Summary
Bis-3-クロロピペリジン(B-CeP)は、 in vitroでDNAテンプレート中のG-四重鎖構造を同定および特性評価するための有用な化学プローブです。このプロトコルはB-CePsの調査の反作用を行い、高リゾリューションのポリアクリルアミドのゲルの電気泳動によって反作用生成物を解決するプロシージャを詳述する。
Abstract
G-四重鎖(G4)は、遺伝子発現や疾患において重要な役割を果たす生物学的に関連性のある非標準的なDNA構造であり、重要な治療標的となります。潜在的なG四重鎖形成配列(PQS)内のDNAの in vitro 特性評価には、アクセス可能な方法が必要です。B-CePは、核酸の高次構造を調べるための有用な化学プローブであることが証明されているアルキル化剤の一種です。この論文では、B-CePとグアニンの N7との特異的な反応性を利用した新しいケミカルマッピングアッセイと、それに続くアルキル化Gsでの直接鎖切断について説明します。
すなわち、G4フォールドとアンフォールドDNAの形態を区別するために、B-CeP 1を用いて、G4配列を仮定できる15-merのDNAであるトロンビン結合アプタマー(TBA)をプローブします。B-CeP応答グアニンとB-CeP1の反応により、高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により、アルキル化グアニンの個々のアルキル化付加物およびDNA鎖切断の位置を特定することにより、一塩基レベルで分離できる生成物が得られます。B-CePを用いたマッピングは、G-四重鎖形成DNA配列の in vitro 特性評価のためのシンプルで強力なツールであり、G-テトラッドの形成に関与するグアニンの正確な位置を特定することができます。
Introduction
核酸は、典型的なワトソン・クリック二重らせんに加えて、グアニンに富む配列により、代替のG-四重鎖(G4)型など、さまざまな二次構造を採用することができます。G4構造は、4つのグアニンがフーグステン水素結合を介して相互作用するG-テトラッドと呼ばれる平面四量体の形成に基づいています。G-テトラッドは、グアニンコアの中心に配位した一価の陽イオンによって積み重ねられ、さらに安定化されます(図1)1。
図1:G-四重構造の模式図 。 (A)G-テトラッドの模式図。平面アレイは、フーグスティーン塩基対形成と中心陽イオン(M+)によって安定化されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
少なくとも2つの連続したグアニンヌクレオチドが4回以上ランされた配列は、G-四重鎖構造で折りたたまれる可能性のあるG-四重鎖形成配列(PQS)です。PQSは、テロメア、遺伝子プロモーター、リボソームDNA、組換え部位など、さまざまな細胞環境にあり、多くの生物学的プロセスの制御に関与しています2。したがって、ヒトゲノム中のG4の同定と実験的検証は、現在、主に計算ツールによって行われており、生物学的に重要な問題です3。計算による予測をサポートしたり、予測不可能なG4構造を検出したりするために、DNAテンプレート中のG4形成を同定するためのケミカルマッピングに基づくアクセス可能な方法がここに示されており、G-tetrad構造を形成するグアニンの正確な同定が可能です。
報告されたケミカルマッピングアッセイは、G4構造の形成に続くビス-3-クロロピペリジン(B-CeP)とグアニンとの異なる反応性を利用しています。B-CePは求核剤4,5,6,7,8,9との反応性が高いため、グアニンヌクレオチドのN7位と非常に効率的に反応する能力を持つ核酸アルキル化剤である10。アルキル化に続いて、一本鎖および二本鎖DNAコンストラクトの脱品と鎖切断が行われます。それどころか、G4配列におけるG-テトラッドの形成に関与するグアニンは、グアニンのN7位がフーグスティーン水素結合に関与しているため、B-CePアルキル化の影響を受けません。このB-CePの特異的な反応性により、G4構造の検出だけでなく、一本鎖および二本鎖DNA中のグアニンと比較してアルキル化からの相対的な保護から推定できるため、テトラドを形成するグアニンの同定も可能になります。
