Summary
Coulometrisk respirometri er ideel til måling af små organismers metaboliske hastighed. Når der blev korrigeret for Drosophila melanogaster i denne undersøgelse, var det målteO2-forbrug inden for det interval, der blev rapporteret for vildtype D. melanogaster ved tidligere undersøgelser. Per-fly O2 forbrug af CASK mutanter, som er mindre og mindre aktive, var signifikant lavere end vildtypen.
Abstract
Coulometrisk mikrorespirometri er en ligetil, billig metode til måling afO2-forbruget af små organismer, samtidig med at der opretholdes et stabilt miljø. Et coulometrisk mikrorespirometer består af et lufttæt kammer, hvoriO2 forbruges, og CO2 produceret af organismen fjernes af et absorberende medium. Det resulterende trykfald udløser elektrolytisk O2-produktion, og mængden afO2 produceret måles ved at registrere mængden af ladning, der bruges til at generere den. I denne undersøgelse er metoden blevet tilpasset Drosophila melanogaster testet i små grupper, med apparatets følsomhed og miljøforholdene optimeret til høj stabilitet. Mængden afO2, der forbruges af vildtypefluer i dette apparat, er i overensstemmelse med den, der er målt ved tidligere undersøgelser. Massespecifikt O2-forbrug af CASK mutanter, som er mindre og kendt for at være mindre aktive, adskilte sig ikke fra kongene kontroller. Den lille størrelse af CASK mutanter resulterede imidlertid i en signifikant reduktion iO2-forbruget pr. flue. Derfor er mikrorespirometret i stand til at måleO2-forbrug i D. melanogaster, kan skelne beskedne forskelle mellem genotyper og tilføjer et alsidigt værktøj til måling af metaboliske hastigheder.
Introduction
Evnen til at måle stofskiftet er afgørende for en fuldstændig forståelse af en organisme i dens miljømæssige kontekst. For eksempel er det nødvendigt at måle metabolisk hastighed for at forstå dens rolle i levetid1, kostens rolle i metabolisme2 eller tærsklen for hypoxisk stress3.
Der er to generelle tilgange til måling af stofskiftet4. Direkte kalorimetri måler energiforbruget direkte ved at måle varmeproduktionen. Indirekte kalorimetri måler energiproduktion på andre måder, ofte via respirometrisk måling af O2-forbrug (VO2), CO2 -produktion eller begge dele. Selvom direkte kalorimetri er blevet anvendt på små ektotermer, herunder Drosophila melanogaster5, er respirometri teknisk enklere og mere almindeligt anvendt.
Flere former for respirometri er blevet brugt med succes til at måle metabolisk hastighed i vildtype og mutant D. melanogaster og har givet indsigt i de metaboliske virkninger af temperatur6, socialt miljø 3, diæt 3,7 og neuroudviklingsforstyrrelser8. Disse falder i to klasser, som varierer betydeligt i omkostninger og kompleksitet. Manometri er den enkleste og billigste9,10, hvor fluer placeres i et forseglet kammer, der indeholder et CO2 -absorberende middel, og som via en tynd kapillær er forbundet til et væskereservoir. NårO2 forbruges og CO2 absorberes, falder trykket i kammeret, og væske trækkes ind i kapillærrøret. Kapillærets væskefyldte volumen er derfor proportional med VO2. Mere detaljerede versioner, som kompenserer for den kraft, der udøves af væsken i kapillærrøret, er også blevet brugt på D. melanogaster1. Manometri har fordelene ved at være enkel og billig, men fordi den er følsom over for tryk, kræver konstante miljøforhold. Yderligere, fordi forbrugt O2 ikke erstattes, falder partialtrykket af O2 (PO2) gradvist inde i kamrene.
Respirometri ved hjælp af gasanalyse anvendes også regelmæssigt til D. melanogaster. I dette tilfælde udtages gasser med regelmæssige mellemrum fra forseglede kamre, der indeholder fluer, og sendes til en infrarød analysator 2,6,11. Denne type apparater har de fordele, at den er tilgængelig kommercielt, er mindre følsom over for miljøforhold, og gasser opdateres under prøveudtagning, så PO2 forbliver stabil. Udstyret kan dog være dyrt og komplekst at betjene.
Et nyudviklet coulometrisk mikrorespirometer12 giver et billigt, følsomt og stabilt alternativ til eksisterende systemer. I praksis placeres en organisme i et lufttæt kammer, hvor den forbrugerO2, og den udåndede CO2 fjernes af et absorberende materiale, hvilket resulterer i et nettofald i kammertrykket. Når det indre tryk falder til en forudindstillet tærskel (ON-tærskel), ledes strøm gennem en elektrolytiskO2-generator, der returnerer trykket til en anden tærskel (OFF-tærskel), der stopper elektrolyse. Ladningsoverførsel over O2-generatoren er direkte proportional med den mængde O2, der kræves for at gentrykke kammeret og kan derfor bruges til at måle O2, der forbruges af organismen4. Metoden er meget følsom, måler V O2 præcist, og den regelmæssige udskiftning afO2 kan opretholde PO2 på et næsten konstant niveau i timer eller dage.
