Summary
전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O2 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.
Abstract
전기량 미세호흡계는 안정적인 환경을 유지하면서 작은 유기체의O2 소비량을 측정하기 위한 간단하고 저렴한 방법입니다. 전기량 마이크로 호흡계는 O 2 가 소비되고 유기체에 의해 생성 된 CO2 가 흡수 매체에 의해 제거되는 밀폐 챔버로 구성됩니다. 결과적인 압력 감소는 전해 O2 생성을 유발하고, 생성된O2의 양은 이를 생성하는 데 사용된 전하량을 기록하여 측정됩니다. 본 연구에서 이 방법은 장치의 감도와 높은 안정성을 위해 최적화된 환경 조건으로 소그룹으로 테스트된 Drosophila melanogaster에 적용되었습니다. 이 장치에서 야생형 파리가 소비하는O2의 양은 이전 연구에서 측정한 양과 일치합니다. 크기가 작고 덜 활성화되는 것으로 알려진 CASK 돌연변이에 의한 질량 특이적O2 소비는 동종 대조군과 다르지 않았습니다. 그러나, CASK 돌연변이의 크기가 작기 때문에 플라이당 O2 소비가 현저히 감소하였다. 따라서 미세 호흡계는 D. melanogaster에서 O2 소비량을 측정 할 수 있으며 유전자형 간의 적당한 차이를 구별 할 수 있으며 대사율을 측정하기위한 다목적 도구를 추가합니다.
Introduction
신진대사율을 측정하는 능력은 환경적 맥락에서 유기체를 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 예를 들어, 신진대사율이 수명1에서 차지하는 역할, 신진대사에서 식이요법의 역할2 또는 저산소 스트레스3의 역치를 이해하기 위해서는 신진대사율을 측정할 필요가 있다.
신진대사율을 측정하는 방법에는 두 가지가 있다4. 직접 열량계는 열 생산을 측정하여 에너지 소비를 직접 측정합니다. 간접 열량계는 종종 O 2 소비 (VO2), CO2 생산 또는 둘 다의 호흡 측정 측정을 통해 다른 수단을 통해 에너지 생산을 측정합니다. 직접 열량계는 Drosophila melanogaster5를 포함한 작은 외온에 적용되었지만 호흡 측정법은 기술적으로 더 간단하고 일반적으로 사용됩니다.
야생형 및 돌연변이 D. melanogaster의 대사율을 측정하기 위해 여러 형태의 호흡 측정법이 성공적으로 사용되었으며, 체온6, 사회적 환경3, 식이요법3,7 및 신경발달장애8의 대사 효과에 대한 통찰력을 제공하였다. 이들은 비용과 복잡성이 상당히 다른 두 가지 클래스로 나뉩니다. 압력계는 가장 간단하고 가장 저렴한 9,10으로, 파리를 CO 2 흡수제를 포함하고 얇은 모세관을 통해 유체 저장소에 연결된 밀폐 된 챔버에 넣습니다. O2가 소비되고CO2가 흡수됨에 따라 챔버 내의 압력이 감소하고 유체가 모세관으로 유입됩니다. 따라서 모세관의 유체 충전 부피는 VO2에 비례합니다. 모세관의 유체에 의해 가해지는 힘을 보상하는보다 정교한 버전도 D. melanogaster1에 사용되었습니다. 압력계는 간단하고 저렴하다는 장점이 있지만 압력에 민감하기 때문에 일정한 환경 조건이 필요합니다. 또한, 소비된 O2가 치환되지 않기 때문에, 챔버 내부에서 O2(PO2)의 분압이 서서히 감소한다.
가스 분석을 이용한 호흡 측정법은 D. melanogaster에도 정기적으로 사용됩니다. 이 경우, 가스는 파리를 포함하는 밀폐된 챔버로부터 일정한 간격으로 샘플링되어 적외선 분석기(2,6,11)로 보내진다. 이러한 유형의 장치는 상업적으로 이용 가능하고 환경 조건에 덜 민감하며 샘플링 중에 가스가 새로 고쳐져 PO2가 안정적으로 유지된다는 장점이 있습니다. 그러나 장비는 비싸고 작동이 복잡할 수 있습니다.
최근에 개발된 전기량 마이크로 호흡계(12)는 기존 시스템에 대한 저렴하고 민감하며 안정적인 대안을 제공합니다. 실제로, 유기체는 밀폐 챔버에 배치되어 O 2 를 소비하고 호기 된 CO2 는 흡수성 물질에 의해 제거되어 챔버 압력이 순 감소합니다. 내부 압력이 사전 설정된 임계값(ON 임계값)으로 감소하면 전류가 전해 O2 발생기를 통과하여 압력을 두 번째 임계값(OFF 임계값)으로 되돌려 전기분해를 중지합니다. O2 발생기를 통한 전하 전달은 챔버를 재가압하는 데 필요한 O2의 양에 정비례하며, 따라서 유기체4에 의해 소비되는O2를 측정하는데 사용될 수있다. 이 방법은 매우 민감하고 V O2를 정밀하게 측정하며 O2 를 정기적으로 교체하면 몇 시간 또는 며칠 동안 PO2를 거의 일정한 수준으로 유지할 수 있습니다.
