Summary
Dit werk presenteert een diermodel van endotheliale-naar-mesenchymale overgangsgeïnduceerde fibrose, zoals te zien is bij aangeboren hartafwijkingen zoals kritieke aortastenose of hypoplastisch linkerhartsyndroom, wat gedetailleerde histologische weefselevaluatie, de identificatie van regulerende signaalroutes en het testen van behandelingsopties mogelijk maakt.
Abstract
Endocardiale fibroelastose (EFE), gedefinieerd door accumulatie van subendocardiaal weefsel, heeft grote gevolgen voor de ontwikkeling van de linker hartkamer (LV) en sluit patiënten met congenitale kritische aortastenose en hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS) uit van curatief anatomisch biventriculair chirurgisch herstel. Chirurgische resectie is momenteel de enige beschikbare therapeutische optie, maar EFE komt vaak terug, soms met een nog meer infiltratief groeipatroon in het aangrenzende myocardium.
Om de onderliggende mechanismen van EFE beter te begrijpen en therapeutische strategieën te onderzoeken, werd een diermodel ontwikkeld dat geschikt is voor preklinische tests. Het diermodel houdt er rekening mee dat EFE een ziekte van het onvolgroeide hart is en geassocieerd is met stroomstoornissen, zoals ondersteund door klinische observaties. De heterotope harttransplantatie van neonatale donorharten van ratten vormt dus de basis voor dit model.
Een neonataal rattenhart wordt getransplanteerd in de buik van een adolescente rat en verbonden met de infrarenale aorta en inferieure vena cava van de ontvanger. Terwijl perfusie van de kransslagaders de levensvatbaarheid van het donorhart behoudt, induceert stroomstagnatie binnen de LV EFE-groei in het zeer onvolgroeide hart. Het onderliggende mechanisme van EFE-vorming is de overgang van endocardiale endotheelcellen naar mesenchymale cellen (EndMT), wat een goed beschreven mechanisme is van de vroege embryonale ontwikkeling van de kleppen en septa, maar ook de belangrijkste oorzaak van fibrose bij hartfalen. EFE-vorming kan binnen enkele dagen na transplantatie macroscopisch worden waargenomen. Transabdominale echocardiografie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid, contractiliteit en doorgankelijkheid van het transplantaat van de anastomosen te controleren. Na euthanasie wordt het EFE-weefsel geoogst en vertoont het dezelfde histopathologische kenmerken als menselijk EFE-weefsel van HLHS-patiënten.
Dit in vivo model maakt het mogelijk om de mechanismen van EFE-ontwikkeling in het hart te bestuderen en behandelingsopties te testen om deze pathologische weefselvorming te voorkomen en biedt de mogelijkheid voor een meer algemeen onderzoek van EndMT-geïnduceerde fibrose.
Introduction
Endocardiale fibroelastose (EFE), gedefinieerd door de ophoping van collageen en elastische vezels in het subendocardiale weefsel, presenteert zich als een parelachtig of ondoorzichtig verdikt endocardium; EFE ondergaat de meest actieve groei tijdens de foetale periode en de vroege kindertijd1. In een autopsiestudie werd 70% van de gevallen met hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS) geassocieerd met de aanwezigheid van EFE2.
Cellen die markers voor fibroblasten tot expressie brengen, zijn de belangrijkste celpopulatie in EFE, maar deze cellen brengen tegelijkertijd ook endocardiale endotheliale markers tot expressie, wat een indicatie is van de oorsprong van deze EFE-cellen. Onze groep heeft eerder vastgesteld dat het onderliggende mechanisme van EFE-vorming een fenotypische verandering van endocardiale endotheelcellen naar fibroblasten inhoudt door middel van endotheel-naar-mesenchymale overgang (EndMT)3. EndMT kan worden gedetecteerd met behulp van immunohistochemische dubbele kleuring voor endotheelmarkers zoals cluster of differentiation (CD) 31 of vasculaire endotheliale (VE)-cadherine (CD144) en fibroblastmarkers (bijv. alfa-gladde spieractine, α-SMA). Verder hebben we eerder ook de regulerende rol van de TGF-ß-route in dit proces vastgesteld met activering van de transcriptiefactoren SLUG, SNAIL en TWIST3.
