Summary
Denne protokollen beskriver ulike metoder som kan hjelpe i studiet av ATG9A-biologi, inkludert immunfluorescens etterfulgt av bildeanalyse, forbigående overekspresjonsbetraktninger og undersøkelse av ATG9A-glykosyleringsstatus ved bruk av western blot.
Abstract
Autofagi er en svært konservert vei som cellen bruker for å opprettholde homeostase, nedbryte skadede organeller, bekjempe invaderende patogener og overleve patologiske forhold. Et sett proteiner, kalt ATG-proteiner, utgjør kjernemaskineriet for autofagi og arbeider sammen i et definert hierarki. Studier de siste årene har forbedret vår kunnskap om autofagiveien. Senest har det blitt foreslått at ATG9A-vesikler er i hjertet av autofagi, da de kontrollerer den raske de novo-syntesen av en organell kalt fagoforen. Studien av ATG9A har vist seg utfordrende, siden ATG9A er et transmembranprotein, og det er tilstede i forskjellige membranrom. Som sådan er forståelsen av menneskehandelen et viktig element for å forstå autofagi. Her presenteres detaljerte metoder som kan brukes til å studere ATG9A og spesielt lokalisering ved hjelp av immunfluorescensteknikker, som kan vurderes og kvantifiseres. Fallgruvene ved forbigående overuttrykk tas også opp. Den korrekte karakteriseringen av ATG9A-funksjonen og standardiseringen av teknikker for å analysere dens trafikk er avgjørende for ytterligere å karakterisere hendelsene som styrer autofagi-initiering.
Introduction
ATG9A er det eneste transmembranproteinet i kjerneautofagimaskineriet og trafikkeres mellom Golgi og et cytosolisk ATG9A-vesikkelrom, som passerer gjennom det endosomale rommet1. Etter lenge å ha vært gåtefull, har ATG9A nylig blitt beskrevet å fungere som en lipid scramblase, da den likevekter lipider over membran dobbeltlag 2,3. Det er nå klart at ATG9A befinner seg på toppen av hierarkiet i autofagosomdannelse, og studien er derfor avgjørende for å forstå autofagi 4,5. Som sådan har ATG9A-vesikler nylig blitt foreslått som "frøet" til autofagosomet 6,7. Tidligere studier har imidlertid vist at ATG9A bare forbigående interagerer med det dannende autofagosomet ved forskjellige trinn i modningen og ikke integreres i autofagisk membran 6,8,9,10,11. Dermed er det behov for ytterligere undersøkelser for å fullstendig avdekke rollen og potensielle flere funksjoner av ATG9A i autofagosomdannelse. Imidlertid kan avviket mellom de nåværende modellene og de tidligere dataene bare løses gjennom målrettede eksperimenter som adresserer handel med ATG9A ved hjelp av validerte kvantitative tilnærminger og intracellulære markører.
Det finnes ulike verktøy i bruk for å studere ATG9A, hver med fordeler og ulemper, og bruken av disse verktøyene er komplisert av strukturen til ATG9A, dens molekylære funksjon og cellulær trafikk 2,8,12. ATG9A danner en homotrimer, glykosyleres og transporteres gjennom cellen til rom som Golgi, endosomene og plasmamembranen13,14. Gitt den komplekse reiseruten, er det flere utfordringer med å tolke avlesninger som ATG9A-spredning fra Golgi ved spesifikke behandlinger eller stimuli (som nærings- og serumsult). ATG9A er ekstremt dynamisk når det gjelder vesikulær trafikk; Faktisk har ATG9A-holdige vesikler blitt definert som ATG9A-rommet i sammenheng med sultindusert autofagi. ATG9A-rommet, dannet av disse dynamiske vesiklene, interagerer forbigående med flere intracellulære organeller 8,15,16,17. Teknikkene beskrevet her, inkludert immunfluorescens, levende bildebehandling og glykosyleringsanalyser, skal hjelpe til med deteksjon og forståelse av ATG9A-biologi. Spesielt vil tilnærmingene beskrevet i denne artikkelen bidra til å løse spørsmål om lokalisering til spesifikke cellulære rom og interaksjoner med spesifikke proteinpartnere og / eller membranrom. Siden ATG9A hydrofob konservert kjernedomene (PFAM-domene PF04109) har en unik topologi og ATG9A-sykluser mellom flere membranrom, bør forskere være oppmerksomme på visse fallgruver og artefakter når de forbigående overuttrykker ATG9A, inkludert, men ikke begrenset til, endoplasmatisk retikulum (ER) retensjon. Andre mulige problemer kan oppstå på grunn av feilfolding av proteinet, kunstig aggregering under normale vekstforhold eller utilstrekkelig påvisning av vesikulært rom på grunn av suboptimale permeabiliseringsprotokoller for immunfluorescens.