이 연구에 사용된 전기량 미세 호흡계는 다중 모드(압력, 온도 및 습도) 전자 센서를 사용합니다. 센서는 압력의 작은 변화를 감지하고 저압 임계값에 도달하면 O2 생성을 활성화하는 마이크로컨트롤러에 의해 작동됩니다(12). 이 장치는 기성품 부품으로 조립되며 다양한 챔버 및 실험 환경에서 사용할 수 있으며 딱정벌레 Tenebrio molitor에 대한 체질량 및 온도의 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구에서, 미세 호흡계는 T. molitor 질량의 약 1%를 갖는 D. melanogaster에서O2 소비량을 측정하도록 조정되었습니다. O2 발생을 활성화하기 위한 임계값을 낮춤으로써 장치의 감도를 높였으며, 온도 제어 수조에서 실험을 수행하거나 챔버 내부의 습도를 100% 또는 그 부근으로 유지함으로써 환경 안정성을 높였습니다.
막 관련 구아닐레이트 키나아제(MAGUK) 계열의 일부인 CASK(Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) 단백질은 다양한 다중 단백질 복합체의 분자 스캐폴드이며 CASK의 돌연변이는 인간 및 D. melanogaster13,14의 신경 발달 장애와 관련이 있습니다. 생존 가능한 D. 멜라노가스터 돌연변이인 CASKΔ18은 도파민성 뉴런(15)의 활성을 방해하고 동종 대조군에 비해 활동 수준을 50% 이상 감소시킨다(14,16). CASK 돌연변이의 감소된 활성 수준과 신진대사 조절에 있어 카테콜아민의 역할로 인해17 우리는 표준 대사율, 즉O2 소비가 대조군에 비해 극적으로 감소할 것이라는 가설을 세웠다.
O2 소비량은 CASKΔ18 및 이들의 야생형 동족체 w(ex33)에서 측정하였다. 파리 그룹을 호흡 측정 챔버에 배치하고, O 2 소비량을 측정하고, O2 소비량을 계산하여 질량 특이적 및 파리 당 기준으로 표현했습니다. 이 장치는 이전 연구와 일치하는 야생형 파리에서 VO2를 기록했으며 야생형 파리와 CASK 돌연변이 파리의 파리당 O2 소비를 구별할 수 있었습니다.
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Protocol
1. 파리 사육 및 수집
- 파리를 25°C에서 표준 초파리 먹이가 들어 있는 좁은 유리병에 보관합니다.
참고: 각 유전자형의 샘플 크기는 최소 9개의 복제로 구성되어야 하며, 각 복제는 아래에 설명된 대로 15-25마리의 파리를 포함하는 단일 호흡계 챔버로 구성됩니다. - 2-3일마다 파리를 옮깁니다.
- 파리를 CO2로 마취하고, 각 유전자형의 15-25 남성 그룹을 수집하고, 각 그룹을 신선하고 효모가 없는 식품 바이알에 넣습니다.
참고: 수컷은 생식 상태로 인한 변동성을 줄이기 위해 사용되었습니다. 이 방법은 남녀 모두에게 적용됩니다. - 파리가 25 ° C에서 최소 24 시간 동안 회복되도록하십시오.
참고: 실험 시점까지 파리는 1-4일 된 상태여야 합니다. 1.3단계에서 설명한 수집 빈도는 파리의 연령 범위를 좁히기 위해 설정할 수 있습니다.
2. 호흡계 챔버 설치 및 조립
- 수조를 켜고 실험에 원하는 온도로 설정합니다.
참고: 아래 실험은 50mL 슐렝크 튜브를 챔버로 사용하여 25°C에서 수행되었습니다. 구성 요소는 그림 1A, 1B 및 1C와 같이 조립해야 합니다. - 실험실 물티슈에 70% 에탄올을 분사하고(조인트에 직접 뿌리지 않음) 센서 플러그에서 먼지와 오래된 그리스를 닦아 챔버와 센서 플러그의 연마된 유리 조인트를 철저히 청소합니다(그림 1A). 새 실험실 물티슈로 에탄올을 닦아냅니다.
- 정수에 적신 면봉 1cm 조각을 챔버 바닥에 놓아 습도를 안정화합니다.
- 충분한 물(~0.5mL)을 추가하여 면봉 바닥에 작은 웅덩이를 만듭니다.
- 챔버 조인트에 엎질러진 물을 닦아냅니다.
- 깔때기를 사용하여 파리를 라벨이 붙은 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
- 면봉으로 튜브를 막습니다.
참고: 튜브는 5mL 폴리프로필렌 시험관으로 구성되며, 길이 5.5cm로 자르고 뜨거운 칼로 구멍을 뚫어 실험 챔버와 공기를 자유롭게 교환할 수 있습니다. CO2 마취는 대사 이상을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 파리를 잃지 않도록 더 많은주의가 필요한 마취없이 파리를 옮깁니다.
- 면봉으로 튜브를 막습니다.
- 파리가 있는 환기 튜브 하나를 각 호흡계 챔버(젖은 면 위)에 추가합니다.
- 소다 석회 카트리지(튜브당 4-5개의 펠릿)를 채우고 챔버 내부에 파리가 있는 튜브 상단에 놓습니다.