EndMT is een fysiologisch proces dat optreedt tijdens de embryonale cardiale ontwikkeling en leidt tot de vorming van de septa en kleppen van endocardiale kussens4, maar het veroorzaakt ook orgaanfibrose bij hartfalen, nierfibrose of kanker en speelt een sleutelrol bij vasculaire atherosclerose 5,6,7,8. EndMT bij hartfibrose wordt voornamelijk gereguleerd via de TGF-β-route, zoals wij en anderen hebben gemeld 3,9. Er zijn verschillende stimuli beschreven om EndMT te induceren: ontsteking10, hypoxie11, mechanische veranderingen 12 en stroomstoornissen, waaronder veranderingen van de intracavitaire bloedstroom 13, en EndMT kan ook een gevolg zijn van een genetische ziekte 14.
Dit diermodel is ontwikkeld met behulp van de belangrijkste componenten van cardiale EFE-ontwikkeling, namelijk onvolwassenheid en veranderingen van de intracavitaire bloedstroom, met name stroomstagnatie. Onvolwassenheid werd vervuld door neonatale rattenharten als donoren te gebruiken, aangezien bekend is dat neonatale ratten direct na de geboorte onvolwassen zijn. Heterotope harttransplantatie bood de mogelijkheid van intracavitaire stroombeperking15.
Vanuit klinisch oogpunt maakt dit diermodel het mogelijk om de impact van EndMT op de groeiende linker hartkamer (LV) beter te onderzoeken. De groeibeperking die wordt opgelegd aan het foetale en neonatale hart door EndMT-geïnduceerde EFE-formatie16 sluit patiënten met obstructies van het linkerventrikeluitstroomkanaal (LVOTO) uit, zoals congenitale kritische aortastenose en hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS), uit van curatief anatomisch biventriculair chirurgisch herstel17. Dit diermodel vergemakkelijkt de studie van de cellulaire mechanismen en regulatie van weefselvorming via EndMT en maakt het mogelijk om farmacologische behandelingsopties te testen 3,18.
Transabdominale echocardiografie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid, contractiliteit en doorgankelijkheid van het transplantaat van de anastomosen te controleren. Na euthanasie kan EFE-vorming binnen 3 dagen na transplantatie macroscopisch worden waargenomen. EFE-weefsel vertoont dezelfde histopathologische kenmerken als menselijk EFE-weefsel van patiënten met LVOTO.
Daarom kan dit diermodel, hoewel ontwikkeld voor pediatrisch gebruik in het spectrum van HLHS, worden toegepast bij het bestuderen van verschillende ziekten op basis van het moleculaire mechanisme van EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council. 2011. Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren: achtste editie. De dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Boston Children's Hospital.
Voorafgaand aan de operatie worden alle chirurgische instrumenten met stoom geautoclaveerd en wordt de gemodificeerde Krebs-Henseleit-buffer, met een eindconcentratie van 22 mmol/L KCl, bereid als een cardioplegische oplossing (tabel 1). De oplossing wordt gefilterd gesteriliseerd en een nacht bij 4 °C bewaard. Een chirurgische microscoop (12,5x) is vereist voor de heterotope neonatale harttransplantatieprocedure bij ratten.
1. Voorbereiding en anesthesie
- Gebruik mannelijke/vrouwelijke Lewis-ratten met een gewicht van ongeveer 150 g (5-6 weken oud) als ontvangers.
- Scheer om te beginnen de buik van de rat royaal met een scheermes.
- Plaats de rat in een isofluraankamer en zet de zuurstofstroom aan met 2 l/min met 2% isofluraan totdat het dier goed verdoofd is maar nog steeds spontaan ademt. Injecteer 45 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine intraperitoneaal (IP), evenals 300 E/kg heparine. Bevestig de juiste verdoving met een teenknijptest.