Det coulometriske mikrorespirometer, der anvendes i denne undersøgelse, anvender en multimodal (tryk, temperatur og fugtighed) elektronisk sensor. Sensoren betjenes af en mikrocontroller, der registrerer små trykændringer og aktiverer O2-generation, når en lavtrykstærskel er nået12. Dette apparat er samlet fra hyldedele, kan bruges med en lang række kamre og eksperimentelle miljøer og er blevet anvendt med succes til at undersøge virkningerne af kropsmasse og temperatur på billen Tenebrio molitor. I denne undersøgelse er mikrorespirometeret blevet tilpasset til at måleO2-forbruget i D. melanogaster, som har ca. 1% af massen af T. molitor. Apparatets følsomhed er blevet øget ved at reducere tærsklen for aktivering afO2-generation, og miljøstabiliteten er blevet forbedret ved at udføre eksperimenter i et temperaturstyret vandbad og ved at opretholde fugtigheden inde i kamrene på eller nær 100%.
CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) proteinet, en del af familien af membranassocierede guanylatkinaser (MAGUK), er et molekylært stillads i forskellige multiproteinkomplekser, og mutationer i CASK er forbundet med neuroudviklingsforstyrrelser hos mennesker og i D. melanogaster13,14. En levedygtig D. melanogaster-mutant, CASKΔ18, forstyrrer aktiviteten af dopaminerge neuroner15 og reducerer aktivitetsniveauet med mere end 50% sammenlignet med kongene kontroller14,16. På grund af det reducerede aktivitetsniveau af CASK mutanter og katekolaminernes rolle i reguleringen af stofskiftet17 antog vi, at deres standard metaboliske hastighed, og derforO2-forbrug, ville blive dramatisk reduceret sammenlignet med kontroller.
O2-forbruget blev målt i CASKΔ18 og deres vildtypekongenere, w(ex33). Grupper af fluer blev anbragt i respirometrikamre, O2-forbrug blev målt,O2-forbrug blev beregnet og udtrykt på både massespecifik og pr. Fluebasis. Apparatet registrerede VO2 i vildtypefluer, der var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, og det kunne skelne mellem per-flyO2-forbruget af vildtype- og CASK mutantfluer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flueopdræt og indsamling
- Oprethold fluer ved 25 °C i smalle hætteglas, der indeholder standard Drosophila-foder .
BEMÆRK: Prøvestørrelsen for hver genotype skal omfatte mindst ni replikater, der hver består af et enkelt respirometerkammer indeholdende 15-25 fluer, opstillet som beskrevet nedenfor. - Overfør fluerne hver 2-3 dage.
- Bedøv fluer med CO2, saml grupper på 15-25 hanner af hver genotype, og placer hver gruppe i friske, ugærede madhætteglas.
BEMÆRK: Mænd blev brugt til at reducere variabilitet på grund af reproduktiv status. Metoden gælder for begge køn. - Lad fluerne komme sig ved 25 °C i mindst 24 timer.
BEMÆRK: På tidspunktet for eksperimentet skal fluer være 1-4 dage gamle. Hyppigheden af indsamlinger beskrevet i trin 1.3 kan indstilles til at indsnævre fluernes aldersgruppe.
2. Opsætning og montering af respirometerkammer
- Tænd vandbadet og indstil det til den ønskede temperatur for eksperimentet.
BEMÆRK: Forsøgene nedenfor blev udført ved 25 °C med 50 ml Schlenk rør som kamre. Komponenterne samles som vist i figur 1A, 1B og 1C. - Rengør de malede glassamlinger i kamre og sensorpropper grundigt ved at sprøjte 70 % ethanol på en laboratorieserviet (ikke direkte på samlingen) og tørre støv og gammelt fedt af sensorstikket (figur 1A). Tør ethanol af med en frisk laboratorieserviet.
- Placer 1 cm stykke bomuldsrulle gennemblødt i renset vand i bunden af kammeret for at stabilisere fugtigheden.
- Tilsæt nok vand (~ 0,5 ml) til at danne en lille pool i bunden af bomuldsrullen.
- Tør alt vand, der er spildt på kammerets samling, af.
- Overfør fluerne til mærkede polypropylenrør ved hjælp af en tragt.
- Sæt røret med en bomuldsrulle.