알림: 소다 석회 카트리지는 전동 드릴로 800-4번 천공된 5μL 원심분리기 튜브로 구성됩니다. - O2 발전기를 통풍구 수준 아래에 포화 황산구리(CuSO4) 용액으로 채우십시오.
알림: O2 발전기는 나사산 아래에 4개의 구멍이 뚫린 나사 캡 원심분리기 튜브로 구성됩니다. 백금(Pt) 및 구리(Cu) 전극은 2핀 커넥터에 납땜되고 캡에 뚫린 구멍에 삽입되고 에폭시로 부착됩니다. CuSO4 의 전기 분해는 실험 유기체에 의해 소비 된 O2 를 생성합니다. CuSO4 는 무척추 동물에게 유독하므로 유출이나 누출을 피하고 즉시 청소하십시오. - 채워진 O 2 발생기를 센서 플러그의2 핀 커넥터에 연결합니다.
알림: 구리 음극은 컨트롤러의 음극 출력과 백금 양극을 양극선에 연결해야 합니다. 반대로 연결하면 실험이 실패합니다. - 센서 플러그의 접지 유리 조인트의 반대쪽에 투명한 실리콘 그리스 두 개를 살짝 묻힙니다.
- 플러그를 챔버에 삽입하고 플러그(또는 챔버)를 적당한 압력으로 돌려 조인트에 그리스를 퍼뜨립니다.
- 실험실 물티슈로 과도한 그리스를 닦아냅니다.
- 플라스틱 켁 클램프를 조인트에 끼워 챔버에 플러그를 고정합니다. 조립된 챔버는 그림 1C와 같아야 합니다.
- 그날의 실험에 사용된 챔버 수에 대해 위의 단계를 반복합니다.
참고: 기록할 수 있는 챔버의 수는 사용 가능한 챔버, 컨트롤러 및 컴퓨터에 대한 USB 입력의 수에 의해 제한됩니다. 본 실험에서는 일반적으로 7개의 챔버를 병렬로 실행했습니다. 돌연변이와 같은 실험용 파리는 적절한 대조군과 일치해야 합니다. 환경 변화에 대한 통제로 파리가 없는 동일하게 설정된 챔버가 각 실험에 포함되어야 합니다. 다양한 처리(돌연변이, 야생형, 비행 금지)가 포함된 챔버는 실험 간에 순환되어야 합니다. - 조립된 챔버를 꼭지가 열린 수조의 랙에 놓습니다(그림 1E).
참고: 일주기 변동을 피하기 위해, 챔버는 여기에 설명된 모든 실험에 대해 오전 9시 30분에서 9시 50분 사이에 욕조에 배치되었습니다. - 꼭지를 열어 두십시오(핸들을 꼭지와 평행하게 유지).
알림: 마개에 물이 들어가지 않도록 주의하십시오. - 약 30분 동안 꼭지가 열린 상태에서 챔버가 평형을 이루도록 합니다.
알림: 챔버가 평형을 이루는 동안 전자 장치를 연결하고 아래 설명된 대로 데이터 수집을 설정합니다.
3. 컨트롤러 및 컴퓨터 설정
- O2 발전기에 전류를 공급하는 스위치가 OFF 위치에 있는지 확인하십시오(커넥터에서 멀리 떨어져 있음; 그림 1D).
- 각 컨트롤러 박스를 사용 가능한 USB(범용 직렬 버스) 포트에 연결합니다.
알림: 다른 곳에 설명된 컨트롤러 장치의 구성 및 프로그래밍12. - 6선 케이블을 사용하여 컨트롤러를 호흡계 챔버에 연결합니다.
- 컨트롤러의 유기 발광 다이오드(OLED) 디스플레이(그림 1D)에 환경 매개변수가 표시되는지 확인합니다.
- 컨트롤러의 스위치를 사용하여 O2 발전기를 잠시 켭니다(그림 1D).
- 전류 값이 0에서 35mA에서 55mA 사이로 증가하면 컨트롤러와 챔버를 실험할 준비가 된 것입니다.
- 아래 설명된 대로 컨트롤러에서 사용 중인 COM 포트를 확인합니다.,
- Microsoft Windows에서 시작 아이콘을 클릭합니다.
- 설정 아이콘을 클릭합니다.
- Bluetooth 및 장치를 클릭합니다.
- 컨트롤러와 해당 COM 포트가 장치 목록에 나타나는지 확인합니다.
- 바탕 화면에서 PuTTY를 열고 아래 설명된 대로 호흡 측정기의 각 채널에 대한 로그 파일을 설정합니다.
참고: PuTTY는 COM 포트를 통해 컴퓨터로 데이터를 전송하는 데 사용되는 무료 보안 셸 및 텔넷 클라이언트입니다.- "Serial line" 상자에 포트 번호를 입력하여 컨트롤러의 COM 포트를 선택합니다(그림 2A).
- Logging(로깅)을 클릭합니다.
- "Session logging"에서 Printable Output을 선택합니다(그림 2B).
- Log File Name(로그 파일 이름)에서 Browse(찾아보기)를 클릭합니다.
