓度增加,然后颈椎脱位。用70%乙醇清洁腹部下部。
注意:不建议在颈椎脱位前使用麻醉剂,因为这会使胚胎暴露于环境变化中,从而影响随后的转录组学和表观基因组学研究。 - 用剪刀打开腹部和腹膜。可视化子宫角,并用镊子切除两个角。
- 将角放入含有1%FBS的冷完全培养基的培养皿中。虽然不需要特定的体积,但必须注意确保胚胎完全浸入培养基中。每 10 cm 培养皿的大约体积为 10 mL 是合适的。
- 在设置为5倍放大倍率的体视显微镜下,使用镊子,从每个胚胎中取出子宫内膜组织,胎盘和卵黄囊。
- 将胚胎放入带有1%FBS的冷完全培养基的培养皿中。如 图1所示的示意图胚胎,在冷完全培养基中解剖胚胎心脏区域。
- 将从1.5 mL微量离心管中解剖的五个小鼠胚胎的心脏区域汇集在一起。将摆动桶离心机预冷至4°C。
- 在摆动桶离心机中以300×g 离心1分钟。除去上清液,并通过加入 1 mL 组织培养级 PBS 洗涤组织。
- 在室温下以300× g 离心1分钟。 除去上清液,重复洗涤步骤,总共洗涤两次。重复洗涤两次,用0.05%胰蛋白酶/ EDTA(1x)代替PBS。
- 对于组织消化,在37°C下加入50μL0.25%胰蛋白酶/ EDTA10分钟。 5 分钟后,使用宽孔过滤器尖端通过上下手势进行温和的机械解离。
- 通过向解离细胞中加入 350 μL 完全培养基来灭活胰蛋白酶消化活性。将重悬的细胞通过40μm细胞过滤器。
3. 细胞计数和活力评估
注意:细胞计数和活力是单细胞实验成功的关键参数。snATAC-seq方法对细胞数的微小变化很敏感。细胞太少会导致染色质过度消化,从而导致更多的读取次数和难以接近的染色质区域的映射(噪音)。同样,拥有太多的细胞会产生难以测序的高分子量片段。为了准确测定细胞和细胞核浓度,通过两种不同的方法评估细胞计数和活力。
- 进行台盼蓝测定以进行细胞计数,如下所述。
- 涡旋 0.4% 台盼蓝染色液,在室温下以 2,000 x g 离心 10 秒,然后将 10 μL 转移到微管中。
- 使用移液器混合细胞悬液,并将 10 μL 悬浮液添加到已等分的 10 μL 台盼蓝溶液中。用移液管仔细混合10次。
- 将 10 μL 染色细胞转移到计数玻片中。将载玻片放入计数器中以自动计算细胞浓度和活力。
- 进行基于荧光的死亡率评估,如下所述。
注意:该测定基于使用荧光染料(乙锭同源二聚体-1,EthD-1和钙黄绿素AM)来评估细胞活力。使用了市售试剂盒,并遵循了提供者的说明进行适当的制备和使用。- 通过将 5 μL 提供的 2 mM EthD-1 储备溶液加入 1 mL 无菌组织培养级 D-PBS 中来制备 10 μM EthD-1 溶液,并涡旋 5 秒以确保完全混合。
- 将 2.5 μL 提供的 4 mM 钙黄绿素 AM 储备溶液转移到已制备的 EthD-1 溶液中。涡旋5秒以确保完全混合。
- 将 10 μL 所得的 10 μM EthD-1 和 10 μM 钙黄绿素 AM 工作溶液加入 10 μL 细胞悬液中。
注意:钙黄绿素在水溶液中极易水解,因此请在1天内使用该工作溶液。 - 将 10 μL 染色细胞转移到计数载玻片上。将载玻片插入自动荧光细胞计数器。使用GFP过滤器计数活细胞,使用RFP过滤器计数死细胞。
注意:两种计数方法给出了相似的细胞计数和活力,并且估计每个胚胎心脏区域新鲜解离的细胞总数平均约为20,000个细胞(0.06mm3)。
4. 细胞冷冻
- 在4°C下以500× g 离心细胞悬液5分钟。 小心地除去上清液而不接触管底部,并将沉淀重悬于1mL冷冻培养基中。
