Summary
Detta protokoll beskriver olika metoder som kan hjälpa till i studien av ATG9A-biologi, inklusive immunofluorescens följt av bildanalys, övergående överuttryck och undersökning av ATG9A-glykosyleringsstatus med hjälp av western blot.
Abstract
Autofagi är en mycket konserverad väg som cellen använder för att upprätthålla homeostas, bryta ner skadade organeller, bekämpa invaderande patogener och överleva patologiska tillstånd. En uppsättning proteiner, så kallade ATG-proteiner, utgör kärnan i autofagimaskineriet och arbetar tillsammans i en definierad hierarki. De senaste årens studier har förbättrat vår kunskap om autofagivägen. Nyligen har det föreslagits att ATG9A-vesiklar är kärnan i autofagi, eftersom de kontrollerar den snabba de novo-syntesen av en organell som kallas fagoforen. Studien av ATG9A har visat sig vara utmanande, eftersom ATG9A är ett transmembranprotein och det finns i olika membranfack. Att förstå dess handel är därför en viktig faktor för att förstå autofagi. Här presenteras detaljerade metoder som kan användas för att studera ATG9A och i synnerhet dess lokalisering med hjälp av immunofluorescenstekniker, som kan bedömas och kvantifieras. Fallgroparna med övergående överuttryck tas också upp. Den korrekta karakteriseringen av ATG9A-funktionen och standardiseringen av tekniker för att analysera dess trafik är avgörande för att ytterligare karakterisera de händelser som styr autofagiinitiering.
Introduction
ATG9A är det enda transmembranproteinet i kärnautofagimaskineriet och transporteras mellan Golgi och ett cytosoliskt ATG9A-vesikelfack och passerar genom det endosomala facket1. ATG9A har länge varit gåtfull och har nyligen beskrivits fungera som en lipidförvränga, eftersom den balanserar lipider över membranlager 2,3. Det står nu klart att ATG9A befinner sig högst upp i hierarkin i autofagosombildning, och dess studier är därför avgörande för att förstå autofagi 4,5. Som sådan har ATG9A-vesiklar nyligen föreslagits som "frö" till autofagosomen 6,7. Tidigare studier har dock visat att ATG9A endast kortvarigt interagerar med den bildande autofagosomen i olika stadier av dess mognad och inte integrerar 6,8,9,10,11 i det autofagiska membranet. Således behövs ytterligare undersökningar för att helt reda ut ATG9A:s roll och potentiella multipla funktioner i autofagosombildning. Diskrepansen mellan de nuvarande modellerna och tidigare data kan dock endast lösas genom riktade experiment som adresserar smugglingen av ATG9A med hjälp av validerade kvantitativa metoder och intracellulära markörer.
Det finns olika verktyg som används för att studera ATG9A, var och en med fördelar och nackdelar, och användningen av dessa verktyg kompliceras av strukturen hos ATG9A, dess molekylära funktion och cellulär trafik 2,8,12. ATG9A bildar en homotrimer, glykosyleras och transporteras genom cellen till kompartment som Golgi, endosomerna och plasmamembranet13,14. Med tanke på dess komplexa resväg finns det flera utmaningar när det gäller att tolka avläsningar som ATG9A-spridning från Golgi vid specifika behandlingar eller stimuli (såsom närings- och serumsvält). ATG9A är extremt dynamisk när det gäller vesikulär trafik; Faktum är att ATG9A-innehållande vesiklar har definierats som ATG9A-kompartmentet i samband med svältinducerad autofagi. ATG9A-facket, som bildas av dessa dynamiska vesiklar, interagerar tillfälligt med flera intracellulära organeller 8,15,16,17. De tekniker som beskrivs här, inklusive immunofluorescens, levande avbildning och glykosyleringsanalyser, bör hjälpa till att upptäcka och förstå ATG9A-biologi. I synnerhet kommer de tillvägagångssätt som beskrivs i den här artikeln att hjälpa till att ta itu med frågor om lokalisering till specifika cellulära kompartment och interaktioner med specifika proteinpartners och/eller membrankompartment. Eftersom ATG9A hydrofob bevarad kärndomän (PFAM-domän PF04109) har en unik topologi och ATG9A cyklar mellan flera membranfack, bör forskare vara medvetna om vissa fallgropar och artefakter vid överuttryck av ATG9A, inklusive, men inte begränsat till, endoplasmatiskt retikulum (ER) retention. Andra möjliga problem kan uppstå på grund av felveckning av proteinet, artefaktisk aggregering under normala odlingsförhållanden eller otillräcklig detektion av vesikulärkompartmentet på grund av suboptimala permeabiliseringsprotokoll för immunofluorescens.
