Summary
В этом протоколе описывается применение атомно-силовой микроскопии и наноразмерной инфракрасной спектроскопии для оценки производительности фототермической наноразмерной инфракрасной спектроскопии при характеризации трехмерных многополимерных образцов.
Abstract
Многофазные полимерные системы охватывают локальные домены с размерами, которые могут варьироваться от нескольких десятков нанометров до нескольких микрометров. Их состав обычно оценивается с помощью инфракрасной спектроскопии, которая дает среднее значение отпечатков различных материалов, содержащихся в исследуемом объеме. Однако такой подход не дает никаких подробностей о расположении фаз в материале. Межфазные области между двумя полимерными фазами, часто в наноразмерном диапазоне, также труднодоступны. Фототермическая наноразмерная инфракрасная спектроскопия отслеживает локальный отклик материалов, возбуждаемых инфракрасным светом, с помощью чувствительного зонда атомно-силового микроскопа (АСМ). В то время как этот метод подходит для исследования небольших объектов, таких как отдельные белки на нетронутых золотых поверхностях, характеристика трехмерных многокомпонентных материалов более труднодоступна. Это связано с относительно большим объемом материала, подверженного фототермическому расширению, определяемому лазерной фокусировкой на образце и тепловыми свойствами полимерных составляющих, по сравнению с наноразмерной областью, исследуемой зондом АСМ. Используя гранулу полистирола (ПС) и пленку из поливинилового спирта (ПВА), мы оцениваем пространственный след фототермической наноразмерной инфракрасной спектроскопии для анализа поверхности в зависимости от положения ПС в пленке ПВА. Исследовано влияние положения признака на наноразмерные инфракрасные изображения, получены спектры. Представлены некоторые перспективы будущих достижений в области фототермической наноразмерной инфракрасной спектроскопии с учетом характеризации сложных систем со встроенными полимерными структурами.
Introduction
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) стала незаменимой для получения изображений и определения морфологии широкого спектра образцов с наноразмерным разрешением 1,2,3. При измерении прогиба кантилевера АСМ в результате взаимодействия острого наконечника с поверхностью образца разработаны протоколы наноразмерной функциональной визуализации для измерения локальной жесткости и адгезии зонда с образцом 4,5. Для анализа мягких конденсированных сред и полимеров очень востребованы АСМ-измерения, изучающие наномеханические и нанохимические свойства локальных доменов 6,7,8. До появления наноразмерной инфракрасной (наноИК) спектроскопии зонды АСМ подвергались химической модификации для оценки наличия различных доменов на силовой кривой АСМ и вычета характера взаимодействия зонда с образцом. Например, этот подход был использован для выявления трансформации микродоменов поли(трет-бутилакрилата) на поверхности тонких пленок полистирол-блок-поли(трет-бутилакрилат)блок-сополимера, обработанных циклогексаном, на уровне 9 с длиной волны ниже50 нм.
Комбинация инфракрасного (ИК) света с АСМ оказала значительное влияние на науку о полимерах6. Традиционная ИК-спектроскопия является широко используемым методом для изучения химической структуры полимерных материалов10,11, но она не дает информации об отдельных фазах и межфазном поведении, так как области слишком малы по сравнению с размером ИК-пучка, используемого для зондирования образца. Эта проблема характерна и для ИК-микроспектроскопии, так как она ограничена оптическим дифракционным пределом6. Такие измерения усредняют вклад всей области, возбуждаемой ИК-светом; Сигналы, возникающие в результате присутствия наноразмерных фаз внутри исследуемой области, либо демонстрируют сложные отпечатки пальцев, которые должны быть деконволюционированы во время постобработки, либо теряются из-за уровня сигнала ниже детектируемого уровня. Следовательно, необходимо разработать инструменты, способные к наноразмерному пространственному разрешению и высокой ИК-чувствительности для исследования наноразмерных химических свойств в сложных средах.
Были разработаны схемы достижения наноИК-спектроскопии, сначала с использованием металлического зонда АСМ в качестве наноантенны12,13, а в последнее время с использованием способности кантилевера АСМ отслеживать изменения в фототепловом расширении, возникающие при ИК-освещении образца 12,14,15. В последнем используется импульсный перестраиваемый ИК-источник света, настроенный на полосу поглощения зондируемого материала, что заставляет образец поглощать излучение и подвергаться фототермическому расширению. Такой подход хорошо подходит для органических и полимерных материалов. Импульсное возбуждение позволяет обнаружить эффект кантилевером АСМ в контакте с поверхностью образца в виде осцилляции. Амплитуда одного из контактных резонансов системы, наблюдаемых в частотном спектре, затем контролируется как функция длины волны освещения, которая составляет спектр поглощения наноИК материала под зондомАСМ 15. Пространственное разрешение наноИК-визуализации и спектроскопии ограничено различными эффектами фототермического расширения материала. Было оценено, что фототермическая наноИК-спектроскопия с использованием контактного режима АСМ может приобретать спектральные свойства колебательного поглощения материалов с пространственным разрешением масштаба ниже 50 нм14, при этом недавние работы продемонстрировали обнаружение мономеров и димеров α-синуклеина 16,17. Однако количественные исследования эффективности наноИК-измерений на гетерогенных полимерных материалах, собранных в различных конфигурациях, например, в случае поглотителей конечных размеров, встроенных в объем различных полимерных пленок, остаются ограниченными.