- 선택한 폴더에서 설명 정보(예: 날짜, 종, COM 포트 번호)가 포함된 파일 이름을 만듭니다.
- 저장을 클릭합니다.
- 열기를 클릭합니다. 쉼표로 구분된 데이터가 기록되고 있음을 보여주는 창이 열립니다(그림 2C).
- 실험에 사용 중인 다른 모든 컨트롤러에 대해 반복합니다. 각 COM 포트에 대한 입력은 별도의 창으로 나타납니다(그림 2D).
4. 실험 실행
- 챔버가 30분 동안 평형을 이루면 마개를 닫아 밀봉합니다.
- 안정된 환경을 유지하기 위해 욕실과 챔버를 폴리스티렌 폼 상자로 덮으십시오.
- 한 시간 더 평형을 유지하십시오.
- 컨트롤러 박스의 스위치를 사용하여 각 챔버의 O2 발생기에 전류를 켭니다.
- O2 발생기가 활성화되면 압력이 사전 설정된 OFF 압력으로 증가하는지 확인하십시오.
참고: 대기압보다 약간 높은 1017hPa는 이 일련의 실험에서 "OFF" 압력으로 사용되었습니다. 주변 압력으로 돌아가면 챔버에서 가스가 누출됨을 나타냅니다. 또한 주변 기압에 관계없이 실험 전반에 걸쳐 동일한 압력을 사용할 수 있습니다. "ON" 압력은 1016hPa였으며, 이는 O2 발생기가 활성화되기 전에 압력이 1hPa만 떨어지면 된다는 것을 의미합니다. 이는 초파리에서O2 소비를 측정하기 위한 적절한 민감도를 제공하였다. 챔버가 "OFF" 설정으로 가압되면 전류가 0으로 떨어져야 합니다. - 실험을 3시간 이상 실행합니다.
알림: 고온에서 VO2 가 높을수록 실험 시간이 단축될 수 있습니다. 장비가 작동하는지 수시로 모니터링하되 온도 안정성에 영향을 줄 수 있는 챔버 근처의 과도한 활동을 피하십시오.
5. 마무리 실험
- 모든 컨트롤러에서 O2 발전기를 끕니다.
알림: 챔버가 열려 있는 동안 O2 발전기를 작동하지 않도록 먼저 수행하십시오. - 꼭지를 열어 챔버의 봉인을 풉니다.
- PuTTY 창을 5-15분 더 열어 두어 최종 기준선을 제공합니다.
- 각 컨트롤러의 PuTTY 창을 닫고 녹화를 종료합니다.
참고: 모든 실험은 오후 4시 50분에서 5시 10분 사이에 종료되었습니다. - 케이블에서 센서를 분리합니다.
- 챔버를 건조 랙으로 옮깁니다.
- 챔버에서 센서 플러그를 한 번에 하나씩 제거합니다.
- O2 발전기를 분리하고 튜브 랙에 놓습니다.
- 센서 플러그에서 그리스를 닦아내고 랙에 보관하십시오.
- 챔버 조인트에서 그리스를 청소하고 파리와 소다 석회가 있는 튜브를 제거합니다.
- 각 튜브에 있는 파리를 CO2 로 마취하고 웨이트 보트를 두드리며 마이크로 저울로 무게를 잰다.
- 각 튜브의 무게와 파리 수를 기록합니다.
- 파리를 버리거나 추가 절차를 위해 따로 보관하십시오.
- 카트리지의 소다 석회를 폐기물 용기에 버리십시오.
- O2 발생기를 열고 CuSO4 용액을 폐기물 용기에 버립니다.
- 전극과 튜브를 정제수로 헹굽니다.
- 건조를 위해 튜브 랙을 놓습니다.
6. 전하 전달 데이터 분석
- 데이터를 쉼표로 구분된 텍스트로 스프레드시트로 가져오고, 각 레코드는 별도의 워크시트로 구성됩니다.
- O2 발생기의 각 펄스에 대한 전류 및 시간 데이터를 기록합니다. 챔버가 가압된 후 첫 번째 펄스부터 시작하여 각 전류 펄스의 시작 시간과 종료 시간(행 번호)을 기록합니다. 이는 전류가 0 이상(일반적으로 약 45-50mA)에서 0 위에 있는 마지막 행까지 갈 때의 행 번호입니다.
- 워크시트에 표를 만들어 다음 데이터를 기록합니다.
- 펄스 동안의 평균 전류 진폭: = 각 펄스(현재 열부터)에 대한 AVERAGE([펄스의 첫 번째 행]:[펄스의 마지막 행]).
- 펄스 지속 시간: ([펄스의 마지막 행] - [펄스의 첫 번째 행[-한 행]])/각 펄스에 대해 1000(밀리초 단위의 시간에서).
- 총 실험 시간: [마지막 펄스 시작 시간] - [챔버 가압 후 첫 번째 펄스 종료 시간](시간 단위(분 열)에서).
- 그런 다음 각 펄스에 대한 전하 전달(Q)을 계산합니다(평균 전류 X 지속 시간).
- 모든 펄스의 전하를 합산하여 총 전하(Qtot)를 계산합니다.