ここでは、カリウム陽イオンの存在下でG4配列を仮定できる15-mer DNAであるトロンビン結合アプタマー(TBA)の特性評価のプローブとして、B-CeP 1(図2A)を用いてケミカルマッピングプロトコルを報告しています11,12。TBA(G4-TBA)のG4配列は、2つのコントロール、すなわち一本鎖型のTBA(ssTBA)と、その相補的な配列にアニーリングされて二本鎖コンストラクト(dsTBA)を形成するTBAと直接比較されます(表1)。プロービング反応の生成物は、高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって、アルキル化グアニンの個々のアルキル化付加物とDNA鎖切断の位置を特定することにより、一塩基レベルで分離されます。ゲル上での可視化は、TBAオリゴヌクレオチドと3'末端に蛍光色素を結合させることで可能になります(表1)。このプロトコルは異なった構造(G4および対照)のTBAを折る方法、およびB-CePsとそれに続くPAGEの探る反作用を行う方法を示す。
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Protocol
1. 核酸および化学プローブの調製
- 核酸
注:「TBA」と名付けられたオリゴヌクレオチドは、15 mer の DNA 配列 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' で、3' 末端に蛍光色素の 5-カルボキシフルオレセイン(FAM)で標識され、ゲル上での可視化を可能にします。非標識オリゴヌクレオチド「cTBA」は、そのDNA相補的配列5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'です。 表1に示すように、TBAおよびcTBAは、3つの異なる構造を得るために採用される。- オートクレーブチップと0.5mLチューブは、滅菌済みの使い捨て製品を入手し、汚染を防ぎます。
- 各オリゴヌクレオチドを超純水に可溶化して最終濃度100μMになるようにストック溶液を調製します。 メーカーが提供する260 nmの吸光係数を使用して、紫外可視(UV-Vis)分光光度計で正確なオリゴヌクレオチド濃度を決定します。
注:消光係数:TBAとcTBAには、それぞれ164,300 M-1 cm-1と138,600 M-1 cm-1を使用しました。 - TBAおよびcTBAストック溶液は-20°Cで保管してください(これらの条件で数ヶ月間)。
- 化合物B-CeP1
注:化合物B-CeP1は、以前に報告されたように合成されます6。- B-CeP 1 原液を ~10 mM で調製します。ヒュームフード内の分析天びんを使用して凍結乾燥化合物~1 mgを秤量し、100%ジメチルスルホキシド(DMSO)に可溶化します。
- 実際の化合物量とDMSO(d = 1.1 g/cm3)に基づいて、正確な化合物濃度を計算します。
注:コンパウンドは常に手袋を着用して取り扱ってください(凍結乾燥時とDMSOに溶解時の両方)13,14。
表1:このプロトコルで使用されるオリゴヌクレオチド構造。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
2. 核酸コンストラクトのフォールディング
- 緩衝液の調製
- BPE緩衝液(重リン酸-エチレンジアミン四酢酸[EDTA]、5x:2mMNaH2PO 4、6 mM Na 2 HPO 4、1 mMNa2EDTA、pH7.4)および超純水中の500 mM KClの溶液を調製する。孔径0.22μmのフィルターで溶液をろ過します。
注意: 最良の結果を得るには、新しく調製した溶液を使用してください。BPEバッファーは、4°Cで最大15日間保存できます。
- BPE緩衝液(重リン酸-エチレンジアミン四酢酸[EDTA]、5x:2mMNaH2PO 4、6 mM Na 2 HPO 4、1 mMNa2EDTA、pH7.4)および超純水中の500 mM KClの溶液を調製する。孔径0.22μmのフィルターで溶液をろ過します。
- 熱リフォールディング法によるG4-TBA、ssTBA、dsTBA試料のフォールディング