BEMÆRK: Rør består af et 5 ml polypropylenreagensglas, trimmet til 5,5 cm i længden og perforeret med en varm kniv for at muliggøre fri udveksling af luft med forsøgskammeret. CO2 anæstesi er kendt for at forårsage metaboliske abnormiteter, så fluer overføres uden bedøvelse, hvilket kræver mere omhu for at undgå at miste fluerne.
- Sæt røret med en bomuldsrulle.
- Tilsæt et ventileret rør med fluer i hvert respirometerkammer (oven på våd bomuld).
- Fyld sodakalkpatroner (4-5 pellets pr. Rør) og læg dem på toppen af røret med fluer inde i kammeret.
BEMÆRK: Sodakalkpatroner består af 800 μL centrifugerør perforeret 4-5 gange med en boremaskine. - FyldO2-generatorer med mættet kobbersulfatopløsning (CuSO4) under niveauet for udluftningshuller
BEMÆRK:O2-generatorer består af centrifugerør med skruelåg med 4 huller boret under gevindene. Platin (Pt) og kobber (Cu) elektroder loddes til to-polet stik, indsættes i huller boret i hætten og fastgøres med epoxy. Elektrolyse afCuSO4 generererO2 , der forbruges af forsøgsorganismen. CuSO4 er giftigt for hvirvelløse dyr, undgå spild eller lækage og rengør straks. - Tilslut den fyldteO2-generator til to-polet stik på sensorstikket.
BEMÆRK: Kobberkatoden skal forbindes med controllerens negative udgang og platinanoderen til den positive ledning. Omvendte forbindelser vil medføre, at eksperimentet mislykkes. - Placer to små dabs klart silikonefedt på modsatte sider af sensorstikkets jordglassamling.
- Sæt stikket i kammeret, og drej stikket (eller kammeret) med moderat tryk for at sprede fedtet i samlingen.
- Tør overskydende fedt af med en laboratorieserviet.
- Klik Keck-klemmer af plast på samlinger for at fastgøre stik i kamre. Det samlede kammer skal ligne figur 1C.
- Gentag ovenstående trin for antallet af kamre, der bruges til dagens eksperiment.
BEMÆRK: Antallet af kamre, der kan optages, er begrænset af antallet af tilgængelige kamre, controllere og USB-indgange til computeren. For de nuværende eksperimenter blev syv kamre normalt kørt parallelt. Forsøgsfluer såsom mutanter bør matches med passende kontrol. Et kammer, der er oprettet identisk, men uden fluer, bør indgå i hvert forsøg som en kontrol for miljøvariationer. Kamre, der indeholder forskellige behandlinger (mutant, vildtype, flyveforbud), bør roteres mellem forsøgene. - Anbring samlede kamre i et stativ i vandbadet med stophaner åbne (figur 1E).
BEMÆRK: For at undgå døgnrytmevariation blev kamre placeret i badet mellem 9:30 og 9:50 for alle eksperimenter beskrevet her. - Lad stophanerne være åbne (Hold håndtaget parallelt med stophanen).
BEMÆRK: Pas på ikke at lade vand trænge ind i stophanerne. - Lad kamrene ekvilibrere med stophaner, der er åbne i ca. 30 minutter.
BEMÆRK: Mens kammeret er i ligevægt, skal du tilslutte elektronikken og konfigurere dataindsamling som beskrevet nedenfor.
3. Opsætning af controllere og computer
- Sørg for, at afbryderne, der leverer strøm tilO2-generatorerne , er i OFF-position (væk fra stikket; Figur 1D).
- Sæt hver controllerboks i en tilgængelig USB-port (Universal Serial Bus).
BEMÆRK: Konstruktion og programmering af styreenheder beskrevet andetsteds12. - Tilslut controllere til respirometerkamre ved hjælp af 6-lederkabler.
- Kontroller, at indikatorernes OLED-skærme (organiske lysdioder) (figur 1D) viser miljøparametre.
- Tænd kortvarigtO2-generatorer ved hjælp af kontakten på controlleren (figur 1D).
- Hvis den aktuelle værdi stiger fra nul til mellem 35 og 55 mA, er regulatoren og kammeret klar til eksperimenter.
- Find ud af, hvilke COM-porte der bruges af controllerne, som beskrevet nedenfor.
- Klik på Start-ikonet i Microsoft Windows.
- Klik på ikonet Indstillinger .
- Klik på Bluetooth og enheder.
- Sørg for, at controllerne og deres COM-porte vises på listen over enheder.
- Åbn PuTTY på skrivebordet, og opret en logfil for hver kanal på respirometeret som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: PuTTY er en gratis sikker shell og telnet-klient, der bruges til at overføre data til computeren via COM-porte.- Vælg COM-port til en controller ved at indtaste portnummeret i feltet "Seriel linje" (figur 2A).
- Klik på Logning.
- Vælg Udskriftsbart output i "Sessionslogning" (figur 2B).