7.O2 소비량 분석
- 모든 데이터에 대해 새 스프레드시트를 설정하고 각 챔버에 대해 다음을 입력하거나 계산합니다.
- Qtot (총 요금)
- 두더지(= Q ÷ 96485 × 4)
- mL O2 (= 몰 × 22413 mL / mol)
- 총 시간(위의 데이터 분석에서)
- mL min-1 (= mlO2 ÷ 총 시간)
- 그램 단위의 무게(실험 후 마취 및 무게 측정된 파리)
- mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ 중량(그램))
- mL/h/g(상기× 60)
- mg/fly (= 파리의 무게 ÷ 파리의 수)
- μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ 파리 수).
- 각 치료(예: 유전자형)에 대한 데이터를 표로 작성합니다.
- ANOVA, t-검정 또는 Mann-Whitney u-검정을 사용하여 처리를 비교합니다 13.
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Representative Results
호흡계 컨트롤러의 압력 및 전류 출력은 그림 3A의 한 실험에서 하나의 챔버에 대해 표시됩니다. 첫 번째 긴 전류 펄스는 주변 압력(약 992hPa)에서 사전 설정된 OFF 임계값인 1017hPa까지 챔버를 가압했습니다. 파리가 O 2 를 소비하고 CO 2 가 흡수됨에 따라 압력은 O2 발생기를 통해 전류를 활성화하는 1016hPa의 ON 임계값에 도달할 때까지 천천히 감소했습니다. 표시된 예에서 각 펄스의 평균 진폭은 50.1mA이고 지속 시간은 16.1초이며 펄스당 약 0.81쿨롱(C)의 전하 전달을 생성합니다. 이 챔버의 총 전하 전달은 총 240.0분 동안 3.28C였습니다. 파리의 질량 및 수(총 14.9mg의 무게가 되는 파리 23마리)에 대한 절차에 기술된 계산을 사용하여, 이 챔버 내의 그룹에 대한O2 소비량은 3.19 mL h-1 g-1 또는 2.07 μL h-1 fly-1이었다.
이 장비는 최소한의 교육으로 쉽게 설정할 수 있으며 여러 번의 조립 및 종료 주기에서 안정적으로 작동합니다. 그럼에도 불구하고 장비를 정기적으로 유지 관리하고 검사해야 하며 실험 조건을 신중하게 제어해야 합니다. 예를 들어, 조인트 또는 스톱콕의 고장으로 인해 기밀 씰이 손실되면 빠른 가압 주기와 높은 VO2가 발생할 수 있습니다(그림 3B). 또한 챔버 내부의 온도와 습도는 안정적으로 유지되어야 합니다. 온도 또는 습도가 감소하면 결과적인 압력 강하가O2 소비되는 것으로 잘못 해석됩니다. 반대로, 온도 또는 습도의 상향 드리프트는 O2 소비로 인한 압력 감소를 상쇄하고VO2 신호를 인위적으로 감소시키거나 제거합니다(그림 3C).
이 방법은 CASK 궤적(14)으로부터 전치 가능한 요소의 부정확한 절제에 의해 생성되고 운동이 급격히 감소하는 CASKΔ18 돌연변이체의 VO2를 테스트하는 데 사용되었다14,16. 전치 가능한 요소의 정밀 절제에 의해 생성된 야생형 w(ex33) 대조군에서, 평균 질량 특이적O2 소비량은 3.65 ± 0.24mL·g-1·h-1(n=16 챔버; 그림 4A).
눈에 띄게 감소된 운동에도 불구하고, CASKΔ18 돌연변이의 VO2 는 대조군보다 약간 낮았지만 유의하게 낮지는 않았다(평균 ± s.e.m.= 3.23 ± 0.13 mL·g-1·h-1; n = 11 그룹; P = 0.08 Mann-Whitney u-검정).
체질량 측면에서 대사율을 표현하는 것의 타당성에 의문이 제기되었기 때문에18,O2 소비량도 파리당 기준으로 분석되었다(그림 4B). 이 분석을 사용하여 야생형 대조군에 비해 CASKΔ18에서 VO2가 유의하게 감소했습니다(ex33: 2.22 ± 0.13μL·fly-1·h-1; 캐스크Δ18: 1.58 ± 0.10 μL·플라이-1·h-1; P = 0.0003, Mann-Whitney u-검정). 그러나 CASKΔ18 파리의 평균 질량은 ex33 대조군보다 >20% 낮았다(그림 4C; ex33 0.61 ± 0.01 mg; 캐스크Δ18 0.51± 0.02 mg; P = 0.0005, Mann-Whitney u-test)이므로 유전자형 간의 대사율 차이는 아마도 크기의 차이 때문일 것입니다.