Vid avbildning av endogent ATG9A måste försiktighet iakttas vid provberedning och bildtagning för att säkerställa kvaliteten på den efterföljande kvantitativa analysen och korrekt tolkning av data. Att kombinera de tekniker som beskrivs i den här artikeln med vanliga biokemiska metoder (såsom immunprecipitering eller pull-down-experiment som inte beskrivs här) bör förbättra vår förståelse av ATG9A-funktionen. Denna experimentella verktygslåda är avsedd att hjälpa nya forskare att navigera i några av de analyser som krävs för att bestämma funktionen av ATG9A i deras biologiska system.
Protocol
Alla reagenser som används i denna studie är kommersiellt tillgängliga, förutom ATG9A DNA-konstruktioner och hemmagjorda STO-215-antikroppar (se materialtabell), som är tillgängliga på begäran. De analysverktyg som beskrivs här är baserade på programvara med öppen källkod (FIJI/ImageJ)18.
1. Cellodling
- Behåll HEK293A celler i en T150-vävnadskulturbehandlad kolv till 80%-90% sammanflöde i DMEM med högt glukosvärde (Dulbeccos modifierade Eagle Medium) kompletterat med 10% FBS (fetalt bovint serum) och 4 mM L-glutamin (se materialförteckning). Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad vävnadsinkubator vid 10 % CO2 .
OBS: HEK293A celler används i den aktuella studien, eftersom de har ett robust kanoniskt autofagisvar vid aminosyrasvält, vilket i synnerhet detekteras genom en ökning av lipiderad, membranassocierad LC3 1,9,19, och är lämpliga för avbildning. - Låt cellerna passera genom att aspirera mediet från kolven med hjälp av en serologisk pipett. Tvätta cellerna en gång med 15 ml 1x PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning) eller liknande lösning innan du tillsätter 2 ml trypsin-EDTA-lösning (etylendiamintetraättiksyra) för att lossa cellerna. Samla de lossnade cellerna med 8 ml DMEM och plantera tillbaka ett antal celler så att 80%-90% sammanflöde uppnås efter 2 dagar för experimenten som beskrivs här.
2. Endogen färgning av ATG9A
- Frö HEK293A celler (eller valfria celler) på sterila nr 1,5 glastäcken placerade i en 24-hålsplatta så att de är ~80 % sammanflytande nästa dag. Detta ger vanligtvis 7 x 104 celler/brunn i 500 μL DMEM.
OBS: För HEK293A celler eller andra löst vidhäftande cellinjer måste täckglasen beläggas med poly-D-lysin vid 0.1 mg/ml i avjoniserat vatten. Tillsätt 500 μl poly-D-lysin (se materialtabell) på toppen av täckglasen som placerats i brunnarna i 10 minuter vid rumstemperatur (RT), följt av tre tvättar med avjoniserat vatten och en sista tvätt i DMEM. Fortsätt med att så cellerna efter beläggningen och se till att de är jämnt utspridda i odlingsskålen. - Behandla cellerna enligt de specifika experimentella förhållandena (dvs. svält i 2 timmar i EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]).
OBS: EBSS-sammansättningen är 1 g/L D-glukos, 6.8 g/L NaCl, 0.4 g/L KCl, 0.151 g/L CaCl 2.2H 2 O, 0.2 g/L mM MgSO 4.7H 2 O, 0.124 g/L NaH 2 HPO4.2H 2 O och 2.2 g/L NaHCO 3 (se materialförteckning) upplöst i destillerat vatten. - Aspirera mediet och ersätt det försiktigt med 500 μL 4% formaldehydlösning i PBS kompletterat med 0,1 mM CaCl 2 och 0,1 mM MgCl2 i 20 minuter vid RT för att fixera cellerna.
- Aspirera 4 % formaldehydlösning från varje brunn och ersätt den med 500 μL PBS. Upprepa detta tvättsteg tre gånger. Låt inte täckglasen torka ut eller förbli utan vätska.
- Släck de fria aldehydgrupperna genom att använda 500 μL 50 mM NH4Cl-lösning i PBS i 10 minuter vid RT.
- Aspirera PBS och ersätt den med 500 μL av en 50 μg/ml digitoninlösning i PBS (stamlösning 1 mg/ml i avjoniserat vatten, se Materialtabell) i 5 min vid RT för att permeabilisera cellerna.
- Aspirera digitoninlösningen från varje brunn och ersätt den med 500 μl PBS. Upprepa detta tvättsteg tre gånger.
- Aspirera PBS från varje brunn och ersätt den med 500 μL blockerande lösning (5 % BSA [bovint serumalbumin] utspätt i PBS) i 30 minuter vid RT.
- Aspirera den blockerande lösningen och ersätt den med 500 μL PBS.
- Använd en pincett, samla upp täckglasen från brunnen, ta försiktigt bort överflödig PBS-lösning med tunna vävnadsservetter eller cellulosafilterpapper och lägg försiktigt ner varje täckglas med cellsidan nedåt på en 50 μL droppe primär antikroppslösning (t.ex. armenisk hamster 14F2 utspädd till 0,9 μg/ml i 1 % BSA/PBS-lösning, se Materialförteckning). Inkubera i en fuktad kammare i 1 timme vid RT.