Целью данной статьи является создание полимерной сборки со встроенным элементом известной размерности для оценки чувствительности фототеплового расширения и пространственного разрешения наноИК при анализе поверхности. Протокол охватывает приготовление тонкой пленки полимера поливинилового спирта (ПВА) на кремниевой подложке и размещение трехмерного гранулы полистирола (ПС) на пленку ПВА или встроенную в нее, что представляет собой формирование модельной системы. НаноИК-визуализация и спектроскопия описываются в контексте оценки сигналов, генерируемых одним и тем же шариком PS, расположенным на пленке PVA или под ней. Оценено влияние положения валика на наноИК-сигналы. Обсуждаются методы оценки пространственного следа шарика в наноИК-карте, а также рассматриваются эффекты нескольких параметров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление раствора поливинилового спирта (ПВА)
- Измерьте воду и гранулы полимера ПВА (см. Таблицу материалов), чтобы создать раствор объемом 10 мл при соотношении ПВА и воды 20% по весу.
- Нагрейте воду в стеклянной посуде над конфоркой, установленной до 100 °C.
- Поместите гранулы полимера ПВА в нагретую воду. Вставьте магнитную мешалку.
- Уменьшите огонь до 80 °C и помешивайте до полного растворения ПВА.
- Накройте стеклянную посуду сверху, чтобы предотвратить загрязнение.
- После полного растворения поместите 20% раствор ПВА в соответствующий контейнер для хранения при комнатной температуре.
2. Приготовление кремниевых пластин с покрытием из кремния (Si) с ПВА-покрытием
- Разрежьте кремниевую (Si) пластину (см. Таблицу материалов) на квадраты ~10 x 10 мм2 .
- Очистите кремниевую подложку изопропиловым спиртом и дайте ей высохнуть.
- Поместите чистую кремниевую пластину на патрон машины для нанесения покрытий (см. Таблицу материалов).
- Каплями налейте примерно 10 мкл раствора ПВА на центр кремниевой подложки. Старайтесь не допускать образования пузырей.
- Покройте кремниевую подложку однородной пленкой ПВА методом центрифугирования в течение 30 с при 1 500 оборотах в минуту (об/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Заданный объем жидкости и параметры отжима создают равномерный слой ПВА по всей поверхности подложки достаточной толщины, чтобы предотвратить быстрое высыхание между отжимом покрытия и размещением шариков PS на поверхности ПВС на следующем этапе.
- Извлеките образец из установки для нанесения покрытий и поместите его в чистый контейнер для образцов, чтобы предотвратить загрязнение, прежде чем переносить гранулы полистирола.
3. Размещение гранул полистирола на поверхность, покрытую ПВА
- Очистите кремниевую подложку изопропиловым спиртом и дайте ей высохнуть.
- С помощью пипетки поместите 1 мкл гранул полистирола, взвешенных в воде, на центр подложки.
- Дайте воде испариться, поместив образец в отсек для хранения, содержащий осушитель бентонитовой глины.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образец сохраняется за счет снижения воздействия влаги. - Поместите подложку с покрытием ПВА (шаг 2.4) и подложку с высушенными гранулами полистирола (шаг 3.3) под оптический микроскоп. В зависимости от их размера, одна бусина будет видна в простой бинокль или потребует большего оптического увеличения.
- Аккуратно ослабьте бусины с помощью ультратонкого пинцета (см. Таблицу материалов). С помощью тонкой кисти для волос соберите несколько свободных бусин и слегка постучите волосками кисти по свежепокрытой ПВА пластине. Многократные взмахи должны позволить шарикам скапливаться в волосках кисти. Постучите по верхней части волосков кисти, чтобы потревожить порошок гранул PS, чтобы выпустить шарики на липкую поверхность ПВА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы кисть была качественной и чистой, чтобы избежать попадания волокон и загрязнений на поверхность пленки ПВА. На этом этапе важно быстро двигаться, чтобы ПВА не высохла полностью. - Повторяйте этот шаг до тех пор, пока оптическая микроскопия не подтвердит, что отдельные шарики полистирола прилипают к поверхности ПВА.
- Храните образец в чистом контейнере. Дайте образцу полностью высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцу следует дать полностью остыть и высохнуть, прежде чем выполнять дальнейшие попытки анализа. Измерения высоты АСМ или измерения поверхности с помощью профилографа позволяют оценить толщину последовательных пленок ПВА.
4. Загрузка образца для АСМ характеризации
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол основан на стандартных операционных процедурах платформы nanoIR2 (см. Таблицу материалов), но должен быть адаптирован в соответствии с моделью АСМ, используемой для измерения.