注:カリウムカチオンは、G4構造(G4-TBA)を折りたたむために必要です。コントロールssTBAおよびdsTBAの折り畳み溶液にカリウムカチオンを添加しないでください。- 1x BPEおよび100 mM KClに4 μMのG4-TBA溶液を調製し、チューブを95°Cで5分間加熱してオリゴヌクレオチドG4-TBA溶液を変性させ、ゆっくりと室温(RT)まで冷却してTBAをG-四重鎖に折りたたむようにします。
- 4 μM の ssTBA 溶液 40 μL を 1x BPE で調製します。ステップ2.2.1で説明したように、熱再折り手順を実行して、TBAを一本鎖の形で折ります。
- 等モル量のTBAとcTBAを1x BPEで混合して、40 μLのdsTBA溶液を調製します。TBAが相補的配列cTBAにアニーリングし、TBAの二本鎖形態を形成するために、上記のように熱リフォールディング手順(ステップ2.2.1)を実行します。
注:各フォールディング溶液の最終容量は、各サンプルに 5 μL の 4 μM 溶液が必要であることを考慮して、プロービング反応のサンプル数に基づいています。ピペッティングエラーを避けるために、各溶液を少し多めに準備します。
3. プロービング反応
注:プロービング反応は、熱リフォールディング手順の直後に行う必要があります。
- G4-TBA、ssTBA、dsTBAのフォールディング溶液がRTまで冷却されたら、ショートスピン遠心分離(7,000 × g 、室温で5-8秒)を行い、プロービング反応を開始します。
- 21本の空の0.5 mLオートクレーブチューブを準備します。 表 2 に報告されているように、ラボサンプル用にそれぞれ 7 本のチューブを 3 セットラックにまとめます。
注:各列セットは、G4-TBA、ssTBA、およびdsTBAの3つの異なるTBA折り畳み条件に対応しています。各行は、3つの異なるインキュベーション時間に対応しています。カラム内の各細胞は、最終的なB-CeP 1プローブ濃度に対応します(表2)。チューブにはっきりとラベルを付けてください。 - 各チューブに3μLの超純水を加えます。
- 折りたたんだG4-TBAを5μL、1セット目の各チューブに加えます(ステップ3.2)。2セット目の各チューブに5μLの折りたたんだssTBAを加えます。3セット目の各チューブに折りたたんだdsTBAを5μL加えます。
- B-CeP 1原液を超純水で250 μMおよび25 μMに希釈します。
注:B-CeP 1ケミカルプローブの希釈液は、水との競合反応を避けるために、新たに調製し、直ちにDNA基質と反応させる必要があります。 - 適切な B-CeP 1 希釈液 2 μL(25 μM および 250 μM)をサンプルに加えます。3 つのコントロールサンプル (C) 中の化合物を超純水に置き換えて、化合物の非存在下で異なる折り畳みの TBA を分析します。すべてのサンプルを37°Cでインキュベートします。
- 1時間、4時間、15時間のインキュベーション後、次のステップまでチューブを-20°Cに置いて反応を停止します。
注:サンプルはこれらの条件で数日間保管できます。 - サンプルを真空遠心分離機で乾燥させます。
注:乾燥したサンプルは、PAGE分析に進む前に、-20°Cで数週間保存できます。
表2:プロービング反応のサンプル(構造、プローブ濃度、インキュベーション時間)。 各列セットは、3つの異なるTBAフォールディング条件(G4-TBA、ssTBA、およびdsTBA)に対応しています。各行は、3つの異なるインキュベーション時間(1、4、15時間)に対応しています。カラム内の各細胞は、最終的なB-CeP 1プローブ濃度(5または50μM)に対応します。各セットのコントロール(C)は、化合物の非存在下でより長い時間(15時間)インキュベートした、異なる折り畳みのTBAのサンプルに対応する。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
4. 高解像度PAGE
- 変性ポリアクリルアミド溶液の調製
注:事前に500 mLの20%変性ポリアクリルアミドゲル溶液を調製してください。この溶液の約 80 mL を各実験に使用します。琥珀色のガラス瓶を使用するか、ガラス瓶をアルミホイルで覆って、溶液をRTで保存します。