- Klik på Gennemse under Logfilnavn.
- I den valgte mappe skal du oprette et filnavn, der indeholder beskrivende oplysninger (f.eks. dato, art, COM-portnummer).
- Klik på Gem.
- Klik på Åbn. Der åbnes et vindue, der viser kommaseparerede data, der logges (figur 2C).
- Gentag for alle andre controllere, der bruges til eksperimentet. Input til hver COM-port vises som et separat vindue (figur 2D).
4. Kørsel af eksperimenter
- Når kamrene er ekvilibreret i 30 minutter, forsegles de ved at lukke stophanerne.
- Dæk badet og kamrene med en polystyrenskumkasse for at opretholde et stabilt miljø.
- Lad det ekvilibrere i endnu en time.
- Tænd for strømmen tilO2-generatoren i hvert kammer ved hjælp af kontakten på kontrolboksen.
- NårO2-generatorerne er aktiveret, skal du sikre dig, at trykket stiger til forudindstillet OFF-tryk.
BEMÆRK: 1017 hPa, hvilket er lidt over atmosfærisk tryk, blev brugt som "OFF" -trykket i denne serie af eksperimenter. Tilbagevenden til det omgivende tryk vil indikere lækage af gas fra kamrene. Desuden tillader det, at det samme tryk anvendes på tværs af eksperimenter uanset omgivende barometrisk tryk. "ON" -trykket var 1016 hPa, hvilket betyder, at trykket kun behøvede at falde 1 hPa, førO2-generatoren blev aktiveret. Dette gav tilstrækkelig følsomhed til at måleO2-forbruget i Drosophila. Når et kammer er under tryk til indstillingen "OFF", skal strømmen falde til nul. - Lad eksperimentet køre i 3 timer eller mere.
BEMÆRK: Højere VO2 ved forhøjede temperaturer kan give mulighed for kortere eksperimenttider. Overvåg lejlighedsvis for at sikre, at udstyret fungerer, men undgå overdreven aktivitet i nærheden af kamrene, der kan påvirke temperaturstabiliteten.
5. Afslutning af eksperiment
- Sluk forO2-generatorer på alle controllere.
BEMÆRK: Gør først for at undgå at køreO2-generatorerne , mens kamrene er åbne. - Åbn stophanerne for at fjerne forseglingen af kamrene.
- Lad PuTTY-vinduerne være åbne i yderligere 5-15 minutter for at give en endelig basislinje.
- Luk PuTTY-vinduet for hver controller, og afslut optagelser.
BEMÆRK: Alle eksperimenter sluttede mellem kl. 16.50 og 17.10. - Afbryd sensorer fra kabler.
- Flyt kamre til tørrestativ.
- Fjern sensorstikkene en ad gangen fra kamrene.
- AfbrydO2-generatorerne , og læg dem i rørstativet.
- Tør fedt af sensorstikket, og opbevar det i stativet.
- Rens fedt fra kammersamlinger og fjern rør med fluer og sodakalk.
- Bedøv fluer i hvert rør med CO2, tryk på en vægtbåd og vej på en mikrovægt.
- Log vægten og antallet af fluer for hvert rør.
- Kassér fluer eller sæt dem til side til yderligere procedurer.
- Dump sodakalk fra patroner i affaldsbeholderen.
- ÅbnO2-generatoren , og kassér CuSO4-opløsningen i affaldsbeholderen.
- Skyl elektroder og rør med renset vand.
- Placer rørstativerne til tørring.
6. Analyse af data om overførsel af afgifter
- Importer data som kommasepareret tekst til et regneark, hvor hver post består af et separat regneark.
- Optag strøm- og tidsdata for hver puls påO2-generatoren . Start med den første puls, efter at kammeret var under tryk, og registrer starttidspunktet og sluttidspunktet (som rækkenumre) for hver strømpuls. Det er rækkenummeret, når strømmen går over nul (normalt til ca. 45-50 mA) til den sidste række, der er over nul.
- Opret en tabel i regnearket for at registrere følgende data:
- Den gennemsnitlige strømamplitude under pulsen: = AVERAGE([første række af puls]:[sidste række af puls]) for hver puls (fra den aktuelle kolonne).
- Pulsvarighed: ([Sidste række af puls] - [første række af puls[-en række]])/1000 for hver puls (fra tiden i millisekunder kolonne).
- Samlet eksperimenttid: [tid ved start af sidste puls] - [tid ved slutningen af første puls efter kammertryk] (fra kolonnen tid i minutter).
- Beregn derefter ladningsoverførsel (Q) for hver puls (gennemsnitlig strøm X varighed)
- Sum ladningen fra alle impulser for at beregne Total Charge (Qtot).