- Установите образец шарика ПВА и ПС на столик АСМ с помощью металлического диска АСМ и клейких язычков так, чтобы образец был надежно прикреплен к держателю образца.
- Установите наноИК-зонд (например, FORTGG) на держатель датчика АСМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кантилевер AFM имеет длину 225 мкм, ширину 27 мкм и толщину 2,7 мкм с радиусом наконечника менее 10 нм. Кантилевер покрыт золотой пленкой толщиной 45 нм с обеих сторон, чтобы ограничить его реакцию на верхнее ИК-излучение образца (см. таблицу материалов). Для измерений наноИК-спектроскопии предпочтительно использовать кантилевер, который перед использованием хранился в среде, свободной от полидиметилсилоксана. - Выровняйте считывающий лазер на свободном конце консольного луча, повернув ручки лазерной юстировки (регулировка положения лазера по осям X и Y и регулировка положения детектора по вертикали).
- Максимизируйте СУММ-сигнал детектора.
- Отрегулируйте положение детектора, повернув ручку отклонения так, чтобы лазер был выровнен по центру позиционно-чувствительного детектора системы считывания АСМ, что соответствует сигналу вертикального отклонения ~0 В.
- Нажмите на иконку Load в панели управления AFM " Probe ".
- Следуйте инструкциям на экране мастера. С помощью стрелок фокусировки определите фокальную плоскость консоли наноИК. Используйте элементы управления смещением по оси XY, чтобы расположить консоль в центре экрана (выровняв по белому кресту).
- Далее нажимаем на стрелки фокуса , чтобы найти фокальную плоскость поверхности образца.
- Используйте оптический вид системы и элементы управления перемещением по оси XY, чтобы расположить консольный наконечник над интересующим вас валиком и нажмите кнопку Далее.
- На экране включения установите «зазор» на 50 мкм и нажмите «Только приближение».
- Запустите процедуру Engage , чтобы приблизиться к наконечнику для визуализации.
5. Создание топографических и наноИК изображений мультиполимерного образца
- Получение топографических изображений в стандартном «Контактном режиме». После того, как положение консоли по отношению к валику PS установлено, начните заход на посадку, щелкнув значок зацепления на панели управления AFM "Probe". Заданное значение дифференциала прогиба 0,2 В используется для всего исследования, что соответствует силе ~100 нН.
В панели управления АСМ «Сканирование» установите частоту сканирования 0,8 Гц, размер сканирования (высоту и ширину), а также количество точек на строке и количество строк на изображении , которое будет использоваться для визуализации (здесь использовалось 512 x 512). Нажмите на кнопку Сканировать, чтобы получить изображение топографии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка кантилевера18 производится путем определения чувствительности к прогибу (в нм/В) по наклону кривой прогиб-расстояние, полученной при взаимодействии кантилевера с сапфировой подложкой (дополнительный рисунок 1A). Жесткость кантилевера определяется по тепловой настройке19 (дополнительный рисунок 1B). Резонанс кантилевера настраивается с помощью функции Лоренца. Жесткость кантилевера (в Н/м) определяется с помощью теоремы
о равнораспределении , где KB– постоянная Больцмана, T – температура (T = 295K), а P – площадь спектра мощности тепловых флуктуаций кантилевера, определяемая интегрированием лоренцевой аппроксимации данных тепловой настройки20. - Для наноИК-измерений расположите зонд АСМ на интересующем объекте, идентифицированном на топографическом изображении.
- Выберите значок камертона на панели управления nanoIR, чтобы определить частоты контактного резонанса кантилевера. Установите волновое число освещенности, которое будет возбуждать фототепловое расширение в материале. Установите диапазон частоты лазерных импульсов для развертки и установите рабочий цикл наноИК-лазера. Выберите «Получить » в «Окне настройки лазерного импульса».
- Выберите второй контактный резонанс системы зонд-образец для наноИК-измерений, расположив маркерную полосу (зеленая вертикальная линия) на пике второго контактного резонанса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор режима контактного резонанса может варьироваться в зависимости от типа кантилевера и образца. - Нажмите кнопку Optimize (Оптимизировать ), чтобы выровнять центр фокальной области ИК-лазера с положением консольного наконечника. Юстировка выполняется по выбранному волновому числу ИК-подсветки, соответствующему полосе поглощения исследуемого материала. Консоль расположена в центре лазерного следа (дополнительный рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Юстировка может варьироваться для различных волновых чисел в зависимости от модели лазера. - Получите фон ИК-лазерной подсветки. Он заключается в измерении выходного сигнала ИК-квантового каскадного лазера (ККЛ) в диапазоне длин волн излучения при выбранной частоте импульса (дополнительный рисунок 3). Это важно для коррекции фона наноИК-спектров.