OBS: För enkel hantering kan dropparna av antikroppslösning placeras på ett ark självtätande termoplastfilm (se Materialtabell) i en annan behållare istället för direkt på en fast yta. - Samla upp täckglasen med en pincett, och efter att försiktigt ha dränerat bort överflödig primär antikroppslösning med tunna våtservetter, sätt tillbaka täckglasen (cellsidan uppåt) i 24-hålsplattan och tvätta dem tre gånger med PBS.
- Upprepa steg 2.10. Använd en pincett, samla upp täckglasen från varje brunn, dränera försiktigt bort överflödig PBS med tunna vävnadsservetter och lägg försiktigt ner varje täckglas (cellsidan nedåt) på en 50 μL droppe sekundär antikroppslösning utspädd 1:1 000 i 1 % BSA/PBS-lösning (t.ex. Cy3 get Anti-Armenian Hamster IgG, som har minimal korsreaktivitet med nötkreatur, människa, serumproteiner från mus, kanin och råtta, se Materialförteckning). Inkubera i en fuktad kammare i 1 timme vid RT.
OBS: Valfritt: En cytoskelettmarkör kan användas utöver den sekundära antikroppen för den efterföljande bildanalysen (dvs. Alexa Fluor 647 Phalloidin utspätt 1:1 000, se Materialförteckning). För enkel hantering kan dropparna av antikroppslösning placeras på ett ark tätningsfilm i en annan behållare istället för direkt på en fast yta. - Samla upp täckglasen med en pincett och, efter att ha dränerat överflödig sekundär antikroppslösning, placera täckglasen i 24-hålsplattan (cellsidan uppåt) och tvätta dem tre gånger med 500 μL PBS.
- Använd en pincett, samla upp täckglasen, dränera försiktigt bort överflödig PBS med tunna våtservetter och lägg försiktigt ner varje täckglas (cellsidan nedåt) på en 50 μL droppe av 1:4 000 Hoechst-lösning (Hoechst 33342) i PBS. Inkubera i en fuktkammare i 5 minuter vid RT.
OBS: För enkel hantering kan dropparna av antikroppslösning placeras på ett ark tätningsfilm i en annan behållare istället för direkt på en fast yta. - Samla upp täckglasen med en pincett, och efter att försiktigt ha dränerat bort överflödig Hoechst-lösning med tunna våtservetter, sätt tillbaka täckglasen i 24-hålsplattan och tvätta tre gånger med PBS och en gång med avjoniserat vatten (500 μL per tvätt).
- Töm försiktigt överskottet av avjoniserat vatten med tunna våtservetter och lägg försiktigt ner varje täckglas (cellsidan nedåt) på en 10-20 μL droppe monteringslösning (se materialtabell) som fläckas på ett objektglas för immunofluorescens, undvik bildandet av luftbubblor.
OBS: Monteringsmediet som används här har samma brytningsindex som nedsänkningsolja och härdar efter några timmar vid RT eller över natten vid 4 °C. Icke-härdande monteringslösningar kan användas, men försiktighet måste iakttas för att försegla täckglaset med nagellack. - Ta bort överflödig monteringslösning genom aspiration och låt proverna torka medan de ligger platt vid RT över natten i mörker, antingen i en objektglashållare eller täckt med aluminiumfolie.
3. Bildtagning
- Slå på konfokalmikroskopet. Öppna bildbehandlingsprogrammet (se Materialtabell) för att starta bildtagningsinställningen.
- På fliken Funktion väljer du objektivlinsen Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 för att ta bilderna för analys.
- På fliken Förvärvsfunktion slår du på lämpliga lasrar i laserzonen på kontrollpanelen (Argon, Diode-405-30, DPSS 561-10 och HeNe633).
- I zonen Bildinställning på Kontrollpanelen skapar du fyra spår, där varje spår motsvarar en kanal, för att utföra sekventiell insamling.
- Ställ in lämplig upplösning för bilderna i fönstret Exponeringsläge . Ställ in upplösningen på 1 024 x 1 024 (bildstorlek) och välj ett bitdjup på 16 bitar.
- För varje kanal, justera lasereffekten och förstärkningen för att få en bra signal utan mättade pixlar, vilket skulle hindra bildintensitetsanalysen. Använd Live-knappen för att ställa in laserutgångsnivån och förstärkningen (Master).
OBS: Användning av intervallindikatoralternativet rekommenderas för detektering av mättade pixlar. Håll lasereffekten mellan 1 % och 10 % och förstärkningen (Master) under 850 för att undvika bakgrundsljud. - I zonen Kanaler på kontrollpanelen, ställ in samma nålhålsbländare för varje kanal, med hänsyn till 1 Airy Unit (AU) för kanalen med den högsta våglängden.
- Hämta 10 slumpmässiga fält som innehåller liknande mängder celler (20-30 celler per fält). Förvärvet av 100-200 celler per kondition kommer att ge god kraft för den senare bildanalysen.