7. Analyse afO2-forbrug
- Opret et nyt regneark for alle data, og indtast eller beregn følgende for hvert kammer:
- Qtot (samlet gebyr)
- Muldvarpe (= Q ÷ 96485 × 4)
- mlO2 (= mol × 22413 ml/mol)
- Samlet tid (fra dataanalysen ovenfor)
- ml min-1 (= ml O2 ÷ samlet tid)
- Vægt i gram (fluer bedøvet og vejet målt efter forsøget)
- ml min-1 g-1 (= ml min-1 ÷ vægt i gram)
- ml/h/g (ovenstående × 60)
- mg/flue (= fluernes vægt ÷ antal fluer)
- μL fly-1 h-1 (= (ml min-1 × 3600) ÷ antal fluer).
- Tabulere data for hver behandling (genotype, f.eks.)
- Sammenlign behandlinger ved hjælp af ANOVA, t-test eller Mann-Whitney u-test 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Respirometerregulatorens tryk og strømudgang er vist for et kammer i et eksperiment i figur 3A. Den første lange strømpuls satte kammeret under tryk fra omgivende tryk (ca. 992 hPa) til den forudindstillede OFF-tærskel på 1017 hPa. Da fluerne forbrugt O2 og CO2 blev absorberet, faldt trykket langsomt, indtil det nåede ON-tærsklen på 1016 hPa, som aktiverede strøm gennemO2-generatoren. I det viste eksempel er den gennemsnitlige amplitude af hver puls 50,1 mA, varigheden er 16,1 s, hvilket giver en ladningsoverførsel på ca. 0,81 coulombs (C) pr. Puls. Den samlede ladningsoverførsel for dette kammer var 3,28 C over en samlet tid på 240,0 min. Ved hjælp af beregningerne beskrevet i Procedurer med masse og antal fluer (23 fluer, der vejer 14,9 mg i alt) varO2-forbruget for gruppen i dette kammer 3,19 ml h-1 g-1 eller 2,07 μL h-1 fly-1.
Udstyret kan nemt konfigureres med et minimum af træning og fungerer pålideligt i mange samlings- og nedlukningscyklusser. Ikke desto mindre skal udstyret vedligeholdes og inspiceres regelmæssigt, og forsøgsbetingelserne skal kontrolleres omhyggeligt. For eksempel kan tabet af en gastæt tætning på grund af svigt i en samling eller stophane føre til hurtige trykcyklusser og falsk høj VO2 (figur 3B). Derudover skal temperatur og fugtighed forblive stabil inde i kammeret. Hvis temperaturen eller fugtigheden falder, fortolkes det resulterende trykfald fejlagtigt som enO2, der forbruges. Omvendt vil opadgående drift i temperatur eller fugtighed modvirke trykfaldet forårsaget af O2-forbrug og kunstigt reducere eller eliminere VO2-signalet (figur 3C).
Metoden blev brugt til at teste VO2 af CASK Δ18-mutanter, som blev genereret ved upræcis udskæring af et transponerbart element fra CASK locus 14, og hvor bevægelse reduceres drastisk14,16. I wild-type w(ex33)-kontroller, genereret ved præcis excision af det transponerbare element, var det gennemsnitlige massespecifikke O2-forbrug 3,65 ± 0,24 ml·g-1·h-1 (n = 16 kamre; Figur 4A).
På trods af deres synligt reducerede bevægelse var CASKΔ18-mutanternes VO2 lidt, men ikke signifikant lavere end kontrollernes (gennemsnit ± s.e.m. = 3,23 ± 0,13 ml·g-1·h-1; n = 11 grupper; P = 0,08 Mann-Whitney u-test).
Fordi validiteten af at udtrykke metabolisk hastighed i form af kropsmasse er blevet stillet spørgsmålstegn ved18, blevO2-forbruget også analyseret pr. Fly (figur 4B). Ved hjælp af denne analyse blev VO2 signifikant reduceret i CASKΔ18 sammenlignet med vildtypekontroller (ex33: 2,22 ± 0,13 μL·fly-1·h-1; CASKΔ18: 1,58 ± 0,10 μL·fly-1·h-1; P = 0,0003, Mann-Whitney u-test). Den gennemsnitlige masse af CASKΔ18-fluer var imidlertid >20% lavere end for ex33-kontroller (figur 4C; ex33 0,61 ± 0,01 mg; CASKΔ18 0,51± 0,02 mg; P = 0,0005, Mann-Whitney u-test), så forskellen i metabolisk hastighed mellem genotyper skyldes sandsynligvis forskellen i deres størrelser.
