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Developmental Biology

एकल-कोशिका संकल्प पर एपिजीनोम और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए माउस कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं से नाभिक अलगाव

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65328
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 1
1Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, 2Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

Summary

यहां, हम सेल नाभिक तैयारी का वर्णन करने वाला एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एकल कोशिकाओं में हृदय ऊतक के सूक्ष्मविच्छेदन और एंजाइमेटिक पृथक्करण के बाद, पूर्वज कोशिकाओं को फ्रीज किया गया था, इसके बाद शुद्ध व्यवहार्य कोशिकाओं का अलगाव किया गया था, जिसका उपयोग एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए किया गया था और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विश्लेषण के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल-नाभिक परख का उपयोग किया गया था।

Abstract

विकासशील हृदय एक जटिल संरचना है जिसमें जटिल नियामक तंत्र द्वारा नियंत्रित विभिन्न पूर्वज कोशिकाएं होती हैं। व्यक्तिगत कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन स्थिति की परीक्षा सेल प्रकार और स्थिति की पहचान की अनुमति देती है। एकल-कोशिका अनुक्रमण दृष्टिकोण ने कार्डियक पूर्वज कोशिका विषमता की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं का खुलासा किया है। हालांकि, ये विधियां आम तौर पर ताजा ऊतक तक ही सीमित होती हैं, जो विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ अध्ययन को सीमित करती हैं, क्योंकि तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए ताजा ऊतक को एक ही समय में संसाधित किया जाना चाहिए। इसलिए, इस क्षेत्र में उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एसएनएटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) और एकल-नाभिक परख जैसे तरीकों से डेटा का उत्पादन करने के लिए आसान और लचीली प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। यहां, हम बाद में एकल-नाभिक दोहरे-ओमिक्स (संयुक्त एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक) के लिए नाभिक को तेजी से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के जमे हुए नमूनों से नाभिक के अलगाव की अनुमति देती है और इसे माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग करने वाले प्लेटफार्मों के साथ जोड़ा जा सकता है।

Introduction

जन्म दोषों में, जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) सबसे आम हैं, जोहर साल लगभग 1% जीवित जन्मों में होते हैं। आनुवंशिक उत्परिवर्तन केवल अल्पसंख्यक मामलों में पहचाने जाते हैं, जिसका अर्थ है कि अन्य कारण, जैसे जीन विनियमन में असामान्यताएं, सीएचडी 2,3 के एटियलजि में शामिल हैं। कार्डियक विकास विविध और अंतःक्रियात्मक सेल प्रकारों की एक जटिल प्रक्रिया है, जिससे कारण नॉनकोडिंग म्यूटेशन की पहचान और जीन विनियमन पर उनके प्रभाव चुनौतीपूर्ण हो जाते हैं। हृदय का ऑर्गेनोजेनेसिस सेलुलर पूर्वजों के साथ शुरू होता है जो हृदय कोशिकाओं के विभिन्न उपप्रकारों को जन्म देते हैं, जिनमें मायोकार्डियल, फाइब्रोब्लास्ट, एपिकार्डियल और एंडोकार्डियल कोशिकाएं 4,5 शामिल हैं। एकल-कोशिका जीनोमिक्स हृदय के विकास का अध्ययन करने और स्वास्थ्य और रोग6 में सेलुलर विषमता के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि के रूप में उभर रहा है। विभिन्न मापदंडों के एक साथ माप और कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों के विस्तार के लिए बहु-ओमिक्स विधियों के विकास ने सामान्य और रोगग्रस्त हृदय6 में सेल प्रकार और उपप्रकारों की खोज की सुविधा प्रदान की है। यह लेख माउस भ्रूण से प्राप्त जमे हुए कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय एकल-नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो डाउनस्ट्रीम एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक (साथ ही एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक संयुक्त) 7,8,9 के साथ संगत है।

एटीएसी-सेक एक मजबूत विधि है जो नियामक खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों की पहचान और न्यूक्लियोसोम10,11 की स्थिति की अनुमति देती है। इस जानकारी का उपयोग प्रतिलेखन कारकों के स्थान, पहचान और गतिविधि के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए किया जाता है। क्रोमैटिन कारकों की गतिविधि, जिसमें रीमॉडेलर्स शामिल हैं, साथ ही आरएनए पोलीमरेज़ की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि, का विश्लेषण किया जा सकता है, इस प्रकार, क्योंकि विधि क्रोमैटिन संरचना 1,2 में मात्रात्मक परिवर्तनों को मापने के लिए अत्यधिक संवेदनशील है। इस प्रकार, एटीएसी-सेक एक विशिष्ट सेल प्रकार में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को नियंत्रित करने वाले तंत्र को उजागर करने के लिए एक मजबूत और निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है। एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल को एकल कोशिकाओं में क्रोमैटिन पहुंच को मापने के लिए भी मान्य किया गया है, जो सेल आबादी10,12,13 के भीतर क्रोमैटिन आर्किटेक्चर में परिवर्तनशीलता का खुलासा करता है।

यद्यपि हाल के वर्षों में एकल कोशिकाओं के क्षेत्र में उल्लेखनीय प्रगति हुई है, मुख्य कठिनाईइन प्रयोगों को करने के लिए आवश्यक ताजा नमूनों का प्रसंस्करण है। इस कठिनाई को दरकिनार करने के लिए, जमे हुए हृदय ऊतक या कोशिकाओं15,16 के साथ एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक जैसे विश्लेषण करने के उद्देश्य से विभिन्न परीक्षण किए गए हैं।

एकल-कोशिका जीनोमिक्स डेटा17 का विश्लेषण करने के लिए कई प्लेटफार्मों का उपयोग किया गया है। एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति और एटीएसी प्रोफाइलिंग के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्लेटफॉर्म कई माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट एनकैप्सुलेशन17 के लिए प्लेटफॉर्म हैं। चूंकि ये प्लेटफ़ॉर्म माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग करते हैं, मलबे या समुच्चय सिस्टम को रोक सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप गैर-उपयोग योग्य डेटा होता है। इस प्रकार, एकल-कोशिका अध्ययन की सफलता व्यक्तिगत कोशिकाओं / नाभिक के सटीक अलगाव पर निर्भर करती है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल जन्मजात हृदय दोष18,19,20,21,22,23 को समझने के लिए एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक का उपयोग करके हाल के अध्ययनों के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करता है। यह प्रक्रिया माउस कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद ताजा सूक्ष्मविच्छेदित हृदय ऊतक के एंजाइमेटिक पृथक्करण का उपयोग करती है। पिघलने के बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं को शुद्ध किया जाता है और परमाणु अलगाव के लिए संसाधित किया जाता है। इस काम में, माउस कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं की एक ही परमाणु तैयारी से एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक डेटा प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था।