- 将细胞悬液转移到预冷的冷冻管中,并将冷冻管放入预冷的冷冻容器中。
- 将容器置于-80 ◦C下4小时至8小时。将冷冻管转移到液氮中,用于下游单核RNA和ATAC测序实验。
注意:冷冻管应在使用前在干冰上运输。根据我们的经验,细胞可以在液氮中储存至少6个月,而不会损失细胞活力。储存温度应始终保持在-150°C以下,以防止形成冰晶。
5.细胞解冻和去除死细胞
- 将冷冻管置于37°C水浴中1-2分钟。当冷冻管中残留微小晶体时将其取出。
- 加入 1 mL 预热 (37 °C) 完全培养基。用移液管混合三次。将悬浮液转移到含有 10 mL 温完全培养基的 15 mL 锥形管中。
- 将整个细胞悬液通过30μm过滤器。用 1-2 mL 温热的完全培养基冲洗过滤器,并将流出物收集在同一锥形管中。
- 以300× g 离心5分钟,并除去上清液。用PBS洗涤一次,并将细胞悬液转移到1.5mL微管中。
- 以300× g 离心5分钟,除去上清液而不破坏细胞沉淀。
- 向沉淀细胞中加入 100 μL 提供的磁性微珠,并使用宽口径移液器吸头匀浆 5 次。在室温下孵育15分钟。
- 同时,用 500 μL 1x 结合缓冲液冲洗磁性分离柱(容量:1 x 107 至 2 x 108 个细胞)。
- 孵育完成后,用 500 μL 1x 结合缓冲液稀释含有微珠的细胞悬液。
- 将细胞悬液(0.6μL)施加到制备的磁性分离柱上。流出部分是负选择的活细胞部分,磁性保留部分是正选择的死细胞。
- 将活细胞流出物收集在 15 mL 离心管中。用 2 mL 1x 结合缓冲液冲洗含有细胞悬液的 1.5 mL 微管和色谱柱,并将流出物收集在同一 15 mL 管中。
- 以300 x g 离心5分钟。在不破坏细胞沉淀的情况下除去上清液。
- 加入 1 mL PBS-BSA 溶液,并使用宽孔移液器吸头移液 5 次轻轻混合。将细胞悬液转移到 1.5 mL 微管中。
- 以300 x g 离心5分钟。在不破坏细胞沉淀的情况下除去上清液。
- 加入 1 mL PBS-BSA 重悬沉淀,重复洗涤步骤共洗涤两次。
- 将细胞重悬于 100 μL PBS-BSA 溶液中。通过移液 10 次轻轻混合。
- 使用前面描述的方法(步骤3.1和步骤3.2)确定细胞的浓度和活力。要继续下一步,请确保细胞计数为 ≥100,000 个细胞。有关代表性结果,请参见 图2 。
注意:冷冻保存导致活细胞初始起始物质损失约40%。根据起始细胞数量,磁柱上的磁珠分离可提高细胞活力,但细胞总数将增加两倍至五倍。仅当有足够的起始材料可用时,才建议使用基于色谱柱的磁性试剂盒去除死细胞。
6. 细胞核分离
注意:snATAC和snRNA-seq组合使用干净和完整的细胞核悬浮液进行。建议针对所用细胞类型优化裂解条件(裂解时间和NP40浓度)。最佳裂解时间点和去垢剂浓度是在不破坏核形态的情况下导致最大数量的细胞裂解的时间点和去垢剂浓度。通过使用摆动式斗式离心机而不是固定角度离心机,可以减少细胞/细胞核的损失。为了尽量减少塑料上的细胞核滞留,建议使用低滞留移液器吸头和离心管。这可以增加细胞核的恢复。用5%BSA包覆移液器吸头和离心管是一种更便宜但更耗时的替代方案。
- 用70%乙醇和RNase去除溶液清洁工作场所和材料。
- 将摆动桶离心机预冷至4°C。 新鲜制备裂解缓冲液、裂解稀释缓冲液、0.1x裂解缓冲液和洗涤缓冲液(见 表1)。将缓冲液保持在冰上。
- 在摆动桶离心机中以500× g 离心细胞悬液在4°C下离心5分钟。轻轻除去所有上清液,不要接触管的底部,以避免细胞沉淀移位。