4. Bildanalys av ATG9A-spridning
- Ladda ner FIJI-programvara från internet (se materialförteckning). Öppna bilden med FIJI genom att klicka på Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer.
- Klicka på Analysera > Ställ in mätningar och välj Medelvärde för grått värde i mätfönstret för intensitetsanalysen.
- Klicka på Bild > Färg > Split Channels och separera kanalerna i tre bilder (Golgi-markör, cytoskelett, ATG9A-signal).
- Gå till Bild > Justera > tröskel och definiera ett tröskelvärde i kanalen som motsvarar Golgi-markören.
- Klicka på Redigera > markering > Skapa markering och skapa en markering från den binära bilden.
- Gå till Redigera > urval > Lägg till i chef > Byt namn (Golgi), spara markeringen i ROI-hanteraren och byt namn på den till Golgi.
- Klicka på Bild > Justera > tröskel och definiera ett tröskelvärde i kanalen som motsvarar cytoskelettmarkören för att definiera cellkonturen.
- Gå till Redigera > markering > Skapa markering och skapa en markering från den binära bilden.
- Klicka på Redigera > urval > Lägg till i chef > Byt namn (totalt), spara urvalet i ROI-hanteraren och döp om det till Totalt.
- Välj den bild som motsvarar ATG9A-färgningen.
- I Analysera > mät tillämpar du ROI Golgi genom att klicka på den och mäter intensiteten i Golgi-regionen.
- Klicka på Analysera > mät, tillämpa ROI-summan genom att klicka på den och mät intensiteten i den totala regionen.
- Upprepa proceduren i alla bilder, spara resultaten som .csv filer och bearbeta data med följande formel:
ATG9A spridningshastighet = Golgi-intensitet/total intensitet
5. Avbildning av ATG9A-konstruktioner i levande celler
- Frö HEK293A celler (eller valfria celler) i 2 ml medium i en 60 mm vävnadsodlingsskål så att de når ~65%-70% sammanflöde nästa dag; Detta ger vanligtvis 1 x 10 6-2 x 106 celler.
- Följande dag bereds lipofektamin:DNA-blandningar (eller ett lämpligt alternativt DNA-transfektionsreagens, se materialförteckning) enligt följande:
- Beroende på konstruktuttryckets effektivitet, späd 0,5-2 μg plasmid-DNA till 100 μL av ett lämpligt serumfritt medium och blanda försiktigt lösningen genom att pipettera upp och ner. Inkubera blandningen i 5 minuter vid RT.
OBS: Plasmid-DNA-konstruktionen är experimentspecifik. Forskare kan antingen klona själva eller få från författarna på begäran. - Späd lipofektamin 2000 transfektionsreagens i förhållandet 3:1 lipofektamin:DNA till 100 μl av ett lämpligt serumfritt medium och blanda försiktigt lösningen genom att pipettera upp och ner. Inkubera denna blandning i 5 minuter vid RT.
- Blanda båda lösningarna genom att försiktigt pipettera upp och ner och inkubera i 20 minuter vid RT.
- Beroende på konstruktuttryckets effektivitet, späd 0,5-2 μg plasmid-DNA till 100 μL av ett lämpligt serumfritt medium och blanda försiktigt lösningen genom att pipettera upp och ner. Inkubera blandningen i 5 minuter vid RT.
- Tillsätt lipofectamine:DNA-blandningen till varje cellodlingsplatta som innehåller 4 ml tillväxtmedium och gunga försiktigt plattan fram och tillbaka för att fördela blandningen jämnt. Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator vid 10 % CO2 .
- Byt ut mediet mot ett färskt odlingsmedium 4 timmar efter transfektionen och inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator med 10 % CO2 över natten.
- Nästa dag, trypsinisera, räkna och återplantera cellerna på odlingsskålar som är lämpliga för mikroskopi av levande celler (odlingsskålar med ett glasglas nr 1.5, se Materialförteckning). Frö 0,4 x 10 6-0,7 x 106 celler på disken för att nå ~60%-75% sammanflöde på täckglaset vid tidpunkten för avbildning.
OBS: Beläggning med poly-D-lysin, som förklaras i steg 2.1, rekommenderas för HEK293A celler. - Nästa dag (48 timmar efter transfektionen) ska du avbilda cellerna.
6. Undersökning av glykosyleringstillståndet för ATG9A
- Frö HEK293A celler (eller valfria celler) i en 10 cm vävnadsodlingsskål så att de når ~80% sammanflöde nästa dag om du planerar att undersöka endogent ATG9A, vilket vanligtvis ger 1,5 x 10 6-2,5 x 106 celler i 10 ml. Alternativt kan du så cellerna så att de når ~65%-70% sammanflöde om man transfekterar ATG9A-konstruktioner, vilket vanligtvis ger 1 x 10 6-1,5 x 106 celler i 10 ml.
- Behandla cellerna med 100 μg/ml cyklohexamid (CHX, se materialförteckning) eller vehikel nästa dag. Inkubera i 24 timmar (eller till önskad tidpunkt).