- Получите спектр nanoIR, выбрав диапазон волновых чисел (здесь Start и Stop установлены на 1,530 см-1 и 1,800 см-1 соответственно), размер шага (2 см-1) и количество средних , используемых для измерения. Выполните фоновую коррекцию отображаемых спектров путем деления измеренной фототепловой амплитуды на ослабленный фон, которая заключается в умножении фона, собранного на шаге 5.2.4, на процент мощности, выбранный для измерения.
- Для наноИК-визуализации выберите интересующую область для визуализации.
- Включите автоматическую настройку контура фазовой автоподстройки (ФАПЧ) в «Окне настройки лазерного импульса» (доступ к которому можно получить по значку камертона ).
- Отрегулируйте минимальную и максимальную частоту, чтобы создать диапазон развертки с центром во втором резонансном режиме на общей панели управления.
- Обнулите фазу, щелкнув по нулю на панели управления ФАПЧ, а затем нажмите OK в окне «Настройка лазерных импульсов».
- Выберите ИК-визуализация включена, установив флажок в поле на панели управления nanoIR.
- На панели управления "Imaging View" выберите Height (Imaging View 1), Amplitude 2 (Imaging View 2) и Phase 2 (Imaging View 3) для получения топографических и химических изображений образца. Задайте направление сбора данных Трассировка (или Повторная трассировка). Линейная аппроксимация Линия часто требуется для наблюдения за топографическим изображением получаемого образца. Для параметра «Подгонка захвата» должно быть установлено значение «Нет».
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки сканирования, такие как направление сканирования или используемая цветовая палитра, могут быть изменены по мере необходимости. - В панели управления AFM «Сканирование» выберите значок «Сканировать ».
- Чтобы сохранить изображение, выберите значок « Сейчас » или «Конец кадра » на панели управления «Захват».
- Чтобы экспортировать данные, щелкните правой кнопкой мыши имя файла изображения или спектра в списках данных. Нажмите кнопку Экспорт и выберите формат файла для экспорта. Сохраните файл в нужной папке компьютера.
о равнораспределении , где KB– постоянная Больцмана, T – температура (T = 295K), а P – площадь спектра мощности тепловых флуктуаций кантилевера, определяемая интегрированием лоренцевой аппроксимации данных тепловой настройки20.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шарики PS ((C8H8)n) наносили на чистую кремниевую подложку (рис. 1A) и на ПВС ((CH2CHOH)n) (рис. 1B,C). Из-за плохой адгезии шарика к кремнию для этого образца не удалось получить наноИК-изображение в контактном режиме. Вместо этого, используя оптический вид образца в наноИК-диапазоне, зонд АСМ с позолоченным покрытием был включен в контакт с шариком PS в контактном режиме с расчетным усилием около 100 нН (рис. 2A). Импульсный ИК-лазер был настроен на возбуждение образца на 1730 см-1, поскольку ожидается, что и PS, и PVA будут поглощать на этом волновом числе. Частота импульсов лазера была развевана для определения контактного резонанса кантилевера для измерения спектра наноИК. При импульсном воздействии на частоте контактного резонанса для определения амплитуды колебаний контролировался отклик кантилевера (рис. 2Б). Затем наноИК-спектры были построены путем мониторинга амплитуды контактного резонанса в зависимости от волнового числа освещенности от 1530 до 1800 см-1 с шагом 2 см-1 (рис. 2C). В этом диапазоне (рис. 3А, врезка) спектр показал наличие двух ИК-полос с центрами на 1600 см-1 и 1730 см-1, соответствующих преобладающей моде растяжения фенильной части и подмножеству растяжения кольца в PS, соответственно21. Сравнение наноИК-спектра с инфракрасным спектром ФС с преобразованием Фурье в дальней зоне подтвердило наличие ароматической моды на расстоянии 1600 см-1 (рис. 3А). Однако было отмечено, что относительная амплитуда I1600/I1730 достоверно различалась в спектрах ИК-Фурье и наноИК-спектра с соответствующими значениями 2,9 и 0,9. Это было связано с механизмом детектирования наноИК-спектроскопии, которая отслеживает фототермическое расширение полимера, а не его поглощение, как в ИК-Фурье спектроскопии. В случае ФС это соответствовало более высокому фототермическому расширению при возбуждении ароматических поддиапазонов на 1730 см-1. НаноИК-спектр ПВА лучше согласуется со спектром ИК-Фурье спектра с преобладающей полосой поглощения с центром в ~1730 см-1 (рис. 3B). Хотя эта полоса не ожидалась в чистом ПВА, который не содержит группы C=O, предыдущие работы показывают, что присутствие полосы может быть отнесено к карбонильным функциональным группам из-за остаточного ацетата, используемого при приготовлении ПВА (скорость гидролиза ~80%-90%)22. Для целей настоящего исследования наличие полосы на 1730 см-1 было пригодно для оценки эффекта одновременного поглощения ФС и ПВА.