Ved avbildning av endogen ATG9A må det tas hensyn i prøvepreparering og bildeinnsamling for å sikre kvaliteten på den påfølgende kvantitative analysen og riktig tolkning av dataene. Kombinere teknikkene beskrevet i denne artikkelen med standard biokjemiske tilnærminger (for eksempel immunutfelling eller nedtrekkseksperimenter som ikke er beskrevet her) bør forbedre vår forståelse av ATG9A-funksjonen. Denne eksperimentelle verktøykassen er ment å hjelpe nye forskere med å navigere i noen av analysene som kreves for å bestemme funksjonen til ATG9A i deres biologiske system.
Protocol
Alle reagensene som brukes i denne studien er kommersielt tilgjengelige, bortsett fra ATG9A DNA-konstruksjoner og hjemmelaget STO-215 antistoff (se materialtabell), som er tilgjengelig på forespørsel. Analyseverktøyene som beskrives her, er basert på programvare med åpen kildekode (FIJI/ImageJ)18.
1. Cellekultur
- Opprettholde HEK293A celler i en T150 vevskulturbehandlet kolbe til 80% -90% sammenløp i DMEM med høy glukose (Dulbecco's Modified Eagle Medium) supplert med 10% FBS (føtalt bovint serum) og 4 mM L-glutamin (se materialtabell). Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet vevskulturinkubator ved 10% CO2.
MERK: HEK293A celler brukes i denne studien, da de har en robust kanonisk autofagirespons på aminosyresult, som spesielt oppdages ved en økning i lipidert, membranassosiert LC3 1,9,19, og er egnet for avbildning. - Passér cellene ved å aspirere mediet fra kolben ved hjelp av en serologisk pipette. Vask cellene én gang med 15 ml 1x PBS (fosfatbufret saltvann) eller en lignende oppløsning før du tilsetter 2 ml trypsin-EDTA-oppløsning (etylendiamintetraeddiksyre) for å løsne cellene. Samle de frittliggende cellene med 8 ml DMEM, og frø tilbake et antall celler slik at 80% -90% sammenløp nås etter 2 dager for forsøkene beskrevet her.
2. Endogen farging av ATG9A
- Frø HEK293A celler (eller valgte celler) på sterile nr. 1,5 glassdeksler plassert i en 24-brønnsplate slik at de er ~ 80% sammenflytende neste dag. Dette gir typisk 7 x 104 celler/brønn i 500 μL DMEM.
MERK: For HEK293A celler eller andre løst adherente cellelinjer, må dekselene være belagt med poly-D-lysin ved 0,1 mg / ml i avionisert vann. Tilsett 500 μL av poly-D-lysin (se materialfortegnelse) på toppen av dekslene plassert i brønnene i 10 minutter ved romtemperatur (RT), etterfulgt av tre vasker med avionisert vann og en siste vask i DMEM. Fortsett å så cellene etter belegget, og pass på at de er jevnt spredt ut i kulturfatet. - Behandle cellene i henhold til de spesifikke eksperimentelle forholdene (dvs. sult i 2 timer i EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]).
MERK: EBSS-sammensetningen er 1 g/l D-glukose, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCl, 0,151 g/l CaCl 2,2H2O, 0,2 g/l mM MgSO 4,7H2O,0,124g/lNaH2HPO 4,2H2O,og2,2 g/l NaHCO3 (se materialfortegnelse) oppløst i destillert vann. - Aspirer mediet, og erstatt det forsiktig med 500 μL 4% formaldehydoppløsning i PBS supplert med 0,1 mMCaCl2 og 0,1 mM MgCl2 i 20 minutter ved RT for å fikse cellene.
- Aspirer 4% formaldehydoppløsningen fra hver brønn, erstatt den med 500 μL PBS. Gjenta dette vasketrinnet tre ganger. Ikke la dekslene tørke ut eller forbli uten væske.
- Slukk de frie aldehydgruppene ved å bruke 500 μL 50 mM NH4Cl-løsning i PBS i 10 minutter ved RT.
- Aspirer PBS, og erstatt den med 500 μL av en 50 μg / ml digitoninløsning i PBS (stamløsning 1 mg / ml i avionisert vann, se materialtabell) i 5 minutter ved RT for å permeabilisere cellene.
- Aspirer digitonin-løsningen fra hver brønn, og erstatt den med 500 μL PBS. Gjenta dette vasketrinnet tre ganger.
- Aspirer PBS fra hver brønn, og erstatt den med 500 μL blokkeringsløsning (5% BSA [bovint serumalbumin] fortynnet i PBS) i 30 minutter ved RT.
- Aspirer blokkeringsløsningen, og erstatt den med 500 μL PBS.
- Bruk pinsett, samle dekslene fra brønnen, fjern forsiktig overflødig PBS-oppløsning ved hjelp av tynne vevsservietter eller cellulosefilterpapir, og legg forsiktig hver deksel, cellesiden ned, på en 50 μL dråpe primær antistoffløsning (f.eks. armensk hamster 14F2 fortynnet til 0,9 μg / ml i 1% BSA / PBS-løsning, se materialtabell). Inkuber i et fuktet kammer i 1 time ved RT.