그림 1: 호흡계 설정. (A) 조립 전 센서 플러그(위)와 50mL 챔버(아래 50mL Schlenk 튜브로 구성)의 다이어그램. 챔버와 센서 플러그를 연결할 19/22 접지 유리 조인트의 위치를 기록하고 각 실험 전에 청소해야 합니다. 챔버를 열거나 밀봉하는 데 필요한 마개도 표시됩니다. (B) 조립 및 실험 준비 완료, 챔버 및 구성 요소의 다이어그램, 보여주기: 젖은 면봉, 파리가 포함된 폴리프로필렌 튜브, 면 마개, 소다석회 카트리지 및 CuSO4로 채워진 O2 발생기. (C) 조립된 챔버의 사진. 플러그를 챔버에 고정하는 Keck 클램프는 챔버를 고정하는 링 스탠드 클램프에 의해 부분적으로 가려집니다. (D)O2 발생기를 통해 전류를 제어하는 스위치와 OLED 디스플레이를 볼 수 있는 창을 보여주는 컨트롤러의 사진. (E) 수조에서 조립된 챔버. 7개의 방이 표시되는데, 3개는 돌연변이, 3개는 야생형 대조군, 1개는 파리를 제외한 모든 구성 요소를 포함하고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 데이터 수집 설정. (A) 데이터 수집을 위한 직렬 포트를 선택하기 위한 PuTTY 인터페이스. 컨트롤러의 출력과 일치하도록 BAUD 속도가 3인 COM9600이 선택되었습니다. (B) 로그 파일 설정을 위한 PuTTY 인터페이스. "인쇄 가능한 출력"을 선택하여 텍스트 파일에 데이터를 기록할 수 있도록 하고, "찾아보기" 버튼을 사용하여 데이터 폴더를 선택하고, 파일 이름을 만듭니다. (C) 실험 중 PuTTY 로그 파일. 데이터는 초당 약 2회 수집되며, 각 라인에는 센서 번호, 수집 시작 이후 시간(ms), 챔버 온도(°C), 챔버 압력(hPa), 습도(상대 백분율) 및 전류(mA)와 같은 쉼표로 구분된 정보가 포함됩니다. (D) 실험 챔버를 위한 7개의 창과 수조 온도, 주변 공기 온도, 압력 및 습도를 기록하는 1개의 채널이 있는 일반적인 실험 중 데이터 로깅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미세 호흡계의 데이터. (A) 23W(ex33) 파리를 포함하는 단일 호흡계 챔버에서 O2 발생기(검은색 선, 오른쪽 축)의 압력(회색 선, 왼쪽 축) 및 전류. 처음에는 ~ 992hPa에서 1017hPa의 OFF 임계 값까지 챔버를 가압하기 위해 긴 전류 펄스가 필요합니다. 파리가 O 2 를 섭취함에 따라 압력은 1016 hPa의 ON 임계 값에 도달 할 때까지 떨어졌고, O2 발생기를 통해 전류가 활성화되어 챔버를 1017 hPa로 다시 가압했습니다. 이 실험에서는 이 과정을 6번 반복했습니다. (B) 손상된 스톱콕으로 인한 누출 챔버의 예로, 다른 일련의 실험에서 가져온 것입니다. 챔버가 압력을 유지하지 못하여(회색 선) 전해 전류(검은색 선)가 일정하게 순환했습니다. 패널 A와 다른 시간 척도에 유의하십시오. (C) 습도 드리프트의 영향. 챔버에서 20mg의 무당벌레(Hippodamia convergens)에 의한 O2 섭취는 그림 3A와 유사한 압력의 순환 패턴을 생성했어야 하지만, 습도의 꾸준한 증가(검은색 선)는 VO2를 가리는 챔버 압력(회색 선)의 인공물 증가를 유발했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 야생형 및 CASK 돌연변이 D. melanogaster의 정량적 데이터. (A) 야생형(w(ex33)) 및 돌연변이(CASKΔ18)에 대한 질량 특이적 VO2 파리. 모든 플롯에서 상자의 하단과 상단은 각각 1 사분위수와 3 사분위수를 나타내고 수염은 극단 값을 나타내며 표본 크기 (챔버 수, 각각 17-24 개의 파리를 포함)는 유전자형 위의 괄호 안에 제공됩니다. CASK Δ18 파리는 ex33과 통계적으로 유의하게 다르지 않습니다(중앙값: ex33: 3.420mL·g-1·h-1 , CASKΔ18: 3.029mL·g-1·h-1; p = 0.08 Mann-Whitney u -검정). (B) 비행 특이적 VO2. CASKΔ18파리는 w(ex33)(2.078mL·fly-1·h-1; p = 0.0003, Mann-Whitney u-test, 별표로 표시된 유의성)보다O2(중앙값 1.650mL·fly-1·h-1)를 현저히 적게 소비했습니다. (C) 질량은 CASKΔ18과 야생형 간에 차이가 있었습니다(중앙값: 0.526mg, ex33: 0.623mg; p = 0.0005, Mann-Whitney u-검정; 별표로 표시된 유의성). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 25°C에서 야생형 파리의 초파리 호흡 측정 데이터 조사. 한 가지 예외(18)를 제외하고, 연구는O2 소비를 측정하는 연구로 제한된다. 대부분의 경우 그래프에서 VO2 를 추정해야 했으며 원본 논문의 수치 수치가 제공됩니다. 모든 유전자형이 "야생형"으로 간주되었지만 출처와 번식 방법은 다양했습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 절차는 전자 전기량 미세 호흡계를 사용하여 D. Melanogaster에서O2 소비량을 측정하는 방법을 보여줍니다. 야생형 D. melanogaster에서의O2 소비에 대한 결과 데이터는 다른 사람들에 의해 보고된 것보다 다소 낮지만(표 1) 다양한 방법을 사용하여 대부분의 이전 간행물에서 기술된 범위 내에 있었다 3,6.