OPMERKING: Houd de spontane ademhaling en hartslag zorgvuldig in de gaten door palpatie van de borstkas om gedurende het hele proces een stabiele hemodynamische status te garanderen. - Plaats voor intubatie de rat op een schuine plank (Figuur 1), zet de voortanden vast met een touwtje en plaats het hoofd naar de chirurg gericht.
- Plaats het licht aan de buitenkant van de nek op het gebied van de stembanden, pak de tong met twee vingers vast en duw deze lichtjes omhoog en naar links om optimaal zicht te bieden voor intubatie. Gebruik een canule van 18 G, 2 inch voor een rat van 100-150 g. Zet de intratracheale slang vast met tape.
OPMERKING: Chirurgische loups met een vergroting van 3.5x worden aanbevolen voor intubatie. - Sluit de intubatiecanule aan op de ventilator voor kleine dieren en pas de instellingen aan volgens de instructies van de fabrikant op basis van de grootte van het dier.
NOTITIE: Gebruik de volgende instellingen voor een rat van 150 g: volumemodus; ademhalingsfrequentie, 55/min; ademvolume, 1,3 ml 50 % I/E-verhouding, maar dit kan indien nodig worden aangepast. Zorg voor een goede bilaterale en gelijkmatige beweging van de borstkas en dien isofluraan continu toe met 0,5%-2% via het beademingsapparaat. - Plaats de rat op een verwarmingskussen (om de normale lichaamstemperatuur te behouden) in rugligging met de staart naar de chirurg gericht. Steriliseer de buik driemaal afwisselend met een betadine-oplossing en 70% ethanol. Dien oogglijmiddel toe en bedek de rat met een steriel chirurgisch laken, waarbij de buik onbedekt blijft.
2. Chirurgische voorbereiding en heterotope transplantatie van het neonatale donorhart bij de ontvangende rat
- Voer een laparotomie op de middellijn uit met een scalpel met 15 mesjes voor de incisie in de huid en gebruik een schaar om de voorste buikwand te openen, gevolgd door stompe belichting van de retroperitoneale abdominale aorta en inferieure vena cava (IVC) met wattenstaafjes.
- Mobiliseer de darmen (inclusief de dalende dikke darm) en plaats ze in de richting van het rechter bovenste kwadrant. Bedek de darmen met warm, in zout gedrenkt gaas. Gebruik retractors om een optimale belichting van de IVC en de abdominale aorta te garanderen.
- Voer een stompe dissectie uit van de infrarenale IVC en de abdominale aorta in de richting van de bifurcatie. Leg alle infrarenale vertakkingsslagaders en aders (bijv. inferieure mesenteriale slagader en lymfeklierslagaders) vast met een 10-0 nylon hechtdraad.
OPMERKING: Er is een grote variabiliteit in de anatomie van deze zijtakken. Bewaak de hartslag en hartslag van de aorta visueel wanneer er geen andere hemodynamische monitoring beschikbaar is. Beoordeel elke 15 minuten de juiste diepte van de anesthesie door middel van een teenknijptest. Pas de isofluraanconcentratie dienovereenkomstig aan. - Nadat het donorhart is geoogst bij een neonatale rat, levert u het uitgesneden hart in steriele omstandigheden af in een operatiebassin met Krebs-Henseleit-buffer op het operatieveld. Spoel het donorhart met tussenpozen met een ijskoude cardioplegische oplossing.
OPMERKING: Wanneer een tweede chirurg beschikbaar is, moet het hart tegelijkertijd worden voorbereid, aangezien een tweede chirurg de totale anesthesietijd van het ontvangende dier en de ischemietijd van het donorhart verkort. Als er geen tweede chirurg beschikbaar is, bedek dan de buik van de ontvanger met warme zoutoplossing en houd het dier in de gaten tijdens de oogstprocedure. - Breng vier kleine atraumatische vasculaire klemmen aan op de distale en proximale segmenten van de infrarenale aorta en IVC. Sluit indien nodig tijdelijk een ongunstig niervat af met een 7-0 zijden hechting en laat de hechting na de procedure los. Plaats een 10-0 nylon hechting verticaal op de voorwand van de aorta om de aortomie te vergemakkelijken. Voer een aortotomie uit met twee kleine horizontale sneden (wigvormig) met een microschaar door de hechting iets omhoog te trekken.