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Protocol

इस अध्ययन में अपनाई गई पशु प्रक्रिया को एक्स-मार्सिले विश्वविद्यालय (सी 2 ईए -14) की पशु नैतिकता समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु प्रयोग के लिए नियुक्त राष्ट्रीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था (मिनिस्टेरे डी एल'एजुकेशन नेशनल, डी एल'एनसेग्नेमेंट सुपेरियर एट डी ला रेचरचे; प्राधिकरण Apafis N°33927-2021111715507212)।

1. विच्छेदन से पहले समयबद्ध संभोग की स्थापना करना।

  1. माउस भ्रूण उत्पन्न करने के लिए, हृदय क्षेत्र अलगाव से 9.5 दिन पहले वयस्क चूहों के बीच एक समयबद्ध संभोग करें। इस प्रक्रिया में, 2-6 महीने की आयु के जंगली-प्रकार सी 57बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग किया गया था, और रात भर समय पर संभोग किया गया था।
  2. अगली सुबह, जांचें कि क्या मादा चूहों में योनि प्लग है। उस दिन पर विचार करें जब प्लग को भ्रूण दिवस (ई) 0.5 के रूप में पहचाना जाता है।

2. ऊतक तैयारी और सेल अलगाव

  1. गर्भधारण के 9.5 दिन बाद सीओ 2 के माध्यम से 2-6 महीने की गर्भवती महिला सी 57बीएल /6 जे को इच्छामृत्यु दें, जिसमें गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद बढ़ती एकाग्रता हो। पेट के निचले हिस्से को 70% इथेनॉल से साफ करें।
    नोट: गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से पहले एनेस्थेटिक्स के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह भ्रूण को पर्यावरणीय परिवर्तनों के लिए उजागर करेगा जो बाद के ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक अध्ययनों को प्रभावित कर सकते हैं।
  2. कैंची से पेट और पेरिटोनियम खोलें। गर्भाशय के सींगों की कल्पना करें, और दोनों सींगों को आबकारी करने के लिए बल का उपयोग करें।
  3. सींगों को 1% एफबीएस के साथ ठंडे पूर्ण माध्यम वाले पेट्री डिश में रखें। जबकि किसी विशिष्ट मात्रा की आवश्यकता नहीं है, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि भ्रूण पूरी तरह से माध्यम में डूबे हुए हैं। प्रति 10 सेमी पेट्री डिश में 10 एमएल की अनुमानित मात्रा उपयुक्त है।
  4. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत 5x आवर्धन पर सेट किया गया है और बल का उपयोग करके, प्रत्येक भ्रूण से एंडोमेट्रियल ऊतक, प्लेसेंटा और जर्दी थैली को हटा दें।
  5. भ्रूण को 1% एफबीएस के साथ ठंडे पूर्ण माध्यम के साथ पेट्री डिश में रखें। भ्रूण के हृदय क्षेत्र का विच्छेदन, जैसा कि चित्र 1 में चित्रित योजनाबद्ध भ्रूण पर वर्णित है, ठंडे पूर्ण माध्यम में।
  6. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पांच माउस भ्रूण से विच्छेदित हृदय क्षेत्रों को एक साथ पूल करें। बाल्टी सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक घुमाएं।
  7. एक स्विंगिंग बाल्टी सेंट्रीफ्यूज में आरटी पर 1 मिनट के लिए 300x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और ऊतक संस्कृति-ग्रेड पीबीएस के 1 एमएल जोड़कर ऊतकों को धो लें।
  8. 300 x g पर 1 मिनट के लिए RT पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और कुल दो धोने के लिए धोने के चरणों को दोहराएं। धोने को दो बार दोहराएं, पीबीएस को 0.05% ट्रिप्सिन / ईडीटीए (1 एक्स) के साथ बदलें।
  9. ऊतक पाचन के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के 50 μL जोड़ें। एक विस्तृत छिद्र फ़िल्टर टिप का उपयोग करके ऊपर और नीचे इशारों द्वारा 5 मिनट के बाद कोमल यांत्रिक पृथक्करण लागू करें।
  10. विघटित कोशिकाओं में 350 μL पूर्ण माध्यम जोड़कर ट्रिप्सिन पाचन गतिविधि को निष्क्रिय करें। 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से पुन: निलंबित कोशिकाओं को पारित करें।

3. सेल गिनती और व्यवहार्यता मूल्यांकन

नोट: सेल गिनती और व्यवहार्यता एकल-सेल प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं। एसएनएटीएसी-सेक दृष्टिकोण सेल संख्या में मामूली बदलावों के प्रति संवेदनशील है। बहुत कम कोशिकाएं क्रोमैटिन के अति-पाचन का कारण बनती हैं, जिसके परिणामस्वरूप पढ़ने की संख्या अधिक होती है और दुर्गम क्रोमैटिन क्षेत्रों (शोर) का मानचित्रण होता है। इसी तरह, बहुत अधिक कोशिकाएं होने से उच्च-आणविक-भार वाले टुकड़े उत्पन्न होते हैं जिन्हें अनुक्रमित करना कठिन होता है। सेल और नाभिक सांद्रता के सटीक निर्धारण के लिए, सेल गिनती और व्यवहार्यता का मूल्यांकन दो अलग-अलग तरीकों से किया गया था।