С помощью наноИК-спектров были выбраны волновые числа освещенности для химической визуализации шарика ПС, нанесенного на поверхность ПВА (рис. 4А-В), и шарика ПС, покрытого ПВА (рис. 4D-F). Для того, чтобы измерение амплитуды на каждом пикселе соответствовало максимальной амплитуде пика контактного резонанса15 (рис. 2C), была использована возможность отслеживания частоты контактного резонанса системы ФАПЧ. Контактный резонанс кантилевера измерялся при контакте наконечника кантилевера с ПВС и ПС для определения подходящего диапазона отслеживания частоты ФАПЧ.
Изображения NanoIR были впервые получены при длине 1600 см-1, что соответствует случаю, когда PS является преобладающим поглотителем системы (рис. 4Ai; Di)). Несмотря на то, что в обоих случаях был получен снимок шарика PS размером 5 мкм, амплитуда фототермического расширения, зарегистрированного на этой длине волны, была различной, когда наконечник находился в непосредственном контакте с шариком PS и когда наконечник соприкасался с тонким покрытием PVA поверх шарика PS. Увеличение фототеплового расширения, обнаруженное над шариком PS, было значительно меньше, когда шарик был покрыт слоем ПВА, толщина которого оценивается в ~1,8 мкм с помощью поверхностного профилографа (дополнительный рисунок 4). При используемой мощности лазера (1,47%, что соответствует ~3,4 мВт на 1600 см-1 и ~3,8 мВт на 1730 см-1) (Дополнительная таблица 1) область диаметром ~13 мкм показала небольшое увеличение амплитуды ~2 нм по сравнению с сигналом, зарегистрированным на чистом непоглощающем слое ПВА вдали от шарика PS. Пространственный след увеличения амплитуды был намного шире, чем когда шарик PS находился поверх пленки PVA (рис. 4A), где сигнал фототермического расширения был асимметричным, но оставался в пределах области шириной ~6 мкм в направлении быстрой развертки и длиной ~8 мкм в направлении медленной развертки изображения. Показания амплитуды в этой области достигали до 12,1 нм выше фототермического расширения чистого слоя ПВА. При освещении образца на глубине 1730 см-1 ПС и ПВА показали более высокую амплитуду фототеплового расширения, чем при 1600 см-1. В случае экспонированного шарика PS (рис. 4Ci) фототермическое расширение было самым высоким в верхней части валика, достигая значений до 26,5 нм. Высокая фототермическая реакция простиралась на несколько микрометров за пределы следа, наблюдаемого на рисунке 4Ai. ПВА также расширялся за счет возбуждения, но с меньшей амплитудой, а именно ~7,6 нм, зарегистрированным вдали от шарика PS. Было отмечено, что реакция была стабильно самой сильной на левой стороне шарика PS. Для встроенного шарика (рис. 4F) сигнал был более симметричным, но амплитуда фототеплового расширения над шариком PS была всего на ~2,3 нм выше, чем у PVA. Для этого была зарегистрирована постоянная фототепловая амплитуда ~13,6 нм в пределах 10-13 мкм следа области, подверженной нагреву ПС, определенная по картографированию поверхности с помощью АСМ-зонда. В случае измерений, проведенных на 1620 см-1, сигнал не был обнаружен, что согласуется с отсутствием заметной полосы ИК-поглощения для PS и PVA в этой области спектра.
Затем наноИК-спектры, собранные поверх покрытого шариком PS, сравнивали с ПВА (рис. 5A). Сигнал PS на расстоянии 1600 см-1 был значительно ниже, чем в случае с открытой бусиной. Несмотря на низкий вклад полосы, дальнейший анализ сигналов подтвердил, что увеличение мощности лазера привело к более высокому соотношению I1600/I1730 (рис. 5B,C). Результаты показали, что более высокая мощность лазера соответствует большей глубине проникновения, как показано на рисунке 5B. Это, в свою очередь, влияет на наноИК-изображение, собранное при разной мощности лазера. При более высокой мощности ~20 мВт фототермическая амплитуда материала неизменно демонстрировала меньшую амплитуду, чем при более низких мощностях лазера. Кроме того, уровень шума в спектрах увеличился, что указывает на некоторую нестабильность в материале, вероятно, из-за повышения температуры в полимере.