OPMERKING: Om eventuele bloedstolsels te verwijderen, wordt het spoelen van het aortalumen met gehepariniseerde zoutoplossing aanbevolen. - Plaats het donorhart aan de linkerkant (vanuit het perspectief van het dier) van de aorta en zet de infrarenale aorta van de ontvanger en de opgaande aorta van de donor van begin tot zij vast op de 12 uur en 6 uur posities van de aortomie met hechtingen. Ga verder met de derde en vierde hechting op de 3 uur en 9 uur posities, waarbij u het hart na de derde hechting voorzichtig naar de rechterkant van de aorta draait. Voltooi de arteriële anastomose door één tot twee hechtingen toe te voegen aan elke tussenruimte.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de stijgende aorta van de donor of de abdominale aorta van de ontvanger niet met een tang aanraakt bij het creëren van de anastomose om weefselbeschadiging te voorkomen. - Draai de rat tegen de klok in, met het hoofd naar de linkerhand van de chirurg gericht. Verplaats de aorta van de donor naar de linkerkant van de abdominale aorta om optimaal zicht op de IVC mogelijk te maken.
- Voer een venotomie uit op de IVC, iets proximaal van de aorta-anastomose, met behulp van een 11-mesje voor punctie en een microschaar voor een adequate aanpassing van de grootte aan de diameter van de longstam van de donor. Spoel opnieuw het intracavale lumen met gehepariniseerde zoutoplossing.
- Begin met de veneuze anastomose tussen de IVC van de ontvanger en de longstam van de donor, wat het beste kan worden bereikt door onderbroken 11-0 nylon hechtingen op de achterwand van het vat te plaatsen, beginnend bij de 12 uur en 6 uur posities (gerelateerd aan de IVC), en plaats vervolgens een continue 11-0 nylon hechting op de voorwand (van de 6 uur naar de 12 uur positie).
- Bedek de anastomosen met kleine reepjes van een resorbeerbare gelatinespons en verwijder de microvasculaire klemmen die distaal beginnen. Gebruik een wattenstaafje om de sponzen lichtjes samen te drukken om een optimale hemostase te verkrijgen.
- Observeer hoe de kransslagaders van het transplantaat zich vullen op het moment dat de distale microvasculaire klemmen worden losgelaten en zorg ervoor dat het donorhart onmiddellijk begint te kloppen wanneer de proximale klem wordt losgelaten.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van het transplantaat kan intraoperatief worden gescoord van 0 tot 4 volgens een gewijzigde Stanford-score19 om een adequate transplantaatfunctie te bevestigen. - Plaats de darmen terug in de buik door ervoor te zorgen dat de arteriële en veneuze anastomose niet wordt vervormd.
- Dien meloxicam (1 mg/kg) en ethiqa XR (0,65 mg/kg) subcutaan toe terwijl het dier volledig onder narcose is om postoperatieve analgesie vast te stellen. Sluit vervolgens de buikwand met een continue 5-0 resorbeerbare vicrylhechting voordat u de huid intracutaan sluit met een 6-0 resorbeerbare vicrylhechting.
OPMERKING: Richtlijnen met betrekking tot veelvoorkomende fouten en het oplossen van problemen worden weergegeven in Tabel 2.
3. Oogsten van het neonatale donorhart
- Plaats de neonatale donorrat in een kamer die is geïnfuseerd met isofluraan (2%) voor sedatie. Dien ketamine (75 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg) en heparine (300 E/kg) intraperitoneaal toe.
- Bevestig de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen en plaats de rat in rugligging met de staart naar u toe gericht. Steriliseer de gehele thorax en buikwand driemaal afwisselend met betadine en 70% ethanol. Bedek de rat met een steriel chirurgisch laken.