  1. सेल गिनती के लिए एक ट्राइपैन ब्लू परख करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. भंवर 0.4% ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग समाधान, 2,000 x g पर कमरे के तापमान पर 10 सेकंड के लिए स्पिन करें, और 10 μL को माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. एक पिपेट का उपयोग करके, सेल निलंबन को मिलाएं, और पहले से ही एलिकोट किए गए 10 μL ट्राइपैन ब्लू समाधान में 10 μL निलंबन जोड़ें। एक पिपेट के साथ 10 बार ध्यान से मिलाएं।
    3. दाग वाली कोशिकाओं के 10 μL को एक गिनती स्लाइड में स्थानांतरित करें। सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता की स्वचालित रूप से गणना करने के लिए स्लाइड को काउंटर में रखें।
  2. मृत्यु दर का प्रतिदीप्ति-आधारित मूल्यांकन करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    नोट: यह परख सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए फ्लोरोसेंट रंजक (एथिडियम होमोडीमर -1, ईटीएचडी -1, और कैल्सीन एएम) के उपयोग पर आधारित है। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग किया गया था, और उचित तैयारी और उपयोग के लिए प्रदाता के निर्देशों का पालन किया गया था।
    1. पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए 1 एमएल बाँझ ऊतक-संस्कृति ग्रेड डी-पीबीएस में आपूर्ति किए गए 2 एमएम ईटीएचडी -1 स्टॉक समाधान के 5 μL को जोड़कर और 5 सेकंड के लिए भंवर जोड़कर 10 μM EthD-1 समाधान तैयार करें।
    2. आपूर्ति किए गए 4 एमएम कैल्सीन एएम स्टॉक समाधान के 2.5 μL को पहले से तैयार ईटीएचडी -1 समाधान में स्थानांतरित करें। पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए 5 सेकंड के लिए भंवर।
    3. परिणामी 10 μM EthD-1 और 10 μM कैल्सीन AM वर्किंग सॉल्यूशन में से 10 μL सेल सस्पेंशन में जोड़ें।
      नोट: कैल्सीन जलीय घोल में हाइड्रोलिसिस के लिए अतिसंवेदनशील है, इसलिए 1 दिन के भीतर इस काम करने वाले समाधान का उपयोग करें।
    4. दाग वाली कोशिकाओं के 10 μL को एक गिनती स्लाइड पर स्थानांतरित करें। स्लाइड को स्वचालित फ्लोरोसेंट सेल काउंटर में डालें। जीएफपी फिल्टर का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं और आरएफपी फिल्टर के साथ मृत कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: दो गिनती विधियों ने समान सेल गणना और व्यवहार्यता दी, और ताजा विघटित कोशिकाओं की कुल संख्या प्रति भ्रूण हृदय क्षेत्र (0.06 मिमी3) में लगभग 20,000 कोशिकाओं का अनुमान लगाया गया था।

4. सेल फ्रीजिंग

  1. सेल निलंबन को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूब के तल को छूने के बिना सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें, और 1 मिलीलीटर ठंडा ठंड माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. सेल सस्पेंशन को प्री-कूल्ड क्रायोवियल में स्थानांतरित करें, और क्रायोवियल को प्री-कूल्ड फ्रीजिंग कंटेनर में रखें।
  3. कंटेनर को 4 घंटे से 8 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। डाउनस्ट्रीम सिंगल-न्यूक्लियस आरएनए और एटीएसी अनुक्रमण प्रयोगों के लिए क्रायोवियल को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    नोट: क्रायोवियल को उपयोग से पहले सूखी बर्फ पर ले जाया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, कोशिकाओं को सेल व्यवहार्यता के नुकसान के बिना कम से कम 6 महीने के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है। बर्फ के क्रिस्टल के गठन को रोकने के लिए भंडारण तापमान को हर समय -150 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखा जाना चाहिए।

5. सेल पिघलना और मृत कोशिकाओं को हटाना

  1. क्रायोवियल को 1-2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। क्रायोवियल में एक छोटा क्रिस्टल रहने पर इसे हटा दें।
  2. पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पूर्ण माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक पिपेट के साथ तीन बार मिलाएं। निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल गर्म पूर्ण माध्यम हो।
  3. पूरे सेल निलंबन को 30 μm छन्नी पर पारित करें। छन्नी को 1-2 मिलीलीटर गर्म पूर्ण माध्यम से कुल्ला करें, और उसी शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह एकत्र करें।
  4. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। पीबीएस के साथ एक बार धोएं, और सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सेल गोली को बाधित किए बिना सुपरनैटेंट को हटा दें।
  6. पेलेट कोशिकाओं में प्रदान किए गए चुंबकीय माइक्रोबीड्स के 100 μL जोड़ें, और एक विस्तृत-बोर पिपेट टिप का उपयोग करके पांच बार समरूप करें। आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. इस बीच, चुंबकीय पृथक्करण स्तंभ (क्षमता: 1 x 107 से 2 x 108 कोशिकाओं) को 1x बाइंडिंग बफर के 500 μL के साथ कुल्ला करें।
  8. एक बार इनक्यूबेशन पूरा हो जाने के बाद, 1x बाइंडिंग बफर के 500 μL के साथ माइक्रोबीड्स युक्त सेल सस्पेंशन को पतला करें।
  9. तैयार चुंबकीय पृथक्करण स्तंभ पर सेल निलंबन (0.6 μL) लागू करें। प्रवाह-माध्यम नकारात्मक रूप से चयनित जीवित कोशिका अंश है, और चुंबकीय रूप से बरकरार अंश सकारात्मक रूप से चयनित मृत कोशिकाएं हैं।
  10. 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जीवित सेल प्रवाह एकत्र करें। सेल सस्पेंशन और कॉलम वाले 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब को 1एक्स बाइंडिंग बफर के 2 एमएल के साथ कुल्ला करें, और उसी 15 एमएल ट्यूब में बहिस्त्राव एकत्र करें।
  11. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सेल गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  12. पीबीएस-बीएसए समाधान के 1 एमएल जोड़ें, और एक विस्तृत-छिद्र पिपेट टिप का उपयोग करके पांच बार पाइपिंग करके धीरे से मिलाएं। सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
  13. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सेल गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  14. गोली को फिर से निलंबित करने के लिए पीबीएस-बीएसए के 1 एमएल जोड़ें, और कुल दो धोने के लिए धोने के चरण को दोहराएं।
  15. पीबीएस-बीएसए समाधान के 100 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। 10 बार पाइप करके धीरे से मिलाएं।
  16. पहले वर्णित विधियों (चरण 3.1 और चरण 3.2) का उपयोग करके कोशिकाओं की एकाग्रता और व्यवहार्यता निर्धारित करें। अगले चरण में आगे बढ़ने के लिए, ≥ 100,000 कोशिकाओं की सेल गिनती सुनिश्चित करें। प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्र 2 देखें।
    नोट: क्रायोप्रिजर्वेशन के परिणामस्वरूप जीवित कोशिकाओं की प्रारंभिक प्रारंभिक सामग्री का लगभग 40% नुकसान होता है। कोशिकाओं की शुरुआती संख्या के आधार पर, चुंबकीय स्तंभ पर मोती पृथक्करण के परिणामस्वरूप उच्च सेल व्यवहार्यता होती है लेकिन कोशिकाओं की कुल संख्या को दो गुना से पांच गुना तक विभाजित किया जाता है। मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए कॉलम-आधारित चुंबकीय किट के उपयोग की सलाह केवल तभी दी जाती है जब पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री उपलब्ध हो।