Рисунок 1: Осаждение бисера ПС. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) изображения 5 мкм гранулы PS (A) на нетронутой кремниевой подложке, (B) поверх пленки PVA и (C) покрытой PVA. Масштабная линейка = 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схемы, иллюстрирующие принцип наноИК-визуализации и спектроскопии. (A) ИК-импульсный лазер выравнивается и фокусируется на точке контакта металлического кантилевера АСМ с образцом. Кантилевер измеряет фототермическую реакцию материала, возникающую в результате поглощения ИК-излучения. Слой золота с обеих сторон используется для уменьшения фототеплового и акустического вклада кантилевера во время измерения, который мог бы мешать наноИК-измерению образца. (B) Сигнал позиционно-чувствительного детектора, контролирующего отклонение кантилевера во временной области [S(t)] и частотной областях [S(ω)]. Режимы контактного резонанса кантилевера определяются измерениями синхронного усилителя. Второй контактный резонанс используется для отслеживания ФАПЧ во время визуализации. Измеряется амплитуда моды контактного резонанса Acr2 . (C) Спектр наноИК, полученный путем мониторинга изменения амплитуды Acr2 в зависимости от волнового числа освещенности. НаноИК-изображение было получено путем наблюдения за изменением амплитуды Acr2 в зависимости от положения зонда на образце. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: ИК-спектры ФС и ПВА. (А) ИК-Фурье спектр ПС. Красным прямоугольником обозначен диапазон спектра, изучаемого с помощью наноИК-спектроскопии. Соответствующий спектр nanoIR PS представлен на врезке. (Б) ИК-Фурье спектр ПВА. Красным прямоугольником обозначен диапазон спектра, изучаемого с помощью наноИК-спектроскопии. Соответствующий спектр наноИК ПВА представлен на врезке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: НаноИК-визуализация. Шарик ПС (А-С) нанесен на поверхность ПВА и (D-F) погружен в ПВА, как показано на врезках. НаноИК-карты, полученные на (A i,Di) 1,600 см-1, (B i,Ei) 1,620 см-1 и (C i,Fi) 1,730 см-1, накладываются на 3D-топографическую карту. Соответствующие профили топографии и наноИК, выделенные вдоль белой пунктирной линии, представлены на соответствующих графиках (ii). Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Спектр наноИК, собранный зондом АСМ в контакте с шариком PS, покрытым ПВА. (A) Спектры наноИК, собранные при p1 = 1,47%, p2 = 2,48%, p3 = 5,20% и p4 = 11% мощности лазера. Мощность лазера изменяется в зависимости от длины волны, которая корректируется с помощью ослабленной коррекции фона в каждом случае. (B) Схемы, иллюстрирующие влияние мощности лазера на мощность собираемых сигналов. (C) Отношение I1600/I1730 в зависимости от мощности лазера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Калибровка консоли nanoIR. (A) Кривая зависимости отклонения от расстояния, полученная на сапфировой подложке. Наклон кривой втягивания обеспечивает чувствительность кантилевера к прогибу, используемую для расчета постоянной пружины. (B) Резонансная частота кантилевера, определяемая тепловой настройкой, используемой для расчета постоянной пружины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 2: След ИК-лазера. Амплитуда колебаний кантилевера, контактирующего с поверхностью образца, регистрируется как функция положения ИК-лазера. Юстировка ИК-лазера изменяется с помощью движущегося зеркала. Положение зеркала устанавливается таким образом, чтобы центр фокального объема (красная область) совпадал с положением кантилевера (центр белого креста). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Выходная мощность лазера (в мВт) в зависимости от волнового числа. Выходная мощность QCL-лазера определяется с помощью стандартного ИК-детектора от 1,530 см-1 до 1,800 см-1 с шагом 2 см-1 при частоте импульса, соответствующей настройке, используемой для наноИК-измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Измерения толщины ПВС, полученные методом лазерной конфокальной поверхностной профилометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 1: Мощность лазера в милливаттах для каждого волнового числа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
АСМ в сочетании с наноИК-спектроскопией может предоставлять наноразмерную химическую информацию с помощью кантилевера в контактном режиме и импульсного перестраиваемого ИК-источника света. Модельные системы, такие как встраивание абсорбера с конечными размерами в объем полимерного материала, важны для улучшения понимания механизмов формирования изображения и определения производительности инструмента. В случае представленной здесь конфигурации PS/PVA была проведена оптимизация для получения стабильного валика PS, расположенного над или под поверхностью пленки PVA. Было обнаружено, что нанесение гранул PS сразу после удаления покрытой кремниевой подложки из установки для нанесения покрытий привело к лучшей адгезии. Вязкость слоя ПВА может повлиять на положение валика по отношению к поверхности пленки ПВА. Нагревание образца в течение примерно 15 мин при ~200 °C позволило глубже имплантировать шарики.
Благодаря размеру шариков PS (в данном случае 5 мкм) возможно быстрое выравнивание кончика кантилевера с центром валика с помощью оптического микроскопа, встроенного в систему nanoIR. В то время как гранулы PS и микропузырьки в ПВА трудно дифференцировать оптически, наноИК-анализ может подтвердить состав образца. В то время как вклад ИК-диапазона на 1600 см-1 может быть слабым, когда шарик PS покрыт другим полимером, как отмечено на рисунке 5, высокая мощность лазера может увеличить вклад PS на 1600 см-1 в отпечатке пальца nanoIR, собранном непосредственно над ним, при этом кантилевер контактирует с наложением PVA. Ожидается, что шарики PS меньшего диаметра будет труднее обнаружить с помощью оптической микроскопии, и они будут вносить более низкий сигнал в спектр наноИК. В этом случае следует рассмотреть возможность проведения АСМ-визуализации и наноИК-измерений гранул полистирола перед нанесением верхнего слоя ПВА, а также маркировку образца, чтобы убедиться, что расположение встроенных гранул ПС известно. Несмотря на эти предполагаемые проблемы, преимущество такого подхода к подготовке модельных систем заключается в том, что он дешев и легко доступен. Профиль топографии валика может быть использован для оценки положения валика, хотя для оценки диаметра изображенного элемента следует принимать во внимание так называемый эффект наконечника.