- Ta bort cellerna från inkubatorn, aspirera mediet och lägg på is. Byt ut den mot 5 ml iskall 1x PBS. Lossa cellerna fysiskt från skålen med hjälp av en cellskrapa och pipettera PBS-celllösningen i ett 15 ml koniskt bottenrör. Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera cellerna.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i ~100 μL (beroende på cellpelletens storlek) iskall TNTE-lysbuffert (1 % Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA) kompletterat med cocktailtabletter med proteashämmare (se materialförteckning) och överför till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Inkubera lysatet på is i 15 minuter. Centrifugera därefter lysatet vid 20 000 x g i 10 minuter vid 4 °C för att sedimentera kärnorna och det olösliga skräpet och överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Kvantifiera proteinkoncentrationen i lysatet med hjälp av Bradfordmetoden20 och en spektrofotometer som kan mäta vid en våglängd på 595 nm.
- Normalisera proteinmängderna och kombinera 16 μL lysat (som inte innehåller mer än 100 μg protein totalt) med 5x PNGase F (Peptid:N-glykosidas F) buffert enligt tillverkarens instruktioner innan du tillsätter 1 μL PNGase F-enzym (se Materialförteckning). Inkubera enligt anvisningar från PNGase F-tillverkaren.
- Tillsätt en volym på 3x Laemmli provbuffert för att uppnå en koncentration på 1x och inkubera vid 65 °C i 5 minuter innan du laddar för elektrofores med en Tris-acetatgel för att maximera separationen av proteiner. Överför proteinerna från gelen till ett lämpligt membran (dvs. PVDF [polyvinylidendifluorid]) med hjälp av standardprotokoll för western blot-test21 (se materialförteckning).
OBS: Kokning av proverna vid 95 °C kommer att göra att ATG9A aggregeras, vilket minskar detektionen av ATG9A. - Utför western blot med specifika antikroppar för ATG9A (STO-215-antikropp, egenproducerad1) (se materialtabell). Lämna den högre molekylviktsdelen av membranet oskuren för att visualisera den högre ATG9A-molekylviktsarten.
Representative Results
ATG9A är ett transmembranprotein associerat med flera intracellulära membrankompartment 8,17,22,23,24. Under basala förhållanden är ATG9A huvudsakligen lokaliserad vid trans-Golgi-nätverket (TGN), vilket indikeras av immunofluorescensen hos det endogena proteinet och överlappningarna med GM130, en cis-Golgi-markör (Figur 1A), samt i små vesiklar som delvis överlappar med det endocytiska återvinningsfacket (ERC)23. ATG9A-lokalisering vid Golgi kan detekteras med hjälp av olika immunofluorescensprotokoll. Den vesikulära fraktionen av ATG9A, liksom dess förändring av lokalisering, i synnerhet ökningen av vesikulärpoolen, som svar på specifika stimuli såsom närings- och serumsvält, kan dock vara ganska varierande i intensitet och svår att visualisera med konventionella avbildningsmetoder. Förhållandet mellan ATG9A lokaliserad vid Golgi och ATG9A lokaliserad till en vesikulär fraktion kallas ATG9A-spridningshastigheten. För att upptäcka förändringar i ATG9A-spridningshastigheten, till exempel vid EBSS-behandling, som används för att tömma både serum och aminosyror, är en Golgi-markör som GM130 eller TGN46 och en cytoskelettmarkör som falloidin, som färgar cellkonturen25, användbara för att enkelt kvantifiera ATG9A-dispersionen (Figur 1B). Det är viktigt att notera att analysen av det genomsnittliga fluorescensförhållandet endast kan tolkas som ett jämförande mått mellan betingelser snarare än som en fast spridningshastighet. Förhållandet mellan kompartmenten är i hög grad beroende av biologiska och icke-biologiska faktorer, t.ex. vilken cellinje som används, färgningskvaliteten eller de tröskelmetoder som används (figur 1B). Av denna anledning måste forskaren sätta upp en pipeline som kan detektera ATG9A Golgi-anrikning under sina specifika experimentella förhållanden och sedan utöka analysen med samma parametrar till alla bilder i uppsättningen som ska analyseras. Representativa binära bilder och områden som valts ut för analys av ATG9A-medelfluorescens visas som en guide i figur 1B.
ATG9A hyser flera transmembrandomäner flankerade av två relativt flexibla och ostrukturerade N- och C-terminala domäner, varav C-terminalsekvensen omfattar nästan hälften av proteinet12. Det är viktigt att notera att lokaliseringsmönstret för överuttryckt ATG9A kan påverkas av vilken proteinände som är märkt (Figur 2A). I synnerhet när man använder transienta expressionssystem och märker ATG9A direkt på dess N-terminal med en fluorescerande tagg (t.ex. eGFP, mRFP eller derivat), kan dess Golgi-lokalisering delvis äventyras, med mindre anrikning som ses under basala (dvs. matade) förhållanden, medan ATG9A-vesiklarna fortfarande är lätt synliga (figur 2A). Att tagga ATG9A på dess C-terminal verkar inducera något större GFP-positiva kluster som kan aggregeras. Slutligen visar en monomer version av mRFP-ATG9A också liknande fluorescerande kluster av vesiklar och liten Golgi-färgning i överuttryckande celler (Figur 2A).