MERK: For enkel håndtering kan dråpene antistoffoppløsning plasseres på et ark med selvforseglende termoplastfilm (se materialfortegnelse) i en annen beholder i stedet for direkte på en solid overflate. - Samle dekselene ved hjelp av pinsett, og etter forsiktig drenering av overflødig primær antistoff løsning ved hjelp av tynne vev wipes, erstatte coverslips (cellesiden opp) i 24-brønn plate, og vask dem tre ganger med PBS.
- Gjenta trinn 2.10. Bruk pinsett, samle dekselene fra hver brønn, forsiktig drenering av overflødig PBS ved hjelp av tynne vevsservietter, og legg forsiktig ned hver deksel (cellesiden ned) på en 50 μL dråpe sekundær antistoffoppløsning fortynnet 1: 1,000 i 1% BSA / PBS-løsning (f.eks. Cy3 Geit Anti-armensk hamster IgG, som har minimal kryssreaktivitet med storfe, menneskelig, serumproteiner fra mus, kanin og rotter, se Materialfortegnelse). Inkuber i et fuktet kammer i 1 time ved RT.
MERK: Valgfritt: En cytoskjelettmarkør kan brukes i tillegg til det sekundære antistoffet for den påfølgende bildeanalysen (dvs. Alexa Fluor 647 Phalloidin fortynnet 1: 1,000, se materialtabellen). For enkel håndtering kan dråpene antistoffoppløsning plasseres på et ark med tetningsfilm i en annen beholder i stedet for direkte på en solid overflate. - Samle dekselene ved hjelp av pinsett, og etter å ha tappet av overflødig sekundær antistoffløsning, plasser dekselene i 24-brønnsplaten (cellesiden opp) og vask dem tre ganger med 500 μL PBS.
- Bruk pinsett, samle dekslene, tøm forsiktig av overflødig PBS ved hjelp av tynne vevsservietter, og legg forsiktig hver deksel (cellesiden ned) på en 50 μL dråpe på 1: 4,000 Hoechst-løsning (Hoechst 33342) i PBS. Inkubere i et fuktighetskammer i 5 min ved RT.
MERK: For enkel håndtering kan dråpene med antistoffoppløsning plasseres på et ark med tetningsfilm i en annen beholder i stedet for direkte på en solid overflate. - Samle dekselene ved hjelp av pinsett, og etter forsiktig å ha tømt overflødig Hoechst-løsning med tynne vevsservietter, bytt dekselene i 24-brønnsplaten, og vask tre ganger med PBS og en gang med avionisert vann (500 μL per vask).
- Tøm forsiktig overflødig avionisert vann ved hjelp av tynne vevsservietter, og legg forsiktig hver deksel (cellesiden ned) på en 10-20 μL dråpe monteringsløsning (se materialfortegnelse) oppdaget på et mikroskopglass for immunfluorescens, unngå dannelse av luftbobler.
MERK: Monteringsmediet som brukes her har samme brytningsindeks som nedsenkningsolje og herdes etter noen timer ved RT eller over natten ved 4 °C. Ikke-herdende monteringsløsninger kan brukes, men det må utvises forsiktighet for å forsegle dekselet med neglelakk. - Fjern overflødig monteringsløsning ved aspirasjon, og la prøvene tørke mens de ligger flatt ved RT over natten i mørket, enten i en glideholder eller dekket med aluminiumsfolie.
3. Oppkjøp av bilder
- Slå på konfokalmikroskopet. Åpne bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse) for å starte oppsettet for bildeopptak.
- I kategorien Funksjon velger du objektivlinsen Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 for å ta bildene for analyse.
- I kategorien Oppkjøpsfunksjon slår du på de aktuelle laserne i lasersonen på kontrollpanelet (Argon, Diode-405-30, DPSS 561-10 og HeNe633).
- I Imaging Setup-sonen i kontrollpanelet oppretter du fire spor, der hvert spor tilsvarer én kanal, for å utføre sekvensiell anskaffelse.
- Angi riktig oppløsning for bildene i vinduet Anskaffelsesmodus. Sett oppløsningen til 1 024 x 1 024 (rammestørrelse), og velg en bitdybde på 16-biters.
- For hver kanal justerer du lasereffekten og forsterkningen for å oppnå et godt signal uten mettede piksler, noe som vil hindre bildeintensitetsanalysen. Bruk Live-knappen til å stille inn laserutgangsnivået og forsterkningen (master).
MERK: Bruk av områdeindikatoralternativet anbefales for mettet pikseldeteksjon. Hold lasereffekten mellom 1 % og 10 % og Gain (Master) under 850 for å unngå bakgrunnsstøy. - I kanalsonen i kontrollpanelet angir du samme pinhole-blenderåpning for hver kanal, med tanke på 1 Airy Unit (AU) for kanalen med høyest bølgelengde.
- Skaff 10 tilfeldige felt som inneholder tilsvarende mengder celler (20-30 celler per felt). Oppkjøpet av 100-200 celler per tilstand vil gi god kraft til den senere bildeanalysen.