Figur 1: Opsætning af respirometer . (A) Diagram over sensorstik (ovenfor) og 50 ml kammer (bestående af et 50 ml Schlenk-rør nedenfor) før montering. Bemærk placeringen af de 19/22 slebne glassamlinger, der forbinder kammeret og sensorstikket, og som skal rengøres før hvert eksperiment. Stophanen, som er nødvendig for at åbne eller forsegle kammeret, er også angivet. (B) Diagram over kammer og komponenter, samlet og klar til forsøget, der viser: våd bomuldsrulle, polypropylenrør indeholdende fluer, tilsluttet en bomuldsprop, sodakalkpatron ogO2-generator fyldt medCuSO4. (C) Foto af det samlede kammer. Keck-klemmen, der fastgør stikket til kammeret, skjules delvist af ringstativklemmen, der holder kammeret. (D) Fotografi af controller, der viser afbryderens styrestrøm gennemO2-generatoren og vinduet til visning af OLED-display. E) Samlede kamre i vandbad. Syv kamre er vist, med tre indeholdende mutanter, tre med wildtype kontrol og et kammer indeholdende alle komponenter undtagen fluer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning af dataindsamling. (A) PuTTY-interface til valg af seriel port til dataindsamling. COM3 er valgt med en BAUD-hastighed på 9600 for at matche controllerens output. (B) PuTTY-grænseflade til opsætning af logfil. "Udskrivbart output" er valgt for at aktivere logning af data til en tekstfil, datamappe vælges ved hjælp af knappen "Gennemse", og der oprettes et filnavn. (C) PuTTY-logfil under et eksperiment. Data indsamles ca. to gange i sekundet, og hver linje indeholder følgende kommaseparerede oplysninger: Sensornummer, tid (ms) siden begyndelsen af optagelsen, kammertemperatur (° C), kammertryk (hPa), fugtighed (procent relativ) og strøm (mA). (D) Datalogning under et typisk eksperiment med syv vinduer til forsøgskamre plus en kanal, der registrerer badtemperatur, omgivende lufttemperatur, tryk og fugtighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Data fra mikrorespirometer. (A) Tryk (grå linje, venstre akse) og strøm overO2-generatoren (sort linje, højre akse) i et enkelt respirometerkammer indeholdende 23 w(ex33) fluer. I begyndelsen kræves en lang strømpuls for at sætte kammeret under tryk fra ~ 992 hPa til OFF-tærsklen på 1017 hPa. Da fluerne forbrugteO2, faldt trykket, indtil det nåede ON-tærsklen på 1016 hPa, som aktiverede strøm gennemO2-generatoren, som gentryksatte kammeret til 1017 hPa. Processen blev gentaget seks gange i dette eksperiment. (B) Et eksempel på et utæt kammer forårsaget af en beskadiget stophane, taget fra en anden række eksperimenter. Kammeret kunne ikke opretholde trykket (grå linje), hvilket resulterede i konstant cyklus af elektrolytisk strøm (sort linje). Bemærk en anden tidsskala fra panel A. (C) Effekt af drift i fugtighed. O2-indtagelsen af 20 mg damebille (Hippodamia convergens) i kammeret burde have frembragt et cykeltrykmønster svarende til figur 3A, men den stadige stigning i fugtighed (sort linje) forårsagede en kunstig stigning i kammertrykket (grå linje), der maskerede VO2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvantitative data fra vildtype- og CASK mutant D. melanogaster. (A) Massespecifik VO2 for vildtypefluer (w(ex33)) og mutantfluer (CASKΔ18). I alle plots angiver bund og toppe af kasser henholdsvis første og tredje kvartil, whiskers angiver ekstreme værdier, og prøvestørrelserne (antal kamre, der hver indeholder 17-24 fluer) er angivet i parentes over genotyperne. CASK Δ18 fluer er ikke statistisk signifikant forskellige fra ex33 (median: ex33: 3,420 ml·g-1·h-1, CASKΔ18 : 3,029 ml·g-1·h-1; p = 0,08 Mann-Whitney u-test). B) Fluespecifik VO2. CASKΔ18fluer indtog signifikant mindreO2 (median 1,650 mL·fly-1·h-1) end w(ex33) (2,078 mL·fly-1·h-1; p = 0,0003, Mann-Whitney u-test; signifikans angivet med stjerner). (C) Massen varierede mellem CASKΔ18 og vildtypen (median: 0,526 mg, ex33: 0,623 mg; p = 0,0005, Mann-Whitney u-test; signifikans angivet med asterisker). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1. Undersøgelse af Drosophila respirometri data fra vildtypefluer ved 25 °C. Med en undtagelseaf 18 er undersøgelserne begrænset til dem, der målerO2-forbruget . I de fleste tilfælde var det nødvendigt at estimere VO2 fra grafer, og figurnumre fra de originale papirer leveres. Selvom alle genotyper blev anset for at være "vildtype", varierede kilderne og formeringsmetoderne. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovenstående procedure demonstrerer måling afO2-forbrug i D. Melanogaster ved hjælp af et elektronisk coulometrisk mikrorespirometer. De resulterende datafor O2-forbrug i vildtype D. melanogaster lå inden for de intervaller, der er beskrevet i de fleste tidligere publikationer ved hjælp af forskellige metoder (tabel 1), men noget lavere end dem, der er rapporteret af andre 3,6.