- 加入 100 μL 冷藏的 0.1x 裂解缓冲液。通过移液 10 次轻轻混合。在冰上孵育5分钟。
- 加入 1 mL 冷冻洗涤缓冲液,通过移液轻轻混合 5 次。在4°C下以500× g 离心5分钟。 在不破坏细胞核沉淀的情况下除去上清液。
- 用冷却洗涤缓冲液重复洗涤,总共洗涤三次。准备稀释的细胞核缓冲液。重悬后,将细胞核储备溶液保持在冰上。
7. 分离细胞核的质量和数量评估
注意:根据初始细胞计数并估计细胞裂解期间约50%的细胞核损失,将适当数量的细胞重悬于冷稀释的细胞核缓冲液中。使用冷却稀释的细胞核缓冲液计算重悬体积基于目标细胞核回收率和制造商用户指南推荐的相应细胞核原液浓度。见 《补充议定书1》中这种计算的例子。
- 根据初始细胞计数并估计细胞裂解期间约50%的细胞核损失,将适当数量的细胞重悬于冷稀释的细胞核缓冲液中。
- 确定实际的细胞核浓度。将 2 μL 细胞核储备液与 8 μL 稀释的细胞核缓冲液混合,并将混合物添加到预先等分的 10 μL 台盼蓝或 EthD-1/钙黄绿素 AM 工作溶液中。使用自动细胞计数器计数细胞核。少于5%的细胞应该是活的。有关代表性结果,请参见 图3 。
- 计算细胞核储备液的体积和稀释的细胞核缓冲液的体积,以获得转位反应推荐浓度下5μL的总体积(请参阅制造商的用户指南)。根据用户指南17立即进行转置反应。
注意:从转位反应到构建ATAC和GEX文库的所有步骤均根据用于snRNA-seq和snATAC-seq组合的试剂盒的用户指南17执行。
8. snRNA-seq和snATAC-seq文库的质量分析
- 在进行二代测序之前,请验证最终snATAC-seq和基因表达GEX文库的质量和大小分布。使用片段分析系统评估文库中鉴定的序列的质量和数量。具有代表性的质量评估结果见 图4 。
注意:snATAC-seq文库的最终迹线应显示核小体缠绕的周期性,大小范围应为200 bp至几Kbp,而基因表达文库中的大小应为300 bp至600 bp。
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Representative Results
与用于单细胞方法的单细胞悬液制备相比,单核悬浮液的制备更具挑战性,并且需要更高的分辨率和处理。成功结合snRNA-seq和snATAC-seq的关键因素是干净且完整的细胞核悬浮液。高效细胞核分离的方案必须适应每种组织类型和条件(新鲜或冷冻)。在这里,描述了一种优化的方案,用于从冷冻小鼠胚胎心脏细胞中分离细胞核。从胚胎心脏区域解剖和心脏细胞解离到细胞核分离的所有步骤总结在 图1中。对于起始材料,建议使用1 x 105-1 x 106 个细胞的细胞计数和>70%的细胞活力进行有效的细胞核分离。 如图2所示,该协议中执行的解冻后分类和去除死细胞的额外步骤允许获得具有显着更高细胞活力的更清洁的细胞悬液并提高起始样品的质量。除了细胞核分离外,该协议还提供了有关如何评估分离细胞核的质量和数量的详细信息(图3)。分离细胞核的质量极大地影响了snRNA-seq和snATAC-seq组合数据的质量;在这里,通过评估核膜形态来评估分离的细胞核的质量。分离的细胞核在明场显微镜下呈现光滑均匀的圆形,如图 3C所示,表明有效的分离过程。为了获得更高的准确性,使用了两种不同的计数方法,包括台盼蓝和基于荧光的活力评估试剂盒,以量化细胞和细胞核。荧光测定用于根据细胞完整性和细胞内酯酶活性确定细胞活力。该染料溶液允许通过同时观察指示细胞内酯酶活性的绿色荧光钙黄绿素AM和反映细胞完整性丧失的红色荧光乙锭同源二聚体1来区分活细胞和死细胞。使用荧光染料进行计数有助于将细胞核与细胞团块和碎片区分开来。使用该协议,细胞活力从细胞核分离前的80%-90%变为细胞核分离后的<5%,如图 3A,B所示。