Что касается сбора и анализа данных, то данные, полученные с помощью nanoIR в этом исследовании, выявили несколько неожиданных нестабильности взаимодействия зонда и образца при использовании более мягкого кантилевера nanoIR и при увеличении мощности лазера. НаноИК-изображения, полученные с помощью более мягкого кантилевера (k < 0,4 Н/м), были постоянно нестабильны вблизи шарика PS, возбуждаемого ИК-светом, несмотря на стабильное топографическое изображение. НаноИК-спектры ФС и ПВА, зарегистрированные в этом исследовании, хорошо согласуются с широко распространенными ИК-Фурье спектрами соответствующих объемных полимеров21,22. Две различные полосы поглощения при 1600 см-1 (только PS) и 1730 см-1 (PS и PVA) позволяют сравнить эффект возбуждения поглотителя одного шарика под поверхностью. Изображения nanoIR, представленные на рисунке 4, показывают, что сигнал в непосредственной близости от шарика является сильным, когда шарик PS экспонирован, но значительно уменьшается, когда валик покрывается тонкой пленкой PVA. Тем не менее, результаты показывают, что шарик более чем на 1 мкм ниже поверхности может быть обнаружен в наноИК-карте, как при возбуждении системы на 1600 см-1, так и на 1730 см-1. Амплитуда, регистрируемая кантилевером, в обоих случаях увеличивается на ~2 нм непосредственно над валиком на карте. Несмотря на низкую амплитуду, площадь этого расширения составляет около 13 мкм в ширину для возбуждения 1600 см-1, что намного больше, чем диаметр шарика, что подтверждает, что тепло диффундирует от поглотителя PS к PVA. Это джоульное расширение может влиять на пространственное разрешение наноИК на гетерогенных материалах, причем более сильный эффект ожидается, если поглотитель находится ближе к поверхности. Больший отклик образца на 1730 см-1 согласуется со спектрами наноИК, представленными на рисунке 5, показывая, что вклад полосы на 1600 см-1 намного слабее, чем на 1730 см-1.
Существующий подход имеет некоторые ограничения. Размещение бусин под поверхностью ПВА с ограничением топографической выпуклости на поверхности модельной системы остается недостижимым. На самом деле, для этого может потребоваться такое толстое покрытие, что шарик может стать необнаруживаемым с точки зрения наноИК-спектроскопии. Глубину валика трудно контролировать и характеризовать, что затрудняет предоставление достаточной информации для моделирования для точного представления модельной системы. Для получения более полной картины влияния размера и глубины подповерхностного поглотителя на наноИК-сигнал, измеренный на поверхности, потребовалось бы с большей точностью изменять размеры и положение шарика. Кроме того, вполне вероятно, что в реальной сложной системе несколько подповерхностных поглотителей с разными размерами, положениями и составом будут мешать измерениям, что не описано в данной модели.
Тем не менее, измерения подтверждают, что генерация сигналов на мультиполимерных образцах для определения характеристик наноИК позволяет многому научиться. Дальнейшая оптимизация протокола пробоподготовки должна быть проведена для контролируемого изменения глубины, на которой заделывается шарик PS, чтобы обеспечить более полный анализ того, как подповерхностный поглотитель влияет на фототепловое расширение на поверхности ПВС. Комбинацию полимеров, используемых для измерений, также можно варьировать для определения роли теплопроводности, теплового расширения и механических свойств в производительности наноИК-измерений для гетерогенных материалов. Это многообещающий подход к лучшему пониманию поведения образца для наноИК-спектроскопии и визуализации, который, как ожидается, будет способствовать дальнейшему количественному определению глубины проникновения, пространственного разрешения и чувствительности инструмента. Это особенно важно с учетом появления новых режимов визуализации, таких как многочастотный nanoIR15,23, для которых природа информации и влияние параметров срабатывания на производительность инструментов остаются недостаточно изученными. Для углубления понимания собранных данных крайне важно сочетать экспериментальный подход с мультифизическим моделированием24. Учет встроенных элементов разных размеров и изменение их положения под поверхностью будет иметь решающее значение для разработки более полной модели. Это, в свою очередь, продвинет область наноИК-спектроскопии к приложениям реальных гетерогенных и трехмерных материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда (NSF CHE-1847830).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10|0 2200 Golden Taklon Round | Zem | ||
| 5357-8NM Tweezers | Pelco | ||
| Adhesive Tabs | Ted Pella | 16079 | |
| AFM metal specimen disks | Ted Pella | 16208 | |
| Binocular | AmScope | ||
| Cantilever for nanoIR measurements | AppNano | FORTGG | |
| Cell culture dishes | Greiner bio-one GmbH | ||
| Desiccator | |||
| Floating optical table | Newport | RS 4000 | |
| Hotplate | VWR | ||
| Isopropanol | |||
| Kimwipes | KIMTECH | ||
| Magnetic stir bar | |||
| Microparticles based on polystyrene size: 5 µm | SIGMA-ALDRICH | 79633 | |
| nanoIR2 microscope | Bruker | Contact mode NanoIR2 | |
| Nitrogen Tank | Airgas | ||
| Petri dishes | Greiner bio-one GmbH | ||
| Polyvinyl Alcohol | SIGMA-ALDRICH | 363170 | this polymer was only 87%-89% hydrolyzed, which explains the presence of residual C=O at 1730 cm-1 |
| Quantum Cascade Laser | Daylight Solutions | 1550-1800 cm-1 range | |
| Silicon wafer | MEMC St. Peters | #901319343000 | |
| Spin coater | Oscilla |
References
- Dufrêne, Y. F., Viljoen, A., Mignolet, J., Mathelié-Guinlet, M. AFM in cellular and molecular microbiology. Cellular Microbiology. 23 (7), e13324 (2021).