ATG9A veckas i ER-membranet innan det transporteras till Golgi- och ATG9A-vesiklarna. Under sin vistelse i ER modifieras ATG9A av N-bundna glykaner på Asparagine 99, och när den når Goggi förvärvar den komplexa, mogna N-bundna glykaner 1,14. Denna modifiering genom glykosylering kan detekteras genom western blot genom uppkomsten av ett dubbelband14. I överensstämmelse med dess intracellulära lokalisering hyser de flesta endogena ATG9A komplexa N-kopplade glykaner, och därför är det högre molekylviktsbandet dominerande, med ett svagt lägre molekylviktsband också synligt (Figur 2B). Närvaron av ett dubbelband ses lättast vid användning av Tris-acetatgeler för att förbättra upplösningen av proteiner med högre molekylvikt (Figur 2B, kontroll, t = 0). När det endogena proteinet utsätts för PNGas F-behandling (peptid:N-glykosidas F), som tar bort de flesta av de komplexa N-länkade glykanerna, körs proteinet som ett enda band (Figur 2B, PNGas F, t = 0). Därför kan den N-kopplade glykosyleringsstatusen för ATG9A användas som en proxy för att övervaka utgången av ATG9A från ER till Golgi, vilket återspeglas av det relativa förhållandet mellan de två banden.
Vid transfektering av mRFP-ATG9A-konstruktioner ackumuleras det överuttryckta proteinet initialt i ER, möjligen på grund av att transportmaskineriet inte kan vika och trafikera hela ATG9A, och det lägre molekylviktsbandet dominerar (Figur 2C, kontroll t = 0). Noterbart är att efter 24 timmars uttryck av mRFP-ATG9A finns det ungefär en jämn fördelning mellan de övre och nedre banden, vilket tyder på att mRFP-ATG9A-poolen rör sig in i Golgi (figur 2C, kontroll, t = 24). Om cellerna behandlas med cykloheximid (CHX), som blockerar de novo-proteinsyntes 26, kan veckningen och utgången av ATG9A från ER klarläggas. Eftersom det endogena proteinet är veckat, glykosylerat och bosatt i Golgi, förändrar behandling med CHX inte signifikant förhållandet mellan de lägre och högre molekylviktsbanden (Figur 2B, Kontroll). Men med hjälp av det transienta uttrycket av mRFP-ATG9A främjar CHX-behandlingen ackumuleringen av det högre molekylära viktbandet (Figur 2C, Kontroll, CHX t = 24). Det överuttryckta mRFP-ATG9A-bandet med högre molekylvikt kollapsar in i det nedre bandet efter behandling med PNGas F (Figur 2C, PNGas F, t = 24). Dessa data visar att det endogena proteinet snabbt förvärvar mogna glykaner, vilket återspeglas av dominansen av det högre molekylära viktbandet, och CHX-jakten påverkar inte förhållandet mellan dubbelbanden (Figur 2B). När det gäller övergående överuttryckt mRFP-ATG9A inducerar CHX-behandling ackumulering av det övre bandet, vilket indikerar att mer mogna glykaner förvärvas när ER-poolen veckar sig och lämnar ER till Golgi (Figur 2C).
Tillägget av en länk mellan ATG9A-sekvensen och de fluorescerande taggarna kan vara till hjälp för att främja en mer fysiologisk lokalisering och transport av proteinet. Sammansmältning av en 3x-FLAG-sekvens (24 aminosyror) mellan en N-terminal fluorofor och ATG9A hjälper det överuttryckta proteinet att bete sig på samma sätt som det endogena (Figur 3). Faktum är att överuttryckt mCherry-3xFLAG-ATG9A samlokaliseras med Golgi-markören GM130 under utfodringsförhållanden (Figur 3A). Det är viktigt att notera att denna lokalisering och det vesikulära ATG9A-facket bevaras över tid, vilket gör det möjligt att studera ATG9A i tid och rum (figur 3B).