4. Bildeanalyse av ATG9A-spredning
- Last ned FIJI-programvare fra internett (se Materialfortegnelse). Åpne bildet med FIJI ved å klikke på Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer.
- Klikk på Analyser > Angi mål, og velg den grå middelverdien i målevinduet for intensitetsanalysen.
- Klikk på Image > Color > Split Channels, og skill kanalene i tre bilder (Golgi-markør, cytoskjelett, ATG9A-signal).
- Gå til Image > Adjust > Threshold, og definer en terskel i kanalen som tilsvarer Golgi-markøren.
- Klikk på Rediger > utvalg > Opprett utvalg, og opprett et utvalg fra det binære bildet.
- Gå til Rediger > utvalg > Legg til i Overordnet > Gi nytt navn (Golgi), lagre det merkede området i ROI-behandling og gi det nytt navn til Golgi.
- Klikk på Bilde > Juster > terskel, og definer en terskel i kanalen som tilsvarer cytoskjelettmarkøren for å definere cellekonturen.
- Gå til Rediger > markering > Opprett markering, og opprett en markering fra binærbildet.
- Klikk på Rediger > utvalg > Legg til i Manager > Gi nytt navn (totalt), lagre utvalget i ROI-manageren, og gi det nytt navn til Totalt.
- Velg bildet som tilsvarer ATG9A-fargingen.
- I Analyser > mål bruker du ROI Golgi ved å klikke på den, og måler intensiteten i Golgi-regionen.
- Klikk på Analyser > mål, bruk ROI Total ved å klikke på den, og mål intensiteten til Total-regionen.
- Gjenta prosedyren i alle bildene, lagre resultatene som .csv filer, og behandle dataene ved hjelp av følgende formel:
ATG9A spredningshastighet = Golgi-intensitet/total intensitet
5. Levende celleavbildning av ATG9A-konstruksjoner
- Frø HEK293A celler (eller valgte celler) i 2 ml medium til en 60 mm vevskulturskål slik at de når ~ 65% -70% sammenløp neste dag; Dette gir typisk 1 x 10 6-2 x 106 celler.
- Neste dag, klargjør lipofektamin: DNA-blandinger (eller et egnet alternativt DNA-transfeksjonsreagens, se materialtabellen) som følger:
- Avhengig av konstruksjonens uttrykkseffektivitet, fortynn 0,5-2 μg plasmid-DNA til 100 μL av et egnet serumfritt medium, og bland oppløsningen forsiktig ved å pipettere opp og ned. Inkuber blandingen i 5 min ved RT.
MERK: Plasmid-DNA-konstruksjonen er eksperimentspesifikk. Forskeren kan enten klone selv eller få tak i forfatterne på forespørsel. - Fortynn lipofektamin 2000 transfeksjonsreagens i forholdet 3: 1 lipofektamin: DNA i 100 μL av et egnet serumfritt medium og bland oppløsningen forsiktig ved å pipettere opp og ned. Inkuber denne blandingen i 5 min ved RT.
- Bland begge løsningene sammen ved å pipettere forsiktig opp og ned og ruge i 20 minutter ved RT.
- Avhengig av konstruksjonens uttrykkseffektivitet, fortynn 0,5-2 μg plasmid-DNA til 100 μL av et egnet serumfritt medium, og bland oppløsningen forsiktig ved å pipettere opp og ned. Inkuber blandingen i 5 min ved RT.
- Tilsett lipofektamin: DNA-blandingen til hver cellekulturplate som inneholder 4 ml vekstmedium, og vugg forsiktig platen frem og tilbake for å fordele blandingen jevnt. Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet cellekulturinkubator ved 10% CO2.
- Erstatt mediet med friskt vekstmedium 4 timer etter transfeksjon, og inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet cellekulturinkubator ved 10 % CO2 over natten.
- Neste dag trypsiniserer, teller og frø cellene på dyrkningsfat egnet for levende cellemikroskopi (dyrkningsfat med nr. 1,5 glassdeksel, se materialfortegnelse). Frø 0,4 x 10 6-0,7 x 106 celler på oppvasken for å nå ~ 60% -75% sammenløp på dekselet på tidspunktet for avbildning.
MERK: Belegg med poly-D-lysin, som forklart i trinn 2.1, anbefales for HEK293A celler. - Neste dag (48 timer etter transfeksjon), avbilde cellene.
6. Undersøkelse av glykosyleringstilstanden til ATG9A
- Frø HEK293A celler (eller valgte celler) i en 10 cm vevskulturskål slik at de når ~ 80% sammenløp neste dag hvis de planlegger å undersøke endogen ATG9A, som typisk gir 1,5 x 10 6-2,5 x 106 celler i 10 ml. Alternativt kan du frø cellene slik at de når ~ 65% -70% sammenløp hvis transfeksjon ATG9A konstruerer, som vanligvis gir 1 x 10 6-1,5 x 106 celler i 10 ml.
- Behandle cellene med 100 μg/ml cykloheksamid (CHX, se materialfortegnelse) eller kjøretøy neste dag. Inkuber i 24 timer (eller til ønsket tidspunkt).