注意:ポリアクリルアミドは神経毒性があります。ゲルの準備と注入のすべての段階で、手袋と白衣を着用してください。重合したアクリルアミドは、汚染された物質に適した箱に廃棄してください。- 1Lビーカーに尿素210gを計量します。250 mL の 40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド(19/1)溶液と 50 mL の 10x TBE(890 mM Tris-HCl、890 mM ホウ酸塩、20 mM EDTA、pH 8)を加えます。
- ビーカーを攪拌プレートに置き、攪拌棒で溶液を混合します。ミキシング中は、飛沫や汚染を防ぐために、ビーカーをアルミホイルで覆ってください。
- 尿素が完全に溶解し、溶液が透明になるまで溶液を混合します。
注: この手順には何時間もかかる場合があります。尿素の溶解を促進するために、所望の最終容量を超えずに少量の水を加えます。 - 攪拌棒を取り外します。溶液をシリンダーに注ぎ、500 mLの正確な最終容量まで水を加えます。
- ゲル装置の設置
- 2枚のプレート(1枚はノッチ付き、もう1枚はノッチなし)を70%エタノールで洗浄し、乾燥させてから、プレートをジメチルジクロロシラン溶液で処理します。
注:シラン化はスキップできますが、ゲルサンドイッチを分解するときにプレートの1つからゲルを放出するのに役立ちます。
注意:シラン化溶液は手袋で取り扱い、ドラフト内でこの溶液でプレート処理を行ってください。 - 0.4mmのスペーサーを長い方のプレートの長い方の端に沿って置き、短いプレートをもう片方のプレートの上に置き、2つのプレートを下部に合わせます。
- 紙テープを上面以外のすべての端に沿って何層にも重ねます。
- 鋳造中の漏れを防ぐために、ゲルの底にテープの層を追加します。
- サプライヤーの指示に従って、ガラスサンドイッチの側面を清潔なクランプでクリップします(サプライヤーによって、使用する装置、サンドイッチクランプ、およびガスケットがわずかに異なります)。
- 2枚のプレート(1枚はノッチ付き、もう1枚はノッチなし)を70%エタノールで洗浄し、乾燥させてから、プレートをジメチルジクロロシラン溶液で処理します。
- ゲルを注ぐ
注:ポリアクリルアミド重合は温度に敏感であるため、ゲルを室温(25°C)で注いでください。- 使用直前に、ビーカーに、あらかじめ調製した変性ポリアクリルアミド溶液80 mL(ステップ4.1)、10% m/V過硫酸アンモニウム(APS)溶液450 μL、テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)45 μLを注ぎます。
- 溶液を混合し、50 mLのシリンジを使用してガラスプレートの間にすばやく注ぎます。気泡を避けながら、ガラス板の間に必要な数のウェルで櫛を導入します。必要に応じて、ゲル溶液を加えてサンドイッチを完全に満たします。コームに4つのクランプを配置して押し下げ、ウェルを均等に分配できるようにします。
- ゲルを少なくとも45分間重合させます。
- ゲルのランニング
- 重合後、クランプと紙テープの層をすべて取り除きます。櫛をゆっくりと取り外し、蒸留水で井戸を徹底的にすすいでください。
- 特定のサプライヤーの指示に従って、ゲルサンドイッチを垂直ゲル電気泳動装置に正しく配置します。
- TBEランニングバッファー(1x:89 mM Tris-HCl、89 mM ホウ酸塩、2 mM EDTA、pH 8)を脱イオン水で調製し、上部と下部の両方のリザーバーにバッファーを充填します。
- 50 Wで少なくとも30分間、ゲル電気泳動のプレランを実行して、プレートをウォームアップします。
- 超純水に変性ゲルローディングバッファー(DGLB:1 M Tris-HCl、80%ホルムアミド、50%グリセロール、0.05%ブロモフェノールブルー)を調製します。
注:GLBは、オリゴヌクレオチドサンプルのゲルシステムへの移動を追跡し、サンプルをゲルのウェルにロードすることができます。変性剤ホルムアミドの存在により、非変性PAGEでも、サイズに応じてDNA種を分離することができます。 - 乾燥したサンプル(ステップ 3.8 のサンプル)を 5 μL の DGLB に再懸濁します。
- サンプルをロードする前に、上部バッファーチャンバー内の小型シリンジとTBEバッファーを使用してウェルを洗浄し、ウェルから尿素を除去します。