- Sharma, A., Rout, C. S. Probe-based techniques for 2D layered materials. Advanced Analytical Techniques for Characterization of 2D Materials. , AIP Publishing. Melville, New York. 1-14 (2022).
- Zhong, J., Yan, J. Seeing is believing: atomic force microscopy imaging for nanomaterial research. RSC Advances. 6 (2), 1103-1121 (2016).
- Olubowale, O. H., et al. 34;May the force be with you!" Force-volume mapping with atomic force microscopy. ACS Omega. 6 (40), 25860-25875 (2021).
- Dokukin, M. E., Sokolov, I. Quantitative mapping of the elastic modulus of soft materials with HarmoniX and PeakForce QNM AFM modes. Langmuir. 28 (46), 16060-16071 (2012).
- Nguyen-Tri, P., et al. Recent applications of advanced atomic force microscopy in polymer science: a review. Polymers. 12 (5), 1142 (2020).
- Vitry, P., et al. Mode-synthesizing atomic force microscopy for 3D reconstruction of embedded low-density dielectric nanostructures. Nano Research. 8 (7), 2199-2205 (2015).
- Coste, R., Pernes, M., Tetard, L., Molinari, M., Chabbert, B. Effect of the interplay of composition and environmental humidity on the nanomechanical properties of hemp fibers. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 8 (16), 6381-6390 (2020).
- Schönherr, H., Feng, C. L., Tomczak, N., Vancso, G. J. Compositional mapping of polymer surfaces by chemical force microscopy down to the nanometer scale: reactions in block copolymer microdomains. Macromolecular Symposia. 230 (1), Weinheim. 149-157 (2005).
- Holland-Moritz, K., Siesler, H. W.
- Bhargava, R., Wang, S. Q., Koenig, J. L. FTIR microscpectrscopy of polymeric systems. Liquid Chromatography/FTIR Microspectroscopy/Microwave Assisted Synthesis. , Springer Berlin. Heidelberg Berlin. Heidelberg. 137-191 (2003).
- Rao, V. J., et al. AFM-IR and IR-SNOM for the characterization of small molecule organic semiconductors. The Journal of Physical Chemistry C. 124 (9), 5331-5344 (2020).
- Wang, H., Wang, L., Xu, X. G. Scattering-type scanning near-field optical microscopy with low-repetition-rate pulsed light source through phase-domain sampling. Nature Communications. 7 (1), 13212 (2016).
- Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).
- Mathurin, J., et al. Photothermal AFM-IR spectroscopy and imaging: Status, challenges, and trends. Journal of Applied Physics. 131 (1), 010901 (2022).
- Miller, A., et al. Enhanced surface nanoanalytics of transient biomolecular processes. Science Advances. 9 (2), 3151 (2023).
- Emin, D., et al. Small soluble α-synuclein aggregates are the toxic species in Parkinson's disease. Nature Communications. 13 (1), 5512 (2022).
- Jardine, K., Dove, A., Tetard, L. AFM force measurements to explore grain contacts with relevance for planetary materials. The Planetary Science Journal. 3 (12), 273 (2022).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Higgins, M. J., et al. Noninvasive determination of optical lever sensitivity in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013701 (2006).
- Smith, B. The infrared spectra of polymers III: hydrocarbon polymers. Spectroscopy. 36 (11), 22-25 (2021).
- Korbag, I., Mohamed Saleh, S. Studies on the formation of intermolecular interactions and structural characterization of polyvinyl alcohol/lignin film. International Journal of Environmental Studies. 73 (2), 226-235 (2016).
- Tetard, L., Passian, A., Farahi, R. H., Thundat, T., Davison, B. H.
- Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Science Advances. 7 (20), (2021).