6. नाभिक अलगाव

नोट: एसएनएटीएसी और एसएनआरएनए-सेक संयुक्त रूप से स्वच्छ और बरकरार नाभिक के निलंबन के साथ किए जाते हैं। प्रयुक्त सेल प्रकार के लिए लाइसिस स्थितियों (लाइसिस समय और एनपी 40 एकाग्रता) के अनुकूलन की सिफारिश की जाती है। इष्टतम लाइसिस टाइमपॉइंट और डिटर्जेंट एकाग्रता वे हैं जिनके परिणामस्वरूप परमाणु आकृति विज्ञान को बाधित किए बिना कोशिकाओं की अधिकतम संख्या होती है। कोशिकाओं/नाभिकों के नुकसान को एक निश्चित कोण सेंट्रीफ्यूज के बजाय स्विंगिंग बाल्टी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके कम किया जा सकता है। प्लास्टिक पर नाभिक प्रतिधारण को कम करने के लिए, कम-प्रतिधारण पिपेट युक्तियों और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह नाभिक वसूली को बढ़ा सकता है। 5% बीएसए के साथ पिपेट टिप्स और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की कोटिंग एक कम खर्चीला लेकिन अधिक समय लेने वाला विकल्प है।

  1. 70% इथेनॉल और आरएनएस हटाने वाले समाधान के साथ काम करने की जगह और सामग्री को साफ करें।
  2. बाल्टी सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक घुमाएं। ताजा लाइसिस बफर, लाइसिस तनुकरण बफर, 0.1 x लाइसिस बफर, और वॉश बफर तैयार करें ( तालिका 1 देखें)। बर्फ पर बफर बनाए रखें।
  3. एक स्विंगिंग बाल्टी सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल गोली को हटाने से बचने के लिए ट्यूब के निचले हिस्से को छूने के बिना धीरे से सभी सुपरनैटेंट को हटा दें।
  4. ठंडा 0.1x लाइसिस बफर के 100 μL जोड़ें। धीरे-धीरे 10 बार पाइप करके मिलाएं। बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. ठंडा धोने के बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे से पांच बार पाइपिंग करके मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। नाभिक गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  6. कुल तीन वॉश के लिए चिल्ड वॉश बफर के साथ वॉश को दोहराएं। पतला नाभिक बफर तैयार करें। पुन: निलंबन के बाद, नाभिक स्टॉक समाधान को बर्फ पर रखें।

7. पृथक नाभिक की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन

नोट: प्रारंभिक सेल गिनती के आधार पर और सेल लाइसिस के दौरान लगभग 50% नाभिक हानि का अनुमान लगाते हुए, ठंडे पतला नाभिक बफर में कोशिकाओं की उचित संख्या को फिर से निलंबित करें। ठंडा पतला नाभिक बफर के साथ रीसस्पेंशन वॉल्यूम की गणना लक्षित नाभिक वसूली और निर्माता के उपयोगकर्ता गाइड द्वारा अनुशंसित संबंधित नाभिक स्टॉक सांद्रता पर आधारित है। पूरक प्रोटोकॉल 1 में इस गणना का एक उदाहरण देखें।

  1. प्रारंभिक सेल गिनती के आधार पर और सेल लाइसिस के दौरान लगभग 50% नाभिक हानि का अनुमान लगाते हुए, ठंडे पतला नाभिक बफर में कोशिकाओं की उचित संख्या को फिर से निलंबित करें।
  2. वास्तविक नाभिक एकाग्रता निर्धारित करें। 2 μL नाभिक स्टॉक समाधान को 8 μL पतला नाभिक बफर के साथ मिलाएं और मिश्रण को ट्राइपैन ब्लू या EthD-1 / calceinAM वर्किंग सॉल्यूशन के पूर्व-एलिकोट 10 μL में जोड़ें। एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक की गणना करें। 5% से कम कोशिकाएं व्यवहार्य होनी चाहिए। प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्र 3 देखें।
  3. ट्रांसपोज़ेशन प्रतिक्रिया के लिए अनुशंसित एकाग्रता पर 5 μL की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए नाभिक स्टॉक की मात्रा और पतला नाभिक बफर की मात्रा की गणना करें (निर्माता के उपयोगकर्ता गाइड को देखें)। उपयोगकर्ता गाइड17 के अनुसार ट्रांसपोज़ेशन प्रतिक्रिया के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    नोट: ट्रांसपोज़ेशन प्रतिक्रिया से लेकर एटीएसी और जीईएक्स पुस्तकालयों के निर्माण तक के सभी चरणों को एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक संयुक्त17 के लिए उपयोग की जाने वाली किट के उपयोगकर्ता गाइड के अनुसार किया गया था।

8. एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक पुस्तकालयों का गुणवत्ता विश्लेषण

  1. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ने से पहले, अंतिम एसएनएटीएसी-सेक और जीन अभिव्यक्ति जीईएक्स पुस्तकालयों की गुणवत्ता और आकार वितरण को मान्य करें। टुकड़ा विश्लेषण प्रणालियों का उपयोग करके पुस्तकालयों में पहचाने गए अनुक्रमों की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें। प्रतिनिधि गुणवत्ता मूल्यांकन परिणामों के लिए चित्रा 4 देखें।
    नोट: एसएनएटीएसी-सेक पुस्तकालयों का अंतिम निशान न्यूक्लियोसोम घुमावदार की आवधिकता को दिखाना चाहिए, और आकार 200 बीपी से कई केबीपी तक होना चाहिए, जबकि जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय में आकार 300 बीपी से 600 बीपी तक होना चाहिए।