Kritiske trin adresserede metodens to absolutte krav: gastæt tætning og miljømæssig stabilitet. Vedligeholdelse af et gastæt miljø er ligetil, men kræver pleje. Schlenk kolber og rør er ideelle som respirometri kamre. Glaskonstruktion undgår gaspermeabilitet, der findes i mange typer plast19, hvilket er særligt kritisk i langvarige forsøg. Standardsamlingerne tillader gastætte forbindelser med stikkene, der indeholder sensorerne og elektroniske forbindelser. Stophaner giver pålidelige tætninger og kan åbnes eller lukkes efter behov under forsøg. For at sikre gastætte tætninger til hvert eksperiment blev stophaner inspiceret, samlinger blev rengjort grundigt, fornuftige mængder rent silikonefedt blev påført, og samlinger blev sikret med Keck-klemmer.
Metodens følsomhed er begrænset af stabiliteten af temperatur og fugtighed i kammeret. Ændringer i begge parametre vil resultere i trykudsving, der forstyrrer VO2-signalet . Brug af et miljøkammer12 eller cirkulerende vandbad giver mere stabil temperaturregulering. Tidligere arbejde af andre har vist, at metoden kan måleO2-forbruget på nmol·h-1-niveau , når temperaturen blev holdt inden for ±0,01 °C20. For at stabilisere fugtigheden opretholdt stykker bomuldsrulle nedsænket i vand fugtigheden på næsten 100%. Temperatur og fugtighed fik lov til at stabilisere sig i mindst 90 minutter, før kamre blev sat under tryk med elektrolytisk genereretO2 , og optagelserne begyndte. Alle eksperimenter omfattede et kammer, der blev samlet med alle komponenter, men ikke indeholdt fluer, for at overvåge miljøforholdene.
Konstant overvågning af temperatur, tryk og fugtighed regelmæssigt forenkler fejlfinding meget. For eksempel kunne den kunstigt høje tilsyneladende V O2 forårsaget af en beskadiget stophane (figur 3B) eller det tilsyneladende tab af VO2 på grund af ustabil kammerfugtighed (figur 3C) detekteres og korrigeres.
Det coulometriske mikrorespirometer, der beskrives her, har flere fordele. For det første er det relativt billigt med en omtrentlig samlet pris på $ 100 pr. Kanal (bestående af kammer, sensor og controller). For det andet, fordi hver kanal indsamler og transmitterer data uafhængigt, er systemet skalerbart, med antallet af kamre kun begrænset af størrelsen på miljøcontrolleren (vandbad eller miljøkammer) og antallet af tilgængelige USB-porte i computeren (generelt kan udvides til >100). Også fordi kamrene og controllerne er uafhængige, vil svigt af nogen af dem ikke påvirke de andre. For det tredje kan controllere let omprogrammeres til at tilpasse sig det omgivende tryk eller til at justere følsomheden efter behov. I forbindelse hermed er trykket inde i kamrene indstillet til en fast værdi, så eksperimentelt tryk vil være konstant på tværs af eksperimenter uanset omgivende barometrisk tryk. For det fjerde tillader den stadige strøm af data vedrørende tid, temperatur, tryk, fugtighed og strøm detaljeret analyse af disse parametre for hvert kammer, hvilket letter fejlfinding eller analyse af tidsmæssige ændringer i VO2 i længere eksperimenter. Endelig kan miljøforholdene inde i kammeret opretholdes på et konstant niveau i mange timer eller dage, fordi forbrugtO2 løbende udskiftes. I denne undersøgelse svingede kammertrykket fra 1016 til 1017 hPa, hvilket er mindre end 0,1%, hvor den resulterende variation i PO2 var mindre end 0,5%. Baseret på mængden afCuSO4 i hver O2-generator, som kan generere 28 ml O2, og den gennemsnitlige VO2 af grupper af fluer i denne undersøgelse, 1,15 ml / dag (gennemsnit =21,8 fluer pr. Kammer), kan metabolisk hastighed undersøges i op til 24 dage ad gangen. Forudsat at fluerne er forsynet med tilstrækkelig ernæring, betyder det, at stofskiftet kan studeres kontinuerligt i det meste af en flues levetid.