- Verwijder met een 12,5x chirurgische microscoop de gehele voorste thoracale wand door te beginnen met een horizontale incisie met een scalpel met 15 mesjes bij de xyfoïde, gevolgd door verticale incisies lateraal tot aan de oksels aan beide zijden met een schaar. De voorste thoracale wand kan dan worden verwijderd door verder te gaan met een andere horizontale incisie direct onder de nek.
- Ontleed de IVC, rechter en linker vena cavae superior en longvaten met een schaar, en omcirkel en ligate vervolgens alle bloedvaten met een 7-0 zijden hechtdraad. Dien 3 ml ijskoude, kaliumrijke Krebs-Henseleit-oplossing toe aan de rechter boezem door de IVC aan te prikken met een naald van 30 G en het middenrif lichtjes naar beneden te duwen met een pincet.
- Knip de IVC, SVC's, longvaten en aorta met een schaar. Doorsnijd de longslagaders zo ver mogelijk en de aorta distaal van de brachiocephalische stam om de juiste lengte te garanderen met behulp van een scalpel met 11 mesjes.
- Scheid de longstam en de aorta ascendens met een microschaar en spoel het hart met een ijskoude cardioplegische oplossing met een spuit van 3 ml.
4. Herstel van de ontvanger en controle van het transplantaat
- Geef de rat na de operatie ruim de tijd om wakker te worden, wat meestal gebeurt in een tijdsbestek van 15 minuten, en laat hem herstellen op een verwarmingskussen.
OPMERKING: Er zijn geen antibiotica nodig vanwege het zeer lage risico op infectie en om het experimentele model niet in gevaar te brengen, en er wordt geen beperking tot voedsel of water toegepast. - Controleer na transplantatie dagelijks de transplantaatfunctie door palpatie van het getransplanteerde hart, maar bedenk dat dit soms moeilijk te beoordelen kan zijn vanwege de darmoverlay.
OPMERKING: Abdominale echocardiografie kan de levensvatbaarheid van het transplantaat nauwkeuriger meten. Voor echocardiografie verdooft u de rat lichtjes met isofluraan (1-2%) ingeademd door een neuskegel en plaatst u deze op een verwarmingskussen. Echocardiografie wordt meestal uitgevoerd op postoperatieve dag (POD) 1, POD 7 en POD 14. Om de hartslag en contractiliteit te kunnen beoordelen, kan men gemakkelijk lange- en korte-asbeelden verkrijgen (Figuur 2A, B). Om de anastomosen te evalueren, gebruikt u Doppler-echocardiografie (Figuur 3A) en bevestigt u de vorming van EFE-weefsel zoals gezien als een echoheldere endocardiale laag in de linkerventrikelholte (Figuur 3B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levensvatbaarheid en afranseling van het transplantaat
In dit werk werd de levensvatbaarheid van het transplantaat visueel beoordeeld nadat alle klemmen waren verwijderd en werd een geschatte reperfusietijd van 10-15 minuten toegestaan met een open buik voor observatie van het transplantaat. Hetzelfde scoresysteem om de levensvatbaarheid van het transplantaat objectief te verifiëren, werd gebruikt voor visuele beoordeling aan het einde van de operatie en voor de echocardiografie op POD 1, POD 7 en POD 14.
0 = geen orgaanfunctie; 1 = (rust)orgaanfunctie, slechts minimale contractie; 2 = zwakke of gedeeltelijke orgaanfunctie; 3 = contractiele snelheid of intensiteit verminderd, maar homogene orgaanfunctie; 4 = optimale samentrekking van atrium en ventrikel (120-160 slagen/min). Een score van 3 of 4 werd als een succes beoordeeld. Palpatorische evaluatie van het abdominale donortransplantaat werd gebruikt om de levensvatbaarheid van het transplantaat te controleren tussen de tijdstippen van echocardiografische beoordeling.