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Representative Results

एकल-सेल दृष्टिकोण के लिए एकल-सेल निलंबन की तैयारी की तुलना में, एकल-नाभिक निलंबन की तैयारी बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए उच्च स्तर के संकल्प और प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। सफल संयुक्त एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक के लिए महत्वपूर्ण कारक एक स्वच्छ और बरकरार नाभिक निलंबन है। कुशल नाभिक अलगाव के लिए प्रोटोकॉल को प्रत्येक ऊतक प्रकार और स्थिति (ताजा या जमे हुए) के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यहां, जमे हुए माउस भ्रूण हृदय कोशिकाओं से नाभिक के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। भ्रूण हृदय क्षेत्र विच्छेदन और कार्डियक सेल पृथक्करण से नाभिक अलगाव तक के सभी चरणों को चित्रा 1 में संक्षेपित किया गया है। प्रारंभिक सामग्री के लिए, कुशल नाभिक अलगाव के लिए 1 x 105-1 x 106 कोशिकाओं की एक सेल गिनती और एक सेल व्यवहार्यता >70% की सिफारिश की जाती है। जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, पिघलने के बाद मृत कोशिकाओं को सॉर्ट करने और हटाने के लिए इस प्रोटोकॉल में किए गए अतिरिक्त कदम ने काफी अधिक सेल व्यवहार्यता के साथ क्लीनर सेल निलंबन प्राप्त करने और शुरुआती नमूने की गुणवत्ता में सुधार करने की अनुमति दी। नाभिक अलगाव के अलावा, यह प्रोटोकॉल पृथक नाभिक की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करने के तरीके के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है (चित्रा 3)। पृथक नाभिक की गुणवत्ता एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक संयुक्त डेटा की गुणवत्ता को बहुत प्रभावित करती है; यहां, परमाणु झिल्ली आकृति विज्ञान के मूल्यांकन द्वारा पृथक नाभिक की गुणवत्ता का आकलन किया गया था। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत चित्रा 3 सी में दिखाए गए अनुसार पृथक नाभिक चिकनी और समान रूप से गोल दिखाई दिए, जो एक प्रभावी अलगाव प्रक्रिया का संकेत देता है। अधिक सटीकता के लिए, कोशिकाओं और नाभिक को निर्धारित करने के लिए, व्यवहार्यता के प्रतिदीप्ति-आधारित मूल्यांकन के लिए ट्राइपैन ब्लू और एक किट सहित दो अलग-अलग गिनती विधियों का उपयोग किया गया था। प्रतिदीप्ति परख का उपयोग सेलुलर अखंडता और इंट्रासेल्युलर एस्टरेज़ गतिविधि के आधार पर सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया गया था। यह डाई समाधान हरे फ्लोरोसेंट कैल्सीन एएम को एक साथ देखकर मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है, जो इंट्रासेल्युलर एस्टरेज़ गतिविधि को इंगित करता है, और लाल फ्लोरोसेंट एथिडियम होमोडीमर 1, जो सेलुलर अखंडता के नुकसान को दर्शाता है। गिनती के लिए फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करने से नाभिक को सेल क्लंप और मलबे से अलग करने में मदद मिलती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, कोशिका व्यवहार्यता नाभिक अलगाव से पहले 80% -90% से नाभिक अलगाव के बाद <5% तक पहुंच गई, जैसा कि चित्र 3 ए, बी में दिखाया गया है।

हमारी प्रक्रिया की तुलना मौजूदा विधि से की गई थी, जिसमें तरल नाइट्रोजन में सीधे ताजा ऊतक को फ्रीज करना और पूर्व एंजाइमेटिक पृथक्करण (पूरक प्रोटोकॉल 2 और पूरक चित्रा 1) के बिना लाइसिंग चरण करना शामिल है। दोनों दृष्टिकोणों का परीक्षण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि कौन सी विधि बेहतर गुणवत्ता वाले नाभिक निलंबन देती है। स्नैप-फ्रीजिंग पूरे भ्रूण कार्डियक ऊतक ने जीवित के रूप में पाए गए गैर-लिसेड कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत को जन्म दिया, जो अनुचित सेल लाइसिस (पूरक चित्रा 1 ए) का संकेत देता है। फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन के बावजूद समुच्चय और गैर-व्यक्तिगत कोशिकाओं को देखा गया (पूरक चित्रा 1 ए, बी)।

पृथक नाभिक का उपयोग संयुक्त एसएनएटीएसी-सेक और एसएनआरएनए-सेक के लिए पुस्तकालय ों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। चित्रा 4 जीन अभिव्यक्ति (जीईएक्स) लाइब्रेरी और एटीएसी लाइब्रेरी के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले सीडीएनए के गुणवत्ता नियंत्रण परिणामों को दर्शाता है। गुणवत्ता नियंत्रण स्वचालित वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 5 ए) का उपयोग करके किया गया था। एमआरएनए-व्युत्पन्न सीडीएनए की मात्रा निर्धारित की गई थी, और उपज जीईएक्स पुस्तकालय निर्माण में बाद के उपयोग के लिए पर्याप्त थी। ~ 300 बीपी से 600 बीपी तक की एक उच्च गुणवत्ता वाली जीईएक्स लाइब्रेरी और 200 बीपी से 7 केबीपी तक आवधिक न्यूक्लियोसोम वाइंडिंग के साथ एक उच्च गुणवत्ता वाली एटीएसी लाइब्रेरी प्राप्त की गई थी। इन पुस्तकालयों को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण द्वारा अनुक्रमित किया गया था और सफलतापूर्वक एकल-नाभिक जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन पहुंच (चित्रा 5 ए) उत्पन्न की गई थी। ये कच्चे डेटा माउस ई 9.5 कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल और एपिजेनेटिक प्रोफाइलिंग उत्पन्न करने के लिए डीमल्टीप्लेक्स और जैव सूचना त्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए तैयार थे। एकल जीनोमिक्स24 के लिए सेराट टूलकिट के साथ असुरक्षित क्लस्टरिंग का उपयोग करके ज्ञात मार्कर जीन के आधार पर एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक को क्लस्टर, पहचाना और लेबल किया गया था। इस प्रारंभिक विश्लेषण ने E9.5 (चित्रा 5B) पर सभी अपेक्षित कार्डियक सेल प्रकारों की उपस्थिति की पुष्टि की।