将我们的程序与现有方法进行了比较,现有方法涉及直接在液氮中冷冻新鲜组织并在没有事先酶解离的情况下执行裂解步骤(补充方案2和补充图1)。对两种方法都进行了测试,以确定哪种方法可提供质量更好的细胞核悬浮液。快速冷冻整个胚胎心脏组织产生了高比例的非裂解细胞检测为活细胞,表明细胞裂解不适当(补充图1A)。尽管通过过滤器过滤,仍观察到聚集体和非单个细胞(补充图1A,B)。
分离的细胞核用于生成联合snATAC-seq和snRNA-seq的文库。 图4 显示了用于构建基因表达(GEX)文库和ATAC文库的cDNA的质量控制结果。使用自动电泳进行质量控制(图5A)。对mRNA衍生的cDNA进行了定量,产量足以用于GEX文库构建。获得了~300 bp至600 bp的高质量GEX文库和周期性核小体缠绕范围为200 bp至7 kbp的高质量ATAC文库。这些文库通过高通量测序进行测序,并成功生成单核基因表达和染色质可及性(图5A)。这些原始数据已准备好进行解复用和生物信息学分析,以生成小鼠E9.5心脏祖细胞的转录和表观遗传学分析。SnRNA-seq和snATAC-seq使用Seurat Toolkit for Single Genomics24 的无监督聚类,基于已知的标记基因进行聚类、鉴定和标记。该初步分析证实了E9.5处存在所有预期的心脏细胞类型(图5B)。
上述所有结果都支持该协议在从冷冻胚胎心脏细胞中分离适合下游单核方法的细胞核方面的成功。
图 1:snRNA-seq 和 snATAC-seq 组合分析样品制备中主要步骤的表示。 该流程图概括了所有步骤,包括心脏组织解剖和心脏细胞解离、细胞冻融、通过去除死细胞纯化活细胞以及细胞核分离,这些步骤是为了同时检测同一细胞的 mRNA 和染色质可及性而进行的。缩写:PBS = 磷酸盐缓冲盐水;BSA = 牛血清白蛋白;RT = 室温。创建于 BioRender.com 请单击此处查看此图的大图。
图2:死细胞分选后优化解冻细胞的活力。 图像显示了使用台盼蓝排除染料去除死细胞之前(顶部)和之后(底部)使用自动细胞计数器的细胞计数和活力。 请点击此处查看此图的大图。
图3:细胞核制备的质量控制 。 (A,B)显示使用自动细胞计数器在(顶部)和之后(底部)细胞核分离的细胞计数和活力的图像。使用两种计数方法:(A)荧光死亡率测定和(B)台盼蓝测定。(C)显示细胞核分离质量的图像。使用明场和荧光显微镜以20倍(比例尺= 50μm)拍摄图像。明场图像(左)显示核形态;RFP(中)显示失去膜完整性的细胞,换句话说,孤立的细胞核;而通常表示活细胞酯酶活性的GFP(右)在这里证实了细胞核悬浮液中没有活细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图4:单细胞基因表达和ATAC文库的质量控制。 使用自动电泳进行 DNA 分析,显示 cDNA(顶部)、GEX 文库(中)和 ATAC 文库(底部)的质量和大小分布。对于cDNA定量,选择范围为200 bp至8,900 bp的区域,生物分析仪估计cDNA浓度(以pg/μL为单位;红色圆圈)。获得了足够的cDNA产量以进行GEX文库构建。 请点击此处查看此图的大图。