På nuværende tidspunkt er de fleste undersøgelser af metabolisme i D. melanogaster baseret på gasanalyse eller manometri. Metoder, der er afhængige af gasanalyse, såsom stop-flow og kontinuerlige flowrespirometre 2,3,6, har den fordel, at metoden er veletableret, og udstyr er kommercielt tilgængeligt. De kræver dog dyrt og komplekst udstyr, herunder manifolder og molekylære flowsensorer til at regulere flow og gasanalysatorer til at måle gaskoncentrationer. Alternativt er simple manometre9 langt billigere. I den enkleste form, der almindeligvis anvendes til D. melanogaster, bedøves fluer og anbringes i et lille kammer, der indeholder CO2 absorberende materiale, og som er forbundet med et væskereservoir ved hjælp af et kapillarrør. NårO2 forbruges, og den resulterende CO2 absorberes, falder trykket i kammeret, som trækker væske ind i kapillarrøret. Væskens højde er derefter proportional med mængden afO2, der forbruges. Fordi forbrugt O2 ikke erstattes under eksperimentet, falder PO2 kontinuerligt i løbet af eksperimentet. Selvom rutinemæssige eksperimenter muligvis ikke reducerer P O2 tilstrækkeligt til at påvirke V O2 negativt, kan langvarige eksperimenter eller eksperimenter ved forhøjede temperaturer nedbryde O2 og nå den kritiske P O2, hvor V O2 falder kraftigt 3. Et andet problem er, at vægten af væsken i kapillæret udøver en nedadgående kraft, hvilket reducerer væskens højde i forhold til den udøvede nedadgående kraft, hvilket resulterer i potentielle fejl. Metoder til at kompensere for denne effekt er beskrevet 4,21, men er besværlige og anvendes ikke i udbredelse. Direkte sammenligning af gasanalyse og manometri viste, at de to metoder gav signifikant forskellige resultater, men forfatterne var ikke i stand til at give en tilfredsstillende forklaring på uoverensstemmelsen22.
På trods af sine fordele har det coulometriske mikrorespirometer også begrænsninger. For det første er det i modsætning til nogle stop-flow-gasanalysesystemer ikke kommercielt tilgængeligt. Komponenterne er lette at anskaffe, og hverken design eller programmering er kompliceret, men det er potentielt mere komplekst at konstruere end de simple manometriske systemer9. For det andet skal erhvervelse af nøjagtige data omfatte flere cyklusser afO2-generation , så hvert eksperiment skal vare i flere timer. Dette gælder også for eksperimenter ved hjælp af manometri. Endelig, igen som manometri, skal temperatur og fugtighed inde i kamrene være stabile. Ikke desto mindre tilbyder det coulometriske mikrorespirometer en mellemvej med hensyn til omkostninger og kompleksitet, er robust og pålideligt, når det er samlet, og målerO2-forbruget præcist.
Forsøgene med CASKΔ18-mutanter viser både negative (massespecifikke V O2) og positive resultater (fluespecifik VO2). Hvis den >50% reduktion i gang af CASKΔ18mutanter skyldtes kompromitteret metabolisme, kunne det forudsiges, at VO2 ville blive reduceret med en lignende mængde. Alligevel var ændringen i massespecifikt O2-forbrug beskeden (9,6 % reduktion i median VO2) og ikke statistisk signifikant. Dette negative resultat er i overensstemmelse med CASKΔ18-mutanter, der har relativt normal metabolisme, med den adfærdsmæssige fænotype som følge af nedsat bevægelsesdrev. Selvom det er muligt, at metoden mangler tilstrækkelig følsomhed, var reduktionen af VO2 forårsaget af en relativt lille forskel i størrelse (15,5% reduktion i medianmasse) meget signifikant.
Walking er forbundet med signifikant øget energiforbrug5,23, så hvorfor er VO2 relativt normalt i CASK mutanter? Det er muligt, at overdreven pleje i CASK mutanter16 kan opveje reduktionen i gang, eller gangfænotypen er mindre tydelig, når fluer testes i grupper i små rør, men disse hypoteser afventer eksperimentel verifikation. Ikke desto mindre konkluderer vi, at mutationer i CASK locus ikke har stærke, direkte effekter på stofskiftet, og at det coulometriske mikrorespirometer er et effektivt værktøj til at studere metabolisme i D. melanogaster.
Fordi dette apparat let konstrueres af almindelige komponenter, målerO2-forbruget præcist, er meget bærbart, kan bruges i ethvert miljø med stabil temperatur og er blevet brugt med organismer så små som 0,5 mg fluer (denne undersøgelse) og så store som 500 mg skorpioner (DJS ikke offentliggjort), tilføjer det et alsidigt værktøj til at studere metabolismen af forskellige organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Linda Restifo ved University of Arizona for at foreslå at testeO2-forbruget af CASK mutanter og for at sende CASK mutanter og deres kongene kontroller. Publikationsgebyrer blev leveret af Departmental Reinvestment Fund fra Biology Department ved University of College Park. Plads og noget udstyr blev leveret af universiteterne i Shady Grove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J.
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