- Fjern cellene fra inkubatoren, aspirer mediet og legg på is. Erstatt den med 5 ml iskald 1x PBS. Løsne cellene fysisk fra fatet ved hjelp av en celleskraper, og pipetter PBS-celleløsningen inn i et 15 ml konisk bunnrør. Sentrifuge ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere cellene.
- Aspirer supernatanten, og resuspender cellene i ~ 100 μL (avhengig av størrelsen på cellepelleten) av iskald TNTE lysisbuffer (1% Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA) supplert med proteaseinhibitorcocktailtabletter (se materialtabellen), og overfør til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Inkuber lysatet på is i 15 minutter. Etter dette sentrifugerer du lysatet ved 20 000 x g i 10 minutter ved 4 °C for å sedimentere kjernene og uoppløselig rusk, og overfører supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør.
- Kvantifisere proteinkonsentrasjonen av lysatet ved hjelp av Bradford-metoden20 og et spektrofotometer som kan måle ved en bølgelengde på 595 nm.
- Normaliser proteinmengdene, og kombiner 16 μL av lysatet (som ikke inneholder mer enn 100 μg protein totalt) med 5x PNGase F (Peptid: N-glykosidase F) buffer i henhold til produsentens instruksjoner før du tilsetter 1 μL PNGase F-enzym (se materialtabell). Inkubere som instruert av PNGase F produsent.
- Legg til et volum på 3x Laemmli prøvebuffer for å oppnå en 1x konsentrasjon, og inkuber ved 65 ° C i 5 minutter før du laster for elektroforese ved hjelp av en Tris-acetat gel for å maksimere separasjonen av proteiner. Overfør proteinene fra gelen til en egnet membran (dvs. PVDF [polyvinylidendifluorid]) ved bruk av standard vestlige blotprotokoller21 (se materialtabell).
MERK: Koking av prøvene ved 95 °C vil føre til at ATG9A aggregeres, og dermed redusere deteksjonen av ATG9A. - Utfør western blot ved hjelp av spesifikke antistoffer for ATG9A (STO-215 antistoff, produsert internt1) (se Tabell over materialer). La den høyere molekylvektdelen av membranen være uklippet for å visualisere artene med høyere ATG9A-molekylvekt.
Representative Results
ATG9A er et transmembranprotein assosiert med flere intracellulære membranrom 8,17,22,23,24. Under basale forhold er ATG9A hovedsakelig lokalisert i trans-Golgi-nettverket (TGN), som indikert ved immunfluorescens av det endogene proteinet og overlappingene med GM130, en cis-Golgi-markør (figur 1A), samt i små vesikler som delvis overlapper med det endocytiske resirkuleringsrommet (ERC)23. ATG9A-lokalisering ved Golgi kan detekteres ved hjelp av forskjellige immunfluorescensprotokoller. Imidlertid kan vesikulært fraksjon av ATG9A, samt endring av lokalisering, spesielt økningen i vesikulært basseng, som respons på spesifikke stimuli som næringsstoffer og serum sult, være ganske variabel i intensitet og vanskelig å visualisere med konvensjonelle bildebehandlingsmetoder. Forholdet mellom ATG9A lokalisert ved Golgi og ATG9A lokalisert til en vesikulær fraksjon kalles ATG9A-spredningshastigheten. For å oppdage endringer i spredningshastigheten til ATG9A, for eksempel ved EBSS-behandling, som brukes til å tømme både serum og aminosyrer, er en Golgi-markør som GM130 eller TGN46 og en cytoskjelettmarkør som Phalloidin, som flekker cellekonturen25, nyttig for lett å kvantifisere ATG9A-spredningen (figur 1B). Det er viktig at den gjennomsnittlige fluorescensforholdsanalysen bare kan tolkes som et komparativt mål mellom forhold snarere enn som en fast spredningshastighet. Forholdet mellom rommene er svært avhengig av biologiske og ikke-biologiske faktorer som cellelinjen som brukes, fargekvaliteten eller terskelmetodene som brukes (figur 1B). Av denne grunn må forskeren sette opp en rørledning som er i stand til å oppdage ATG9A Golgi-anrikning i deres spesifikke eksperimentelle forhold og deretter utvide analysen med de samme parametrene til alle bildene i settet som skal analyseres. Representative binære bilder og områder valgt for analyse av ATG9A gjennomsnittlig fluorescens er vist som en veiledning i figur 1B.
ATG9A har flere transmembrane domener flankert av to relativt fleksible og ustrukturerte N- og C-terminale domener, hvorav den C-terminale sekvensen omfatter nesten halvparten av proteinet12. Det er viktig at lokaliseringsmønsteret til overuttrykt ATG9A kan påvirkes av hvilken proteinende som er merket (figur 2A). Spesielt ved bruk av transiente ekspresjonssystemer og merking av ATG9A direkte på N-terminalen med en fluorescerende tag (f.eks. eGFP, mRFP eller derivater), kan Golgi-lokaliseringen delvis kompromitteres, med mindre anrikning sett i basale (dvs. matede) forhold, mens ATG9A-vesiklene fortsatt er lett synlige (figur 2A). Merking av ATG9A på C-terminalen ser ut til å indusere større GFP-positive klynger som kan aggregeres. Endelig viser en monomerisk versjon av mRFP-ATG9A også lignende fluorescerende klynger av vesikler og liten Golgi-farging i overuttrykkende celler (figur 2A).