图 5:使用细胞游侠软件评估的样品性能25. (A) 交叉灵敏度图,显示 x 轴上每个条形码的峰和 y 轴上每个条形码的 RNA 唯一分子标识符 (UMI) 中的转位事件。正如预期的那样,细胞主要位于右上角,具有高RNA和ATAC数据。观察到细胞和非细胞之间的明显分离(空的GEM,背景信号)。(B) scRNA-seq(左)和 scATAC-seq(右)中所有捕获细胞的代表性均匀流形近似和投影 (UMAP) 图,按簇身份着色并根据细胞类型分组。观察到簇的良好分离。GEX和ATAC联合原始数据是通过对解剖的E9.5小鼠胚胎心脏区域的7,000个细胞核进行测序获得的。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1:从涉及直接在液氮中冷冻新鲜组织的现有方法中分离细胞核的质量控制。 (A) 显示使用自动细胞计数器和台盼蓝作为通过 40 μm 过滤器过滤之前(顶部)和之后(底部)排除染料分离的细胞核计数的图像。高比例的非裂解细胞被检测为活细胞。检测到20%活细胞表明细胞裂解不当。黑色箭头表示聚合。(B)显示分离核质量的图像。使用明场和荧光显微镜在20x(顶部和中间,比例尺为50μm)和40x(底部比例尺为25μm)拍摄图像。明场图像(左)显示了核形态;RFP(右)显示了失去膜完整性的细胞,换句话说,孤立的细胞核。黑色箭头表示由碎片附着的多个原子核。 请点击此处下载此文件。
表1:程序中使用的缓冲液和溶液表。请按此下载此表格。
补充方案1:评估分离核的数量。请点击此处下载此文件。
补充方案2:从速冻组织中分离细胞核。请点击此处下载此文件。
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Discussion
通过结合snRNA-seq和snATAC-seq研究对发育中心脏的细胞组成的分析,可以更深入地了解先天性心脏病的起源26。一些研究实验室研究了心脏组织冷冻保存对snRNA-seq27的影响。在比较不同的实验条件时,使用来自人类疾病小鼠模型的新鲜微解剖组织进行snRNA-seq和snATAC-seq在逻辑上可能具有挑战性。对于给定的开发阶段,一个困难是必须在同一次运行中处理对照组和实验组,以减少样品处理引入的技术可变性。当无法处理新鲜组织时,根据我们的结果,建议解离然后冷冻保存而不是快速冷冻整个胚胎心脏组织。选择一种方法而不是另一种方法是基于这样一个事实,即如果心脏组织是整个冷冻的,解冻后分离活的单细胞更具挑战性。但是,如果组织解离方案未优化,则最好将整个组织快速冷冻。解离后冷冻保存是优选的,因为这种组织解离方案产生>90%的新鲜活细胞,没有细胞类型偏差。
这种方法有几个好处,例如使用冷冻细胞,这消除了对新鲜组织的需求,以及使用单细胞解离步骤,允许分离完整的单核;事实上,这对于下游单细胞分析至关重要。然而,酶解离可能会在细胞群中诱导转录偏差。酶促细胞解离会干扰细胞微环境,从而诱导大多数细胞类型的转录变化28。这些变化的主要决定因素是解离时间,而不是细胞类型29。为了缓和解离诱导的伪影,遵循推荐的消化时间很重要。在不同组织中发表的文献表明,30分钟或更短的消化时间诱导微小的转录变化28,30。此外,生物信息学干预可用于最大限度地减少数据失真31,32。
获得纯净完整的单核是单核基因组学中最重要的因素。由于细胞簇或有机碎片的存在,单细胞平台的微流体室堵塞导致数据质量差,或者更成问题的是实验失败。在此过程中,通过结合酶解离,冷冻保存和活心脏祖细胞的纯化来修改现有方案。我们的程序允许分离纯细胞核,而无需进行FACS分选。使用该程序,我们获得了高质量的核悬浮液,没有结块,几乎没有碎片,并且完整的单核。细胞分离步骤对于避免潜在的细胞核聚集至关重要;事实上,这可以通过使用大型移液器吸头轻柔移液或过滤细胞核来避免。在不同步骤中使用滤光片以及随后在光学显微镜下观察可以防止此类问题。