उपरोक्त सभी परिणाम नाभिक को अलग करने में इस प्रोटोकॉल की सफलता का समर्थन करते हैं जो जमे हुए भ्रूण हृदय कोशिकाओं से डाउनस्ट्रीम एकल नाभिक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं।

Figure 1
चित्रा 1: संयुक्त एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक प्रोफाइलिंग के लिए नमूना तैयारी में मुख्य चरणों का प्रतिनिधित्व। यह फ़्लोचार्ट हृदय ऊतक विच्छेदन और कार्डियक सेल पृथक्करण, सेल फ्रीजिंग और पिघलने, मृत कोशिकाओं को हटाकर लाइव सेल शुद्धिकरण और नाभिक अलगाव सहित सभी चरणों को पुन: प्रस्तुत करता है, जो एक ही सेल से एमआरएनए और क्रोमैटिन पहुंच का एक साथ पता लगाने के लिए किए जाते हैं। संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन; आरटी = कमरे का तापमान। BioRender.com के साथ बनाया गया कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मृत सेल सॉर्टिंग के बाद अनुकूलित पिघली हुई कोशिकाओं की व्यवहार्यता। ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण डाई का उपयोग करके मृत सेल हटाने से पहले (ऊपर) और बाद में (नीचे) एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल गिनती और व्यवहार्यता दिखाने वाली छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नाभिक की तैयारी का गुणवत्ता नियंत्रण । (ए, बी) नाभिक अलगाव से पहले (ऊपर) और बाद में (नीचे) एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल गिनती और व्यवहार्यता दिखाने वाली छवियां। दो गिनती विधियों का उपयोग किया गया था: (ए) फ्लोरोसेंट मृत्यु दर परख और (बी) ट्राइपैन ब्लू परख। (सी) नाभिक अलगाव की गुणवत्ता दिखाने वाली छवियां। ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवियों को 20x (स्केल बार = 50 μm) पर लिया गया था। ब्राइटफील्ड छवि (बाएं) परमाणु आकृति विज्ञान दिखाती है; आरएफपी (मध्य) उन कोशिकाओं को दिखाता है जिन्होंने अपनी झिल्ली अखंडता खो दी, दूसरे शब्दों में, पृथक नाभिक; और जीएफपी (दाएं) जो आम तौर पर यहां जीवित कोशिकाओं की एस्टरेज़ गतिविधि को इंगित करता है, नाभिक निलंबन में जीवित कोशिकाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति और एटीएसी पुस्तकालयों का गुणवत्ता नियंत्रण। स्वचालित वैद्युतकणसंचलन के साथ डीएनए विश्लेषण सीडीएनए (शीर्ष), जीईएक्स लाइब्रेरी (मध्य), और एटीएसी लाइब्रेरी (नीचे) की गुणवत्ता और आकार वितरण को दर्शाता है। सीडीएनए परिमाणीकरण के लिए, 200 बीपी से 8,900 बीपी तक के क्षेत्र का चयन किया गया था, और बायोएनालाइज़र ने सीडीएनए एकाग्रता (पीजी / μL में; लाल सर्कल) का अनुमान लगाया था। जीईएक्स पुस्तकालय निर्माण के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त सीडीएनए उपज प्राप्त की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सेल रेंजर सॉफ्टवेयर25 के साथ नमूना प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया। (ए) क्रॉस-सेंसिटिव प्लॉट एक्स-अक्ष पर प्रति बारकोड चोटियों में ट्रांसपोज़ेशन घटनाओं को दर्शाता है और वाई-अक्ष पर प्रति बारकोड आरएनए अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई) दिखाता है। जैसा कि अपेक्षित था, कोशिकाएं मुख्य रूप से ऊपरी-दाएं कोने में स्थित होती हैं, जिसमें उच्च आरएनए और एटीएसी डेटा होता है। कोशिकाओं और गैर-कोशिकाओं (खाली जीईएम, पृष्ठभूमि संकेत) के बीच एक स्पष्ट अलगाव देखा गया था। (बी) एससीआरएनए-सेक (बाएं) और एससीएटीएसी-सेक (दाएं) में सभी कैप्चर की गई कोशिकाओं का प्रतिनिधि समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण (यूएमएपी) प्लॉट क्लस्टर पहचान द्वारा रंगीन है और सेल प्रकारों के आधार पर समूहीकृत है। समूहों का एक अच्छा पृथक्करण देखा गया था। संयुक्त जीईएक्स और एटीएसी कच्चे डेटा को विच्छेदित ई 9.5 माउस भ्रूण हृदय क्षेत्र से 7,000 नाभिक ों को अनुक्रमित करने से प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: तरल नाइट्रोजन में सीधे ताजा ऊतक को फ्रीज करने वाली मौजूदा विधि से नाभिक अलगाव का गुणवत्ता नियंत्रण। (ए) एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके पृथक नाभिक की गिनती दिखाने वाली छवियां और 40 μm छन्नी के माध्यम से बहिष्करण डाई से पहले (ऊपर) और बाद में (नीचे) निस्पंदन के रूप में ट्राइपैन ब्लू को दर्शाती हैं। गैर-लाइसेड कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत जीवित के रूप में पाया गया था। 20% जीवित कोशिकाओं का पता लगाना अनुचित सेल लाइसिस को इंगित करता है। काले तीर समुच्चय का संकेत देते हैं। (बी) पृथक नाभिक की गुणवत्ता दिखाने वाली छवियां। छवियों को ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 20x (50 μm के स्केल बार के साथ शीर्ष और मध्य) और 40x (25 μm के स्केल बार के साथ नीचे) पर लिया गया था। ब्राइटफील्ड छवि (बाएं) परमाणु आकृति विज्ञान को दर्शाती है; आरएफपी (दाएं) उन कोशिकाओं को दिखाता है जिन्होंने अपनी झिल्ली अखंडता खो दी है, दूसरे शब्दों में, पृथक नाभिक। काले तीर मलबे से जुड़े नाभिक के गुणकों को इंगित करते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले बफर और समाधानों की तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक प्रोटोकॉल 1: पृथक नाभिक की मात्रा का आकलन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक प्रोटोकॉल 2: फ्लैश-जमे हुए ऊतक से नाभिक का अलगाव। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