注意: この手順を数回繰り返してウェルを正確に洗浄し、解釈が困難なバンドを回避します。 - サンプルをクリーンウェルにロードし、ロードの順序をメモします。
- ゲル電気泳動を 50 W で 2 時間、または少なくともブロモフェノールブルー色素がゲルの 2/3 まで実行します。
- ゲルのイメージング
- 電気泳動後、電源を切り、ガラスサンドイッチを取り外し、ガラスを清掃します。
- FAM標識オリゴヌクレオチドバンドの蛍光をゲルイメージャーでスキャンして検出します。
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Representative Results
図 2 は、3 つの異なる構造に折りたたまれた TBA オリゴヌクレオチドの B-CeP 1 を使用したプロトコルに記載されているように、実施されたケミカルマッピングアッセイの代表的な結果を示しています。TBA(G4-TBA)のG-四重鎖配列は、オリゴヌクレオチドをBPE中でK+カチオンの存在下で折りたたむことによって得られたが、同じTBA配列の一本鎖型(ssTBA)はカリウム非存在下で折りたたまれた。二本鎖コンストラクト(dsTBA)は、BPEバッファー中でTBAを相補的配列にアニーリングすることによって調製しました。最終濃度 5 μM または 50 μM の B-CeP 1 を、G4-TBA(図 2B の左レーン)、ssTBA(図 2B の中央レーン)、dsTBA(図 2B の右レーン)の 2 μM サンプルと 1 時間、4 時間、15 時間反応させました。追加のコントロールは、プローブと反応しないDNAコンストラクトです。3つの異なるTBAフォールディングの円二色性(CD)分析により、それらの適切な構造が確認されました(補足図S1)。dsTBAのCDスペクトルは、実際、~260-280 nmの正の長波長帯と~245 nmの負の波長帯によって特徴付けられ15、一貫してB型のDNAヘリックスと一致していました。ssTBAはK+イオンの存在下では構造が悪いことがわかったが、G4-TBAはK+イオンの存在下では逆平行なG4に折りたたまれ、260 nmの負のバンドと290 nmの正のバンドを特徴とする15。
図 2B に報告された高分解能の PAGE 結果は、G4-TBA、ssTBA、および dsTBA に対する B-CeP 1 の時間依存性および濃度依存性反応の包括的なビューを提供し、ssTBA および dsTBA コンストラクトで観察されたものと比較して、G4-TBA のアルキル化パターンが著しく異なることを明確に示しています。未処理のサンプル(C)よりも移動度が低いバンドは、DNA基質のアルキル化と一致しています。G4-TBA基質の場合、アルキル化に利用できるグアニン(G8)が1つだけ存在するため、アルキル化付加物は1つだけがはっきりと観察されます(図2Cのグアニンの番号付け)。それどころか、基質がssTBAまたはdsTBAのいずれかである場合、複数の付加物が区別され、すべてのグアニンが自由にN7位を有することがプローブされます。より速く移動するバンドは、代わりに鎖の切断の生成物に起因します。G4-TBA基質の場合、G-四重鎖テトラッドに関与するグアニン(G1、G2、G5、G6、G10、G11、G14、G15)はアルキル化の影響を受けませんが、G8はアルキル化の次のステップとして切断の影響を受けます。ssTBAおよびdsTBAコンストラクトでは、検出された多数のバンドが示すように、すべてのグアニンは切断の影響を受けやすく、インキュベーション時間が長くなるほど強度が増します。
従ってこのプロトコルはG四重鎖のtetradsの形成にかかわるguaninesとそのような整理にかかわらないguanines間の区別を可能にし、G4TBAの構造を解明する(図2C)。