Figur 1: Bildanalys av endogen ATG9A-lokalisering. (A) Representativ immunofluorescensbild av endogent ATG9A (rött), GM130 som en Golgi-markör (grön) och falloidin för att visualisera aktincytoskelettet (cyan). Skalstapel = 10 μm. (B) Arbetsflöde för bildanalys för att bestämma andelen endogen ATG9A som lokaliseras vid Golgi-området. Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av fluorescerande taggade-ATG9A-konstruktioner genom lokalisering och glykosylering. (A) eGFP N-terminalt märkt ATG9A är mindre lokaliserad vid Golgi och finns främst i vesiklarna. eGFP C-terminalt taggad ATG9A uppvisar aggregat i cellen (vissa exempel är markerade med vita pilspetsar; eGFP-ATG9A och ATG9A-eGFP är i grönt). mRFP N-terminalt märkt ATG9A är mindre lokaliserad vid Golgi och finns främst i vesiklarna. N betecknar den ungefärliga placeringen av cellkärnan, och mRFP-ATG9A är i rött. Skalstapel = 5 μm. (B) Endogent ATG9A uppträder som två band när de analyseras med western blot (pilspetsar): ett övre band (komplexa N-länkade glykaner) och ett nedre band (inga mogna N-länkade glykaner). Behandling med cyklohexamid (CHX) påverkar inte förhållandet mellan de övre och nedre banden. Behandling med PNGase F gör att det övre bandet försvinner. (C) Efter transient transfektion av mRFP-taggad ATG9A i HEK293A celler är två framträdande band synliga på western blot (pilspetsar). Behandling med PNGase F gör att det övre bandet försvinner. Behandling med CHX efter transfektion leder till ökad glykosylering eftersom poolen av transfekterad ATG9A transporteras från akuten till Golgi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Analys av mCherry-3xFLAG-ATG9A-lokalisering genom immunofluorescens och live-imaging. A) Immunofluorescensexperiment av HEK293A celler som tillfälligt överuttrycker mCherry-3xFLAG-ATG9A och färgas med Golgimarkören GM130. Skalstapel = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A är i rött och GM130 Golgi-markören är i grönt. (B) Montage från live-avbildningsexperiment i HEK293A celler som tillfälligt överuttrycker mCherry-3xFLAG-ATG9A. N betecknar kärnans ungefärliga läge. Tidsram = 1 fps. Skalstapel = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A är i rött. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Denna studie illustrerar de olika verktyg som kan användas för att undersöka ATG9A-lokalisering. För det första beskriver denna studie hur ATG9A kan visualiseras genom immunofluorescens och hur detta kan kvantifieras. För det andra jämförs strategier som kan användas för att märka ATG9A med en fluorescerande markör för visualisering i antingen fasta eller levande celler. Slutligen beskriver detta arbete hur man undersöker och använder glykosyleringstillståndet för ATG9A för att avgöra om ATG9A har lämnat ER och trafikerat genom Golgi.
När det gäller karakterisering av endogen ATG9A-lokalisering genom immunofluorescens måste försiktighet iakttas med de fixerings- och permeabiliseringsmetoder som används för experimentet. Enligt de standardprocedurer som beskrivs här är paraformaldehydfixering i kombination med digitoninpermeabilisering goda förutsättningar för att visualisera både Golgi-associerade ATG9A- och ATG9A-positiva vesiklar7. Tillsammans med fixering och permeabilisering är tidpunkten för inkubation med den primära antikroppslösningen också kritisk. Vi har observerat, men inte dokumenterat, att högre koncentrationer av primär antikroppslösning och längre inkubationstider kan leda till en missvisande ökning av Golgi-färgningen av ATG9A, vilket så småningom äventyrar detektionen av ATG9A-omfördelning till andra membranfack. Dessutom, eftersom ATG9A finns i många intracellulära fack 1,13,17,22,23,24,27,28, är det viktigt att använda specifika membranmarkörer, tillsammans med ATG9A, för att identifiera var ATG9A är placerad. Flera metoder har tidigare använts för att kvantifiera ATG9A-lokalisering, inklusive Pearsons korrelationskoefficient för samlokalisering29. Den partiella överlappningen av ATG9A med Golgi och det distinkta vesikulära facket leder dock till ett stort antal pixelavvikelser, vilket kan snedvrida tolkningen av korrelationskoefficienten. Av denna anledning föredras ett mer förenklat tillvägagångssätt baserat på förhållandet mellan medelfluorescensen i de två fack som ska analyseras, och detta tillvägagångssätt är mindre känsligt för cell-för-cell-variabilitet. För ytterligare information om bildanalys genom mikroskopi hänvisas läsarna till denna bok kapitel30.
När man undersöker glykosyleringsstatusen för ATG9A är valet av geler för att köra western blots viktigt. För detta protokoll är 3%-8% Tris-acetatgeler att föredra eftersom de erbjuder den högsta upplösningen för större proteiner, men alternativa gelkompositioner eller löpande buffertar som erbjuder en bra separation av proteiner med hög molekylvikt kan också användas. Experimentatorn kan säkerställa maximal separation av proteiner genom att öka tiden för elektrofores.
Vid beredning av proverna för att visualisera ATG9A på western blot, bör försiktighet iakttas så att proverna inte kokas efter tillsats av Lapemmi-bufferten. kokning vid 95 °C inducerar bildandet av ATG9A-aggregat, och följaktligen migrerar ATG9A inte effektivt in i gelen1. Att värma proverna vid 65 °C i 5 minuter rekommenderas27.