ATG9A brettes i ER-membranen før den trafikkeres til Golgi- og ATG9A-vesiklene. Under sin opphold i ER blir ATG9A modifisert av N-koblede glykaner på Asparagin 99, og deretter når den når Golgi, oppnår den komplekse, modne N-koblede glykaner 1,14. Denne modifikasjonen ved glykosylering kan detekteres gjennom western blot ved utseendet til et dobbeltbånd14. I samsvar med sin intracellulære lokalisering har de fleste endogene ATG9A komplekse N-koblede glykaner, og derfor er det høyere molekylære vektbåndet dominerende, med et svakt lavmolekylært vektbånd også synlig (figur 2B). Tilstedeværelsen av et dobbeltbånd ses lettest ved bruk av Tris-acetatgeler for å forbedre oppløsningen av proteiner med høyere molekylvekt (figur 2B, kontroll, t = 0). Når det endogene proteinet blir utsatt for PNGase F (Peptide: N-glykosidase F) behandling, som fjerner det meste av de komplekse N-bundne glykanene, går proteinet som et enkelt bånd (figur 2B, PNGase F, t = 0). Derfor kan den N-koblede glykosyleringsstatusen til ATG9A brukes som en proxy for å overvåke utgangen av ATG9A fra ER til Golgi, noe som reflekteres av det relative forholdet mellom de to båndene.
Ved transfeksjon av mRFP-ATG9A konstrueres transient, akkumuleres det overuttrykte proteinet initialt i ER, potensielt fordi trafikkmaskineriet ikke er i stand til å brette og trafikkere hele ATG9A, og det lavere molekylvektbåndet er dominerende (figur 2C, kontroll t = 0). Spesielt, etter 24 timers ekspresjon av mRFP-ATG9A, er det omtrent en lik fordeling mellom øvre og nedre bånd, noe som tyder på at mRFP-ATG9A-bassenget beveger seg inn i Golgi (figur 2C, kontroll, t = 24). Hvis cellene behandles med cykloheksimid (CHX), som blokkerer de novo proteinsyntese26, kan folding og utgang av ATG9A fra ER avklares. Siden det endogene proteinet foldes, glykosyleres og holdes fast i Golgi, endrer ikke behandling med CHX signifikant forholdet mellom båndene med lavere og høyere molekylvekt (figur 2B, kontroll). Ved bruk av det forbigående uttrykket av mRFP-ATG9A fremmer imidlertid CHX-behandlingen akkumuleringen av det høyere molekylære vektbåndet (figur 2C, kontroll, CHX t = 24). Det overtrykte mRFP-ATG9A-båndet med høyere molekylvekt kollapser i det nedre båndet etter behandling med PNGase F (figur 2C, PNGase F, t = 24). Disse dataene viser at det endogene proteinet raskt oppnår modne glykaner, noe som gjenspeiles av overvekten av det høyere molekylære vektbåndet, og CHX-jakten påvirker ikke forholdet mellom dobbeltbåndene (figur 2B). Ved forbigående overuttrykt mRFP-ATG9A induserer CHX-behandling akkumulering av det øvre båndet, noe som indikerer at mer modne glykaner erverves når ER-bassenget folder seg og går ut av ER til Golgi (figur 2C).
Tilsetningen av en linker mellom ATG9A-sekvensen og fluorescerende koder kan være nyttig for å fremme en mer fysiologisk lokalisering og handel av proteinet. Fusjon av en 3x-FLAG-sekvens (24 aminosyrer) mellom en N-terminal fluorofor og ATG9A hjelper det overuttrykte proteinet til å oppføre seg på samme måte som det endogene (figur 3). Faktisk kolokaliserer overuttrykt mCherry-3xFLAG-ATG9A med Golgi-markøren GM130 i matede forhold (figur 3A). Det er viktig at denne lokaliseringen og ATG9A-vesikulært rom bevares over tid, noe som muliggjør den spatiotemporale studien av trafikken av ATG9A (figur 3B).