중요한 단계는 이 방법의 두 가지 절대적인 요구 사항인 기밀 밀봉과 환경 안정성을 해결했습니다. 기밀 환경을 유지하는 것은 간단하지만 주의가 필요합니다. Schlenk 플라스크와 튜브는 호흡 측정 챔버로 이상적입니다. 유리 구조는 많은 유형의 플라스틱(19)에 존재하는 가스 투과성을 방지하며, 이는 장기간의 실험에서 특히 중요합니다. 표준 조인트는 센서 및 전자 연결부가 포함된 플러그와의 기밀 연결을 허용합니다. 마개는 신뢰할 수 있는 밀봉을 제공하며 실험 중 필요에 따라 열거나 닫을 수 있습니다. 각 실험에 대한 기밀 밀봉을 보장하기 위해 마개를 검사하고, 조인트를 철저히 청소하고, 적절한 양의 깨끗한 실리콘 그리스를 바르고, 조인트를 Keck 클램프로 고정했습니다.
이 방법의 감도는 챔버 내 온도 및 습도의 안정성에 의해 제한됩니다. 두 매개변수 중 하나를 변경하면 VO2 신호를 방해하는 압력 변동이 발생합니다. 환경 챔버(12) 또는 순환 수조의 사용은 보다 안정적인 온도 제어를 제공한다. 다른 사람들에 의한 이전 연구는 온도가 ±0.01°C 이내로 유지되었을 때 nmol·h-1 수준에서O2 소비량을 측정할 수 있음을 입증했다(20). 습도를 안정시키기 위해 물에 담근 면봉 조각은 습도를 거의 100%로 유지했습니다. 챔버가 전해질로 생성된O2로 가압되고 기록이 시작되기 전에 온도 및 습도가 적어도 90분 동안 안정화되도록 허용하였다. 모든 실험에는 환경 조건을 모니터링하기 위해 모든 구성 요소로 조립되었지만 파리가 포함되지 않은 하나의 챔버가 포함되었습니다.
온도, 압력 및 습도를 정기적으로 지속적으로 모니터링하면 문제 해결이 크게 간소화됩니다. 예를 들어, 손상된 스톱콕(그림 3B)으로 인한 인위적으로 높은 겉보기 VO2 또는 불안정한 챔버 습도로 인한 VO2의 겉보기 손실(그림 3C)을 검출하고 수정할 수 있었습니다.
여기에 설명된 전기량 미세 호흡계에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 채널당 약 100달러의 총 비용이 들어 비교적 저렴합니다(챔버, 센서 및 컨트롤러 포함). 둘째, 각 채널이 독립적으로 데이터를 수집하고 전송하기 때문에 챔버 수는 환경 컨트롤러(수조 또는 환경 챔버)의 크기와 컴퓨터에서 사용 가능한 USB 포트 수(일반적으로 >100개까지 확장 가능)에 의해서만 제한됩니다. 또한 챔버와 컨트롤러가 독립적이기 때문에 그 중 하나가 고장나더라도 다른 챔버에 영향을 미치지 않습니다. 셋째, 컨트롤러를 쉽게 재프로그래밍하여 주변 압력에 적응하거나 필요에 따라 감도를 조정할 수 있습니다. 이와 관련하여 챔버 내부의 압력은 고정 값으로 설정되므로 실험 압력은 주변 기압에 관계없이 실험 전반에 걸쳐 일정합니다. 넷째, 시간, 온도, 압력, 습도 및 전류에 관한 꾸준한 데이터 스트림을 통해 각 챔버에 대한 이러한 매개변수를 자세히 분석할 수 있으므로 더 긴 실험에서VO2의 시간적 변화에 대한 문제 해결 또는 분석을 용이하게 합니다. 마지막으로, 챔버 내부의 환경 조건은 소비된O2가 지속적으로 교체되기 때문에 수 시간 또는 며칠 동안 일정한 수준으로 유지될 수 있습니다. 본 연구에서 챔버 압력은 1016에서 1017hPa로 변동했으며, 이는 0.1% 미만이었고 결과 PO2의 변동은 0.5% 미만이었습니다. 28mL의 O2를 생성할 수 있는 각 O2 발생기의 CuSO4 양과 이 연구에서 파리 그룹의 평균 V O2 1.15mL/일(평균 = 챔버당 21.8마리)을 기준으로 한 번에 최대24일 동안 대사율을 연구할 수 있습니다. 파리에게 적절한 영양이 공급된다고 가정하면, 이는 파리의 수명 대부분을 지속적으로 연구할 수 있음을 의미합니다.