Höga nivåer av transfektion leder vanligtvis till högre ackumulering av ATG9A i ER, medan måttliga uttrycksnivåer hjälper den fysiologiska lokaliseringen av proteinet. Anekdotiskt sett bidrar inkubationstider på 72 timmar i stället för 48 timmar ofta till att minska ER-lokaliseringsartefakter. Framför allt kan mRFP-ATG9A korrekt rapportera om ATG9A-trafik och funktion om nivåerna kontrolleras genom uttrycksnivåer eller genom att använda stabila cellinjer 8,9,22,27.
Misslyckandet hos en population av överuttryckt ATG9A att förvärva mogna N-bundna glykaner kan användas som en avläsning för störd ATG9A-handel. Vid mutering eller radering av vissa regioner av ATG9A finns det en risk för ökad ER-retention, vilket kan leda till att man inte förvärvar mogna N-bundna glykaner och därmed ett snabbare migrerande ATG9A-band på western blot. Forskare som arbetar med trunkerade ATG9A-konstruktioner bör kontrollera om det finns ER-retention, glykosyleringstillstånd och Golgi-lokalisering.
För avbildning av levande celler av ATG9A ger ett Airyscan-mikroskop, som förlitar sig på den snabba Airyscan-funktionen, optimal upplösning på vanligtvis cirka 120 nm. För lokaliseringsnoggrannhet är bildhastigheter på cirka 1–2 bilder per sekund (fps) i superupplösningsläge optimala beroende på hur många kanaler som avbildas. Liknande konfokalmikroskop som kan avbilda i hög hastighet kan också användas för avbildning av ATG9A-vesiklar; Det bör dock noteras att bildhastigheten direkt kan påverka upptäckten av händelser och därför påverka tolkningen av data.
Sammanfattningsvis beskriver de presenterade protokollen sätt att kvantifiera och karakterisera ATG9A-lokalisering genom immunofluorescens, levande cellmikroskopi och dess glykosyleringsstatus. Dessa protokoll kan hjälpa forskare som arbetar med ATG9A och hjälpa till att undvika vissa fallgropar.
Disclosures
S.A.T. sitter i Casma Therapeutics vetenskapliga råd.
Acknowledgments
Författarna tackar Rocco D'Antuono för korrekturläsning av aspekter av manuskriptet, liksom alla nuvarande och tidigare medlemmar i labbet för molekylär cellbiologi av autofagi (MCBA) för diskussionerna som ledde till förfiningen av dessa protokoll. A. v.V., S.d.T., E.A., S.A.T, stöddes av Francis Crick Institute som får sin kärnfinansiering från Cancer Research UK (CC2134), UK Medical Research Council (CC2134). Denna forskning finansierades helt eller delvis av Wellcome Trust (CC2134). För open access-ändamål har författaren tillämpat en CC BY-licens för offentlig upphovsrätt för alla manuskriptversioner som accepterats av författaren till följd av detta bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 60 mm tissue culture dish | Thermofisher Scientific | 10099170 | For tissue culture |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofisher Scientific | A22287 | Actin stain |
| anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
| anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
| anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
| ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
| ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Bemis Parafilm | Thermofisher Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
| CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
| D-Glucose | / | For EBSS | |
| Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
| DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
| eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
| FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
| Hoechst | Thermofisher Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
| KCl | / | For EBSS | |
| L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
| LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
| MgCl2 | / | For PBS | |
| MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
| Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
| NaCl | / | For EBSS | |
| NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
| NaHCO3 | / | For EBSS | |
| NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofisher Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermofisher Scientific | 31985062 | For Cell Transfection |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
| pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
| PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
| Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
| Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
| RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Triton X-100 | Thermofisher Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
| Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
| Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |
References
- Young, A. R., et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).
- Maeda, S., et al. lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).
- Matoba, K., et al. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).
- Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).
- Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. Autophagy genes in biology and disease. Nature Reviews: Genetics. , (2023).
- Sawa-Makarska, J., et al. Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation. Science. 369 (6508), (2020).
- Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure. Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085 (2020).
- Orsi, A., et al. Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).
- Judith, D., et al. ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).
- Karanasios, E., et al. Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nature Communications. 7, 12420 (2016).
- Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).
- Guardia, C. M., et al. Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery. Cell Reports. 31 (13), 107837 (2020).
- Soreng, K., et al. SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2. EMBO Reports. 19 (4), e44837 (2018).
- Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).
- Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis. Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).
- Takahashi, Y., et al. The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs. Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).
- Imai, K., et al. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation. Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- van Vliet, A. R., et al. ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation. Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269 (2020).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting. Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).
- Lamb, C. A., et al. TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic. EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).
- Longatti, A., et al. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).
- Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy. Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).
- DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities. BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Webber, J. L., Tooze, S. A. Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP. EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).
- Claude-Taupin, A., et al. ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization. Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).
- Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization - Co-occurrence versus correlation. Journal of Cell Science. 131 (3), 211847 (2018).
- D'Antuono, R. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).