Figur 1 Bildeanalyse av endogen ATG9A-lokalisasjon. (A) Representativt immunfluorescensbilde av endogent ATG9A (rødt), GM130 som Golgi-markør (grønt) og falloidin for å visualisere aktincytoskjelettet (cyan). Skala bar = 10 μm. (B) Arbeidsflyt av bildeanalysen for å bestemme fraksjonen av endogen ATG9A som lokaliseres i Golgi-området. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av fluorescerende merkede ATG9A-konstruksjoner ved lokalisering og glykosylering. (A) eGFP N-terminalt merket ATG9A er mindre lokalisert på Golgi og ligger primært i vesiklene. eGFP C-terminalt merket ATG9A viser aggregater i cellen (noen eksempler er markert med hvite pilspisser; eGFP-ATG9A og ATG9A-eGFP er i grønt). mRFP N-terminalt merket ATG9A er mindre lokalisert på Golgi og ligger primært i vesiklene. N angir den omtrentlige plasseringen av cellekjernen, og mRFP-ATG9A er i rødt. Skala bar = 5 μm. (B) Endogen ATG9A vises som to bånd når de analyseres av western blot (pilspisser): et øvre bånd (komplekse N-koblede glykaner) og et nedre bånd (ingen modne N-koblede glykaner). Behandling med cykloheksamid (CHX) påvirker ikke forholdet mellom øvre og nedre bånd. Behandling med PNGase F forårsaker at det øvre båndet forsvinner. (C) Etter forbigående transfeksjon av mRFP-merket ATG9A i HEK293A celler, er to fremtredende bånd synlige på western blot (pilspisser). Behandling med PNGase F forårsaker at det øvre båndet forsvinner. Behandling med CHX etter transfeksjon fører til økt glykosylering ettersom bassenget av transfeksjonert ATG9A smugles fra ER til Golgi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av mCherry-3xFLAG-ATG9A lokalisering ved immunfluorescens og levende bildebehandling. (A) Immunfluorescenseksperimenter av HEK293A celler som forbigående overuttrykker mCherry-3xFLAG-ATG9A og farget med Golgi-markøren GM130. Skala bar = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A er i rødt, og GM130 Golgi-markøren er i grønt. (B) Montasje fra live-imaging eksperimenter i HEK293A celler som forbigående overuttrykker mCherry-3xFLAG-ATG9A. N angir den omtrentlige plasseringen av kjernen. Tidsramme = 1 fps. Skala bar = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A er i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne studien illustrerer de ulike verktøyene som kan brukes til å undersøke lokalisering av ATG9A. For det første beskriver denne studien hvordan ATG9A kan visualiseres ved immunfluorescens og hvordan dette kan kvantifiseres. For det andre sammenlignes strategier som kan brukes til å merke ATG9A med en fluorescerende markør for visualisering i enten faste eller levende celler. Til slutt beskriver dette arbeidet hvordan man undersøker og bruker glykosyleringstilstanden til ATG9A for å avgjøre om ATG9A har forlatt ER og trafikkert gjennom Golgi.
Når det gjelder karakterisering av endogen ATG9A-lokalisering ved immunfluorescens, må det tas hensyn til fikserings- og permeabiliseringsmetodene som brukes til forsøket. I henhold til standardprosedyrene her beskrevet, er paraformaldehydfiksasjon kombinert med digitoninpermeabilisering gode forhold for å visualisere både Golgi-assosiert ATG9A og ATG9A-positive vesikler7. Sammen med fiksering og permeabilisering er tidspunktet for inkubasjon med den primære antistoffløsningen også kritisk. Vi har observert, men ikke dokumentert, at høyere konsentrasjoner av primær antistoffløsning og lengre inkubasjonstider kan føre til en misvisende økning i Golgi-fargingen av ATG9A, noe som til slutt kompromitterer deteksjonen av ATG9A-omfordeling til andre membranrom. I tillegg, siden ATG9A er tilstede i mange intracellulære rom 1,13,17,22,23,24,27,28, er det viktig å bruke spesifikke membranmarkører, sammen med ATG9A, for å identifisere hvor ATG9A befinner seg. Flere tilnærminger har blitt brukt tidligere for å kvantifisere ATG9A-lokalisering, inkludert Pearsons korrelasjonskoeffisient for kolokalisering29. Den delvise overlappingen av ATG9A med Golgi og det distinkte vesikulære rommet fører imidlertid til et høyt antall pikselavvik, noe som kan forstyrre tolkningen av korrelasjonskoeffisienten. Av denne grunn foretrekkes en mer forenklet tilnærming basert på forholdet mellom gjennomsnittlig fluorescens i de to rommene som skal analyseres, og denne tilnærmingen er mindre følsom for celle-for-celle-variabilitet. For ytterligere informasjon om bildeanalyse gjennom mikroskopi, henvises leserne til dette bokkapittel30.
Når man undersøker glykosyleringsstatusen til ATG9A, er valget av geler for å kjøre de vestlige flekkene viktig. For denne protokollen foretrekkes 3% -8% Tris-acetatgeler fordi de tilbyr den høyeste oppløsningen for større proteiner, men alternative gelsammensetninger eller løpende buffere som gir en god separasjon av proteiner med høy molekylvekt kan også brukes. Eksperimentøren kan sikre maksimal separasjon av proteiner ved å øke tiden for elektroforese.
Ved klargjøring av prøvene for å visualisere ATG9A på western blot, bør det utvises forsiktighet for ikke å koke prøvene etter tilsetning av Laemmli-bufferen. Koking ved 95 °C induserer dannelsen av ATG9A-aggregater, og ATG9A migrerer deretter ikke effektivt inn i gelen1. Det anbefales å varme opp prøvene ved 65 °C i 5 minutter27.