현재 D. melanogaster의 신진 대사에 대한 대부분의 연구는 가스 분석 또는 압력계를 기반으로합니다. 정지 흐름 및 연속 유량 호흡계(2,3,6)와 같이 가스 분석에 의존하는 방법은 이 방법이 잘 확립되어 있고 장비가 상업적으로 이용 가능하다는 장점이 있습니다. 그러나 유량을 조절하기 위한 매니폴드 및 분자 유량 센서와 가스 농도를 측정하기 위한 가스 분석기를 포함한 고가의 복잡한 장비가 필요합니다. 또는 간단한 압력계(9)가 훨씬 저렴하다. D. melanogaster에 일반적으로 사용되는 가장 간단한 형태로, 파리는 마취되어 CO2 흡수 물질을 포함하고 모세관에 의해 유체 저장소에 연결된 작은 챔버에 배치됩니다. O 2 가 소비되고 생성 된 CO2 가 흡수되면 챔버의 압력이 떨어지고 유체가 모세관으로 유입됩니다. 유체의 높이는 소비된O2의 양에 비례한다. 소모된 O2는 실험 중에 대체되지 않기 때문에, PO2는 실험 경과에 걸쳐 지속적으로 감소한다. 일상적인 실험은 VO2에 부정적인 영향을 미칠 만큼 P O2를 충분히 감소시키지 않을 수 있지만, 장기간의 실험 또는 고온에서의 실험은 O2 를 고갈시키고 V O2 가 급격히 감소하는 임계 P O2 에 도달할 수 있다3. 또 다른 문제는 모세관에 있는 유체의 무게가 아래쪽으로 힘을 가하여 아래쪽으로 가해지는 힘에 비례하여 유체의 높이를 줄여 잠재적인 오류를 발생시킨다는 것입니다. 이 효과를 보상하는 방법은 4,21로 설명되었지만, 번거롭고 널리 사용되지 않는다. 가스 분석과 압력계를 직접 비교한 결과, 두 방법이 상당히 다른 결과를 낳았지만, 저자는 이 차이에 대한 만족스러운 설명을 내놓지 못했다22.
장점에도 불구하고 전기량 미세 호흡계에도 한계가 있습니다. 첫째, 일부 스톱 플로우 가스 분석 시스템과 달리 상업적으로 이용 가능하지 않습니다. 구성 요소는 쉽게 구할 수 있고 설계나 프로그래밍이 복잡하지 않지만, 단순한 압력 측정 시스템(9)보다 구성하기가 더 복잡할 수 있다. 둘째, 정확한 데이터 수집에는O2 생성의 여러 사이클이 포함되어야 하므로 각 실험은 몇 시간 동안 지속되어야 합니다. 이것은 압력계를 사용한 실험에서도 마찬가지입니다. 마지막으로, 압력계와 마찬가지로 챔버 내부의 온도와 습도는 안정적이어야 합니다. 그럼에도 불구하고 전기량 마이크로 호흡계는 비용과 복잡성과 관련하여 중간 지점을 제공하고 조립 후 견고하고 신뢰할 수 있으며 O2 소비량을 정확하게 측정합니다.
CASKΔ18 돌연변이를 사용한 실험은 음성(질량 특이적 V O2)과 양성 결과(파리 특이적 VO2)를 모두 보여줍니다. CASKΔ18돌연변이의 보행 >50% 감소가 신진대사 저하로 인한 것이라면 VO2도 비슷한 양만큼 감소할 것으로 예측할 수 있습니다. 그러나 질량 특이적 O2 소비량의 변화는 완만했으며(중앙값 VO2 9.6% 감소), 통계적으로 유의하지 않았습니다. 이 음성 결과는 CASKΔ18 돌연변이가 비교적 정상적인 신진대사를 보이며, 행동 표현형은 운동 욕구 감소로 인한 것과 일치합니다. 이 방법이 충분한 감도가 부족할 수 있지만, 상대적으로 작은 크기 차이(중간 질량 15.5% 감소)에 의한 VO2의 감소는 매우 유의하였다.
걷기는 에너지 소비의 현저한 증가와 관련이 있는데 5,23 CASK 돌연변이에서 VO2가 비교적 정상적인 이유는 무엇입니까? CASK 돌연변이16의 과도한 그루밍이 보행 감소를 상쇄할 수 있거나, 파리를 작은 튜브에서 그룹으로 테스트할 때 보행 표현형이 덜 분명할 수 있지만, 이러한 가설은 실험적 검증을 기다리고 있습니다. 그럼에도 불구하고 우리는 CASK 유전자좌의 돌연변이가 신진대사에 강력하고 직접적인 영향을 미치지 않으며 전기량 미세호흡계가 D. melanogaster의 신진대사를 연구하는 데 효과적인 도구라는 결론을 내렸습니다.
이 장치는 일반적인 구성 요소로 쉽게 구성되고,O2 소비를 정확하게 측정하고, 휴대성이 높고, 온도가 안정된 모든 환경에서 사용할 수 있으며, 0.5mg의 파리(본 연구)만큼 작은 유기체와 500mg의 전갈(DJS 미공개)과 함께 사용되어 왔기 때문에 다양한 유기체의 대사를 연구하기 위한 다목적 도구를 추가합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
애리조나 대학의 Linda Restifo 박사가 CASK 돌연변이의O2 섭취 테스트를 제안하고 CASK 돌연변이와 그 유전자 대조군을 보내준 것에 대해 감사드립니다. 출판비는 University of College Park의 생물학과에서 부서별 재투자 기금으로 제공되었습니다. 공간과 일부 장비는 Shady Grove의 대학에서 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
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