この実験の欠点として考えられるのは、反応環境中に望ましくない求核剤が存在することです。例えば、反応バッファー中の塩に由来する求核剤は、B-CePとの反応性をめぐってDNAと競合し、プローブと基質との反応が非効率的になります。図3は、求核性トリス塩基を含むトリスバッファーで行ったプロービング反応の結果を示しています。B-CeP 1(5 μMおよび50 μM)を、G4-TBA(図 3 の左レーン)、ssTBA(図 3 の中央レーン)、dsTBA(図 3 の右レーン)の 2 μM サンプルと 1 時間、4 時間、15 時間、24 時間反応させます。これらの条件では、3つのDNA基質すべてに対するプローブの反応性が明らかに低下します。G4-TBAサンプルでは、鎖の切断を検出せずに付加体の形成のみを観察できます。ssTBAおよびdsTBAの場合、24時間後にのみ、図2Bの15時間のインキュベーション後に観察されたDNA断片化に匹敵します。B-CePとトリスの望ましくない競合反応性は、核酸構造情報の欠如につながります。
図2:BPE緩衝液中のB-CeP 1によるTBA G-四重鎖構造の化学マッピング。 (A)B-CeP1の化学構造。(B)BPE緩衝液中のB-CeP1とTBAの間のプロービング反応の時間と濃度の依存性。TBA のアリコートを 3 つの異なる条件で折りたたんで、G-四重鎖配列(G4-TBA)、一本鎖オリゴヌクレオチド(ssTBA)、および相補配列にアニーリングして二本鎖コンストラクト(dsTBA)を形成しました。TBA オリゴヌクレオチドを 3' 末端を蛍光色素(FAM)で標識し、ゲル系で可視化できるようにしました。G4-TBA、ssTBA、およびdsTBAのアリコート(2 μM)をBPEバッファー中で最終濃度5または50 μMのB-CeP 1で処理し、37°Cで指示された時間インキュベートしました。プロービング反応の結果は、高分解能変性PAGE(20%ポリアクリルアミド[PAA]、7 M尿素、1x TBE)で分析しました。「C」は、各TBAコンストラクトのコントロールサンプルを示す。(C)G4-TBAのG-四重鎖配列とTBA配列におけるグアニンの番号付けの図。G4構造に関与していなかった唯一のグアニンは、B-CeP 1と反応し、赤色で強調表示されています。緑色の星は蛍光色素FAMを表します。 略語:TBA =トロンビン結合アプタマー;B-CeP 1 = ビス-3-クロロピペリジン1;BPE = 二リン酸 - EDTA;G =グアニン;G4 =グアニン四重鎖;ss = 一本鎖;ds = 二本鎖;FAM = 5-カルボキシフルオレセイン;PAA = ポリアクリルアミド;PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動;TBE = トリス - ホウ酸塩 - EDTA。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:トリスバッファーの存在下での非効率的なケミカルマッピング。 トリス緩衝液中でのB-CeP1とTBAのプロービング反応の時間および濃度依存性。TBA のアリコートを 3 つの異なる条件で折りたたんで、G-四重鎖配列(G4-TBA)、一本鎖オリゴヌクレオチド(ssTBA)、および相補配列にアニーリングして二本鎖コンストラクト(dsTBA)を形成しました。TBAオリゴヌクレオチドは、3'末端を蛍光色素(FAM)で標識し、ゲル系で可視化できるようにしました。G4-TBA、ssTBA、およびdsTBAのアリコート(2 μM)を、10 mM Tris-HClバッファー中で最終濃度5または50 μMのB-CeP 1で処理し、37°Cで指示時間インキュベートしました。プロービング反応の結果は、高分解能変性PAGE(20%PAA、7 M尿素、1x TBE)で分析しました。「C」は、各TBAコンストラクトのコントロールサンプルを示す。プロービング反応中にバッファーとして使用されるトリスの求核性は、シグナルの低下と構造情報の損失につながります。略語:TBA =トロンビン結合アプタマー;B-CeP 1 = ビス-3-クロロピペリジン1;BPE = 二リン酸 - EDTA;G =グアニン;G4 =グアニン四重鎖;ss = 一本鎖;ds = 二本鎖;FAM = 5-カルボキシフルオレセイン;PAA = ポリアクリルアミド;PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動;TBE = トリス - ホウ酸塩 - EDTA。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:G4-TBA、ssTBA、およびdsTBAのCDスペクトル。3つの異なる構造を適切に折り畳んだ後、CDスペクトルを25°Cで記録しました。 ~260-280 nmの正の長波長帯と~245 nmの負の波長帯を特徴とするdsTBAのCDスペクトル16は、DNAヘリックスのB型と一致しています。K+イオン非存在下では構造が不十分であることがわかったssTBAと比較して、G4-TBAはK+イオンの存在下で逆平行G4に折り畳まれ、260 nmの負のバンドと290 nmの正のバンドを特徴としています15。略語:TBA =トロンビン結合アプタマー;B-CeP 1 = ビス-3-クロロピペリジン1;BPE = 二リン酸 - EDTA;G =グアニン;G4 =グアニン四重鎖;ss = 一本鎖;ds = 二本鎖。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
G-四重鎖は、通常、グアニンに富むDNA配列内で折りたたまれる核酸二次構造であり、遺伝的制御や疾患との関連から重要な研究対象となっています。B-CePによるケミカルマッピングは、DNA G4の特性評価に有用なプロトコルであり、生理学的塩条件下でのG-テトラッドの形成に関与するグアニン塩基を同定するために使用できます。
このプロトコルで使用される化学プローブはB-CeP 1(図2A)であり、グアニン核酸塩基の N7と特異的に反応することにより、G-四重鎖テトラッドの形成に関与するグアニンと、そのような配置に関与しないグアニンを区別できます。実際、G-テトラッド中のグアニン間のフーグステン水素相互作用(図1)は、プローブとの反応を損ないます。プロービング反応の生成物は、DNA配列内のアルキル化付加物や切断部位を検出するために高度に利用されるラボアクセス可能な手順である高分解能PAGE(図2B)によって分離されます。さらに、蛍光色素で標識されたDNA配列を使用することで、放射性標識された核酸やインターカレーターによる従来の染色ステップを回避し、安全な条件で実験を行うことができます。
B-CeP 1プローブは、固体および非水溶液中で非常に安定しており、プロービング反応の実行中に発生する問題はごくわずかです。プロトコールの欠点を避けるためには、DNAと付加物を形成するために利用できる活性プローブの力価を低下させる可能性のある競合反応を避けるために、プロービング溶液中に望ましくない求核剤の存在を避けることが非常に重要です。最も一般的に使用される緩衝液はトリス塩基を含んでいるため、B-CeP 1の図3に示すように、その求核性第一級アミンは、DNA基質10のグアニンの反応性を競合するプローブ求電子中心と反応し得ることを読者に思い出していただきたい。これは、プロトコルに詳述されているように、リン酸緩衝液中でプロービング反応を実行する理論的根拠です。水7との反応を避けるために、B-CeP 1のすべての希釈液を新たに調製し、核酸基質と即座に反応させることも推奨する。
ここで説明するB-CePによるケミカルマッピングは、G4s16の初期特性評価の主流アッセイである硫酸ジメチル(DMS)フットプリントプロトコルに代わる便利な方法です。2つのプロトコルは、G4のコンフォメーションに関係なく、G4構造の形成とG4に関与するグアニンの同定という基本的に同じ情報を提供します。しかし、B-CePによるケミカルマッピングには、DMSフットプリントに関して重要な利点があり、プロトコルがシンプルです。プロービング反応の後、ここで説明するプロトコルは追加のステップを必要としませんが、DMSフットプリントはプローブとの反応後にホットピペリジンによるその後の切断を必要とし、追加のサンプル精製とバッファー交換を意味します16。B-CePを用いたプロトコールのステップ数の減少は、少量の初期DNA基質の使用を意味します。最後に、概念実証としてTBA配列を用いて本明細書に記載のB-CePによる化学マッピングは、他の任意の潜在的なG-四重鎖形成配列に適用可能な新しい実験をもたらすであろう。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、パドヴァ大学薬理科学部(PRIDJ-BIRD2019)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
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