Høye nivåer av transfeksjon fører vanligvis til høyere akkumulering av ATG9A i ER, mens moderate uttrykksnivåer hjelper den fysiologiske lokaliseringen av proteinet. Anekdotisk bidrar inkubasjonstider på 72 timer i stedet for 48 timer ofte til å redusere ER-lokaliseringsartefakter. Spesielt kan mRFP-ATG9A nøyaktig rapportere om ATG9A-trafikk og funksjon hvis nivåene kontrolleres gjennom ekspresjonsnivåer eller ved å bruke stabile cellelinjer 8,9,22,27.
Svikt i en populasjon av overuttrykt ATG9A for å skaffe seg modne N-koblede glykaner kan brukes som en avlesning for forstyrret ATG9A-trafikk. Ved mutering eller sletting av visse regioner av ATG9A, er det fare for økt ER-retensjon, noe som kan føre til manglende anskaffelse av modne N-koblede glykaner og dermed et raskere migrerende ATG9A-bånd på western blot. Forskere som arbeider med avkortede ATG9A-konstruksjoner, bør sjekke for ER-retensjon, glykosyleringstilstander og Golgi-lokalisering.
For levende celleavbildning av ATG9A gir et Airyscan-mikroskop, avhengig av den raske Airyscan-funksjonen, optimal oppløsning på typisk ca. 120 nm. For lokaliseringsnøyaktighet er bildefrekvenser på rundt 1-2 bilder per sekund (fps) i superoppløsningsmodus optimale, avhengig av hvor mange kanaler som er avbildet. Lignende konfokale mikroskoper som kan avbilde med høy hastighet, kan også brukes til avbildning av ATG9A-vesikler; Det skal imidlertid bemerkes at bildehastigheten direkte kan påvirke deteksjon av hendelser og derfor påvirke tolkningen av dataene.
Oppsummert beskriver de presenterte protokollene måter å kvantifisere og karakterisere ATG9A-lokalisering ved immunfluorescens, levende cellemikroskopi og dens glykosyleringsstatus. Disse protokollene kan hjelpe forskere som arbeider med ATG9A og bidra til å unngå noen fallgruver.
Disclosures
S.A.T. sitter i det vitenskapelige rådgivende styret til Casma Therapeutics.
Acknowledgments
Forfatterne takker Rocco D'Antuono for korrekturlesing av aspekter av manuskriptet, samt alle nåværende og tidligere medlemmer av laboratoriet Molecular Cell Biology of Autophagy (MCBA) for diskusjonene som førte til forbedringen av disse protokollene. A. V.V., S.D.T., E.A., S.A.T, ble støttet av Francis Crick Institute som mottar sin kjernefinansiering fra Cancer Research UK (CC2134), UK Medical Research Council (CC2134). Denne forskningen ble finansiert helt eller delvis av Wellcome Trust (CC2134). Med henblikk på åpen tilgang har forfatteren anvendt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 60 mm tissue culture dish | Thermofisher Scientific | 10099170 | For tissue culture |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofisher Scientific | A22287 | Actin stain |
| anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
| anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
| anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
| ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
| ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Bemis Parafilm | Thermofisher Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
| CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
| D-Glucose | / | For EBSS | |
| Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
| DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
| eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
| FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
| Hoechst | Thermofisher Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
| KCl | / | For EBSS | |
| L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
| LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
| MgCl2 | / | For PBS | |
| MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
| Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
| NaCl | / | For EBSS | |
| NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
| NaHCO3 | / | For EBSS | |
| NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofisher Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermofisher Scientific | 31985062 | For Cell Transfection |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
| pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
| PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
| Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
| Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
| RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Triton X-100 | Thermofisher Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
| Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
| Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |
References
- Young, A. R., et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).
- Maeda, S., et al. lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).
- Matoba, K., et al. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).
- Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).
- Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. Autophagy genes in biology and disease. Nature Reviews: Genetics. , (2023).
- Sawa-Makarska, J., et al. Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation. Science. 369 (6508), (2020).
- Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure. Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085 (2020).
- Orsi, A., et al. Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).
- Judith, D., et al. ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).
- Karanasios, E., et al. Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nature Communications. 7, 12420 (2016).
- Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).
- Guardia, C. M., et al. Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery. Cell Reports. 31 (13), 107837 (2020).
- Soreng, K., et al. SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2. EMBO Reports. 19 (4), e44837 (2018).
- Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).
- Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis. Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).
- Takahashi, Y., et al. The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs. Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).
- Imai, K., et al. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation. Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- van Vliet, A. R., et al. ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation. Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269 (2020).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting. Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).
- Lamb, C. A., et al. TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic. EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).
- Longatti, A., et al. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).
- Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy. Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).
- DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities. BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Webber, J. L., Tooze, S. A. Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP. EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).
- Claude-Taupin, A., et al. ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization. Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).
- Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization - Co-occurrence versus correlation. Journal of Cell Science. 131 (3), 211847 (2018).
- D'Antuono, R. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).