此处描述的方案已成功用于从E9.5心脏祖细胞获得的相同细胞核制备的snRNA-seq和snATAC-seq分析。该方法可用于妊娠野生型小鼠与先天性心脏缺陷小鼠模型。先天性心脏缺陷可能是由于控制心脏祖细胞分化、增殖、迁移和存活的途径中断而发生的33,34。为了更好地了解这些缺陷的起源,这项研究特别关注胚胎阶段9.5,其中存在先天性心脏缺陷中受影响的主要区域的祖细胞,特别是第二心野11 和神经嵴35的心脏祖细胞。将该程序应用于成年小鼠心脏和人心脏的细胞需要优化协议,特别是在细胞解离和裂解步骤方面。
手动和自动细胞计数之间的主要考虑因素是成本、劳动力和准确性。自动计数器比大多数熟练的科学家执行手动计数更快。特别是在处理大量样品时,能够简单地按计数并查看结果是非常有益的。这一点很重要,因为一旦细胞核被分离出来,就必须对其进行快速处理,以避免失去其完整性。自动化系统的主要准确性优势是这些系统消除了用户或实验室之间的差异。另一个优点是自动化系统通常比血细胞计数器具有更大的视野。当细胞/细胞核的数量或细胞/细胞核的浓度较低时,这种更大的视野肯定比传统的手动方法更具优势。
当非离子洗涤剂的浓度过高时,可以观察到高百分比的线粒体DNA污染。通过降低其在裂解缓冲液中的浓度,可以在不降低细胞核产量的情况下减少这种污染。使用含有0.1%去垢剂的裂解缓冲液进行的实验获得了最令人满意的结果。在摆动桶中旋转细胞核也可以减少颗粒中线粒体的数量。
具有适当比例的Tn5转座酶与细胞核对于成功的snATAC-seq13,14至关重要。例如,由于染色质封闭和测序文库复杂性低,Tn5过多可能导致高背景,而亚裂解可能不会产生完整的PCR扩增文库13。为了准确确定细胞核的数量,我们使用了两种互补方法。
多模态组学数据集提供了同时研究多个层次基因组组织的机会9,36。RNA和ATAC联合多模态方法能够研究上游调节因子和下游代谢基因,并为在单细胞分辨率的心脏发育背景下研究转录网络和染色质结构提供了一种全面的方法。该单核分离方案与表达和染色质数据集的单独和联合评估兼容。染色质可及性是调节的重要表观遗传水平,因为它使转录调节因子在特定基因组位点8,9,10,11,12,13具有活性。因此,染色质谱中的DNA序列提供了关于数十种可能的转录因子的身份和靶位点的大量信息。将snATAC-seq获得的信息与snRNA表达谱进行比较有助于确定最相关的转录因子,然后可以通过Cut&Run37进一步分析。我们希望该程序将帮助感兴趣的研究人员,并鼓励他们使用这种强大的方法进行研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了 ERA-CVD-2019 和 ANR-JCJC-2020 对 SS 的支持。我们感谢U 1251/马赛医学遗传学实验室的基因组学和生物信息学设施(GBiM)以及匿名审稿人提供的宝贵意见。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B.
Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020). - Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F.
Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014). - Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).