संयुक्त एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक अध्ययनों द्वारा विकासशील हृदय की सेलुलर संरचना का विश्लेषण जन्मजात हृदय रोग26 की उत्पत्ति की गहरी समझ प्रदान करता है। कई शोध प्रयोगशालाओं ने एसएनआरएनए-सेक27 पर कार्डियक ऊतक क्रायोप्रिजर्वेशन के प्रभावों का अध्ययन किया है। मानव रोग के माउस मॉडल से ताजा सूक्ष्म-विच्छेदित ऊतक का उपयोग करके एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक का संचालन करना विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों की तुलना करते समय तार्किक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। विकास के किसी दिए गए चरण के लिए, एक कठिनाई यह है कि नमूना प्रसंस्करण द्वारा पेश की गई तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों को एक ही समय में संसाधित किया जाना चाहिए। जब ताजा ऊतक को संसाधित करना संभव नहीं होता है, तो हमारे परिणामों के आधार पर, पूरे भ्रूण के हृदय ऊतक को स्नैप-फ्रीज करने के बजाय अलग करने और फिर क्रायोप्रिजर्व करने की सिफारिश की जाती है। दूसरे पर एक विधि का विकल्प इस तथ्य पर आधारित है कि यदि हृदय के ऊतक पूरे जमे हुए हैं, तो पिघलने के बाद व्यवहार्य एकल कोशिकाओं को अलग करना बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, यदि ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल को अनुकूलित नहीं किया गया है, तो ऊतक को पूरे को स्नैप-फ्रीज करना बेहतर हो सकता है। क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद पृथक्करण को प्राथमिकता दी जाती है, यह देखते हुए कि यह ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल सेल-प्रकार पूर्वाग्रह के बिना >90% ताजा व्यवहार्य कोशिकाओं का उत्पादन करता है।

इस दृष्टिकोण के कई लाभ हैं, जैसे कि जमे हुए कोशिकाओं का उपयोग, जो ताजा ऊतक की आवश्यकता को समाप्त करता है, और एकल-कोशिका पृथक्करण चरण का उपयोग, जो बरकरार एकल नाभिक के अलगाव की अनुमति देता है; दरअसल, यह डाउनस्ट्रीम सिंगल-सेल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, एंजाइमेटिक पृथक्करण सेल आबादी में ट्रांसक्रिप्शनल पूर्वाग्रह को प्रेरित कर सकता है। एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ हस्तक्षेप करता है और इस प्रकार, अधिकांश सेल प्रकारों में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन ों को प्रेरित करताहै। इन परिवर्तनों का प्राथमिक निर्धारक पृथक्करण समय है, न कि सेल प्रकार29। पृथक्करण-प्रेरित कलाकृतियों को मॉडरेट करने के लिए अनुशंसित पाचन समय का पालन करना महत्वपूर्ण है। विभिन्न ऊतकों में प्रकाशित साहित्य इंगित करता है कि 30 मिनट या उससे कम का पाचन समय मामूली ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन28,30 को प्रेरित करता है। इसके अलावा, जैव सूचना विज्ञान हस्तक्षेप का उपयोग डेटा विकृतियों को कम करने के लिएकिया जा सकता है।

शुद्ध और बरकरार एकल नाभिक प्राप्त करना एकल-नाभिक जीनोमिक्स में सबसे महत्वपूर्ण कारक है। सेल क्लस्टर या कार्बनिक मलबे की उपस्थिति के कारण एकल-सेल प्लेटफार्मों के माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों के बंद होने से खराब डेटा गुणवत्ता या, अधिक समस्याग्रस्त रूप से, प्रयोगात्मक विफलता होती है। इस प्रक्रिया में, मौजूदा प्रोटोकॉल को एंजाइमेटिक पृथक्करण, क्रायोप्रिजर्वेशन और व्यवहार्य हृदय पूर्वज कोशिकाओं के शुद्धिकरण के संयोजन से संशोधित किया गया था। हमारी प्रक्रिया एफएसीएस छंटाई की आवश्यकता के बिना शुद्ध नाभिक के अलगाव की अनुमति देती है। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, हमने बिना झुरमुट के एक उच्च गुणवत्ता वाले परमाणु निलंबन प्राप्त किया, लगभग कोई मलबा नहीं, और बरकरार एकल नाभिक। संभावित नाभिक झुरमुट से बचने के लिए सेल अलगाव चरण महत्वपूर्ण है; दरअसल, बड़े पिपेट युक्तियों का उपयोग करके या नाभिक को फ़िल्टर करके सौम्य पाइपिंग से इससे बचा जा सकता है। विभिन्न चरणों में फिल्टर का उपयोग और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत बाद में अवलोकन ऐसे मुद्दों को रोक सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक ई 9.5 कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं से प्राप्त एक ही नाभिक तैयारी से एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक प्रोफाइलिंग के लिए उपयोग किया गया था। इस विधि का उपयोग जन्मजात हृदय दोषों के लिए गर्भवती जंगली प्रकार के चूहों बनाम माउस मॉडल में किया जा सकता है। जन्मजात हृदय दोष संभवतः उन मार्गों के विघटन के कारण होते हैं जो हृदयपूर्वज कोशिकाओं के भेदभाव, गुणन, प्रवास और अस्तित्व को नियंत्रित करते हैं। इन दोषों की उत्पत्ति को बेहतर ढंग से समझने के लिए, इस अध्ययन ने विशेष रूप से भ्रूण चरण 9.5 पर ध्यान केंद्रित किया, जिसमें जन्मजात हृदय दोषों में प्रभावित प्रमुख क्षेत्रों के पूर्वज मौजूद हैं, विशेष रूप से दूसरे हृदय क्षेत्र11 और तंत्रिका शिखा35 के हृदय पूर्वज। वयस्क माउस दिल और मानव हृदय की कोशिकाओं के लिए इस प्रक्रिया के आवेदन के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से सेल पृथक्करण और लाइसिस चरणों के संदर्भ में।

मैनुअल और स्वचालित सेल गिनती के बीच मुख्य विचार लागत, श्रम और सटीकता हैं। स्वचालित काउंटर मैन्युअल गिनती करने वाले अधिकांश कुशल वैज्ञानिकों की तुलना में तेज हैं। विशेष रूप से जब बड़ी संख्या में नमूनों से निपटते हैं, तो बस गिनती दबाने और परिणाम देखने में सक्षम होना बहुत लाभ होता है। यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है क्योंकि एक बार नाभिक अलग हो जाने के बाद, उन्हें अपनी अखंडता के नुकसान से बचने के लिए जल्दी से संसाधित किया जाना चाहिए। स्वचालित प्रणालियों का प्राथमिक सटीकता लाभ यह है कि ये सिस्टम उपयोगकर्ताओं या प्रयोगशालाओं के बीच परिवर्तनशीलता को समाप्त करते हैं। एक और लाभ यह है कि स्वचालित प्रणालियों में आमतौर पर हेमोसाइटोमीटर की तुलना में देखने का एक बड़ा क्षेत्र होता है। जब कोशिकाओं / नाभिक की संख्या या कोशिकाओं / नाभिक की एकाग्रता कम होती है, तो दृष्टिकोण का यह बड़ा क्षेत्र निश्चित रूप से पारंपरिक मैनुअल विधि पर एक लाभ है।

माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संदूषण का एक उच्च प्रतिशत तब देखा जा सकता है जब गैर-आयनिक डिटर्जेंट की एकाग्रता बहुत अधिक होती है। लाइसिस बफर में इसकी एकाग्रता को कम करके, नाभिक की उपज को कम किए बिना इस संदूषण को कम किया जा सकता है। 0.1% डिटर्जेंट युक्त लाइसिस बफर के साथ हमारे प्रयोगों में सबसे संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए गए थे। स्विंग बाल्टी में नाभिक को घुमाने से गोली में माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या भी कम हो सकती है।

नाभिक के लिए Tn5 ट्रांसपोसेस का उपयुक्त अनुपात होना सफल SNATAC-seq13,14 के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, बहुत अधिक Tn5 होने से बंद क्रोमैटिन और अनुक्रमण पुस्तकालयों की कम जटिलता के कारण उच्च पृष्ठभूमि हो सकती है, जबकि उप-लाइसिस के परिणामस्वरूप पूर्ण पीसीआर प्रवर्धित पुस्तकालय13 नहीं हो सकता है। नाभिक की संख्या को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए, हमने दो पूरक तरीकों का उपयोग किया।

मल्टीमॉडल ओमिक्स डेटासेट एक साथ 9,36 जीनोमिक संगठन के कई स्तरों की जांच करने का अवसर प्रदान करते हैं। संयुक्त आरएनए और एटीएसी मल्टीमॉडल दृष्टिकोण अपस्ट्रीम नियामकों और डाउनस्ट्रीम चयापचय जीन के अध्ययन को सक्षम बनाता है और एकल-कोशिका संकल्प पर हृदय विकास के संदर्भ में ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क और क्रोमैटिन आर्किटेक्चर के अध्ययन के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है। एकल-नाभिक अलगाव के लिए यह प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन डेटासेट के व्यक्तिगत और संयुक्त मूल्यांकन दोनों के साथ संगत है। क्रोमैटिन पहुंच विनियमन का एक महत्वपूर्ण एपिजेनेटिक स्तर है क्योंकि यह विशिष्टजीनोमिक साइटों 8,9,10,11,12,13 पर ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों की गतिविधि को सक्षम बनाता है। दर्जनों संभावित प्रतिलेखन कारकों की पहचान और लक्ष्य साइटों पर जानकारी की एक भीड़, इस प्रकार, क्रोमैटिन प्रोफ़ाइल में डीएनए अनुक्रम द्वारा प्रदान की जाती है। एसएनआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के साथ एसएनएटीएसी-सेक द्वारा प्राप्त जानकारी की तुलना सबसे प्रासंगिक प्रतिलेखन कारकों की पहचान करने में मदद कर सकती है, जिसे बाद में कट एंड रन37 द्वारा आगे विश्लेषण किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि यह प्रक्रिया इच्छुक शोधकर्ताओं की मदद करेगी और उन्हें अपने शोध के लिए इस शक्तिशाली विधि का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करेगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को ईआरए-सीवीडी-2019 और एएनआर-जेसीजेसी-2020 द्वारा एसएस द्वारा समर्थित किया गया था। मार्सिले मेडिकल जेनेटिक्स लैब से जीनोमिक्स और जैव सूचना विज्ञान सुविधा (जीबीआईएम) और मूल्यवान टिप्पणियां प्रदान करने के लिए अनाम समीक्षकों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl) Sigma 59222C-500ML 
BSA 10%  Sigma A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) 10X Genomics 1000285
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess III FL Thermofisher No catalog number
Digitonin (5%) Thermofisher BN2006
DMSO Sigma D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes  Eppendorf 22431021
D-PBS Thermofisher 14190094 Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns 10X Genomics 1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  10788561
HI-FBS Thermofisher A3840001 Heat inactivated
High sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Igepal CA-630 Sigma I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X Miltenyi Biotec 130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M1028-100ML
Milieu McCoy 5A  Thermofisher 16600082
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
NovaSeq 6000 S2 Illumina No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) Thermofisher 15070063
PluriStrainer Mini 40µm PluriSelect V-PM15-2021-12
Rock inhibitor Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn 10X Genomics 1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin Thermofisher 101R20
Sterile double-distilled water Thermofisher R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl) Sigma T2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%) Invitrogen T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X Thermofisher 25300054
Tween20 Sigma P9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl Labcon 1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8 ZEISS No catalog number

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 195 क्रोमैटिन पहुंच जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएसी-सेक कार्डियक पूर्वज कोशिकाएं जीन विनियमन
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