Sterfte en slagingspercentage van de levensvatbaarheid van het transplantaat
De procedure werd tussen oktober 2022 en december 2022 geïntroduceerd bij een nieuw chirurgisch team in het studiecentrum, en in deze periode werden 19 neonatale heterotope harttransplantaties bij ratten uitgevoerd in het studiecentrum. Het onmiddellijke operatieve overlevingspercentage was 79% en het slagingspercentage van de levensvatbaarheid van het transplantaat (met een levensvatbaar, kloppend donorhart) was 84%. De kenmerken van de procedure zijn weergegeven in tabel 3.
Van de 12 overlevende dieren hadden er 2 euthanasie nodig voorafgaand aan het studieeindpunt van 2 weken, 1 vanwege een ileus (n = 1) en de andere vanwege pijn die niet werd verlicht met pijnstillers (n = 1), en 2 werden 1 week na de operatie geëuthanaseerd.
Bij drie ratten steeg de toegepaste gemodificeerde Stanford-score van 3 naar 4 tussen onmiddellijke postoperatieve visuele beoordeling en echocardiografische evaluatie op POD 1. Van de acht overlevende ratten op het eindpunt van 14 dagen waren de gemodificeerde Stanford-scores bij echocardiografie vier voor zeven dieren en drie voor één dier. De meest voorkomende doodsoorzaak in deze serie was hemodynamisch falen als gevolg van overmatig bloedverlies als gevolg van het zeer onrijpe hart en dus fragiele donorvaten voor anastomose of lange anesthesietijden.
Histologische beoordeling van EFE-weefsel
Na CO2 -euthanasie van de ontvangende rat werd een re-laparotomie uitgevoerd onder steriele voorbereiding. Het donortransplantaat werd weggesneden en onmiddellijk in een fysiologische zoutoplossing op ijs geplaatst voor verdere verwerking. Een horizontale plak werd verwijderd ter hoogte van het middenventrikel van de rechter- en linkerventrikel, geplaatst in een inbeddingsmedium voor optimale snijtemperatuur (OCT) en ingevroren in vloeibare stikstof (Figuur 4A). Al het andere weefsel werd ingevroren met vloeibare stikstof en opgeslagen in een vriezer van -80°C voor verdere analyse. De beelden werden verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 4B-D).
Immunohistochemische kleuring als de gouden standaard om EndMT te identificeren werd uitgevoerd met behulp van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (blauw), VE-Cadherin als endotheelmarker (rood) en α-SMA als fibroblastmarker (groen). Gefosforyleerde SMAD-eiwitten en de transcriptiefactor SLUG/SNAIL werden ook gekleurd in het EFE-weefsel (figuur 5A-E)3,20.
Figuur 1: Schuine plank voor intubatie. De rat wordt op zijn rug gelegd, met de voortanden vastgezet met een touwtje en het hoofd naar de chirurg gericht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Echocardiografisch beeld van de lange as van de LV . (A) Inheems rattenhart dat een normale vulling tijdens de diastole aangeeft. (B) Donortransplantaat met stroomstagnatie binnen de LV. Verminderde volumebelasting tijdens diastole. Afkortingen: LV = linker hartkamer; MV = mitralisklep; LVOT = linkerventrikel uitstroomkanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Anastomosen en EFE-evaluatie. (A) Echocardiografisch kleuren-Doppler-onderzoek dat duidelijke arteriële (rode pijl) en veneuze (blauwe pijl) anastomosen aangeeft. (B,C): Echohelder endocardiaal oppervlak in de LV-holte indicatief voor EFE (witte pijlen). Afkortingen: LV = linker hartkamer; EFE = endocardiale fibroelastose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Macroscopische en microscopische weefselevaluatie . (A) Middenventriculaire dwarsdoorsnede door de LV en RV. De witte pijlen wijzen in de richting van het EFE-weefsel. (B) Hematoxyline-eosine, (C) Masson's trichroom (MTS) en (D) Elastine van Gieson (EVG) kleuring. De grote vergroting geeft aan dat het EFE-weefsel (zwarte pijlen) grote hoeveelheden georganiseerd collageen (blauw in MTS) en elastinevezels (zwart in EVG) bevat. Afkortingen: LV = linker hartkamer; RV = rechter ventrikel; EFE = endocardiale fibroelastose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van histologische en immunohistologische beelden. (A) Hematoxyline-eosinekleuring. (B-E) Immunohistochemische kleuring; EFE-weefsel dubbel gekleurd voor (B,C) VE-Cadherine en α-SMA, (D) CD31 en fosfo-SMAD2/SMAD3 (gelokaliseerd met de kernen gekleurd met DAPI in blauw), en (E) CD31 en SLUG/SNAIL (gelokaliseerd met de kernen gekleurd met DAPI in blauw), indicatief voor EndMT, zoals weergegeven door de witte pijlen. Afkortingen: LV = linker hartkamer; EFE = endocardiale fibroelastose; EndMT = endotheliale-naar-mesenchymale overgang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 1 liter gesteriliseerd, gedestilleerd water | |
| NaCl | 118 mmol/L |
| Kcl | 22 mmol/L |
| KH2PO4 | 1,2 mmol/l |
| MgSO4 | 1,2 mmol/L |
| NaHCO3 | 25 mmol/L |
| Glucose | 11 mmol/L |
| CaCl2 | 2,5 mmol/L |
Tabel 1: Samenstelling van de gemodificeerde Krebs-Henseleit-buffer. Cardioplegische oplossing met een hoog kaliumgehalte (22 mmol/L KCl) wordt bereid, gefilterd en 's nachts bij 4 °C bewaard.
| Veelvoorkomende fouten en probleemoplossing | ||
| Transplantaat begint niet te kloppen / kransslagaders vullen zich niet na het loslaten van de klemmen | Controleer op trombusvorming bij arteriële anastomose | |
| Controleer op ischemietijd (=totale arrestatietijd) (mag niet langer zijn dan 100 minuten) | ||
| Lange wektijd of rat wordt niet wakker na operatie | Bewaak de pulssterkte en -frequentie tijdens de operatie en verminder de inademing van isofluraan als de hemodynamica zwak is | |
| Onmiddellijke postoperatieve livide of necrotische darmen zijn verdacht voor verminderde intraoperatieve hemodynamica, vaak als gevolg van een lange anesthesietijd | ||
| Zwakke hemodynamica direct na laparotomie | Pas de isofluraanstroom aan voor anesthesie | |
| Evalueer intubatie en de juiste beweging van de borstkas: unilaterale intubatie, pneumothorax, verstopt endotracheaal lumen zijn veel voorkomende mislukkingen in het begin. | ||
| Rat wordt wakker maar sterft in de eerste 24 uur | Uitgebreid bloedverlies tijdens de operatie | |
| Als bij autopsie in de buik een verhoogde hoeveelheid bloed wordt gevonden, is dit hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het falen van de anastomose | ||
Tabel 2: Veelvoorkomende fouten en probleemoplossing. Grondige monitoring en herevaluatie van mislukte procedures zijn cruciaal om in dit model een hoge overlevingskans te bereiken.
| Gewicht van de recipiënte rat in grammen, mediaan [IQR] | 150 [50] |
| Leeftijd van de donor in dagen, mediaan [IQR] | 3 [1] |
| Donorgewicht in grammen, mediaan [IQR] | 9 [2] |
| Graftischemie tijd in minuten, mediaan [IQR] | 100 [25] |
| Postoperatief slagingspercentage, n | 16/19 (=84%) |
Tabel 3: Kenmerken van de procedure. Selectie van ontvanger en donor, ischemietijd van het transplantaat en overlevingspercentage. Afkorting: IQR = interkwartielafstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit diermodel van heterotope transplantatie van een neonataal donorrattenhart in de buik van de ontvanger creëert de mogelijkheid om EndMT-afgeleide fibrose te bestuderen door middel van gedetailleerde histologische weefselevaluatie, regulerende signaalroutes te identificeren en behandelingsopties te testen. Aangezien EndMT het onderliggende mechanisme is voor fibrotische hartziekten, heeft dit model grote waarde op het gebied van pediatrische hartchirurgie en daarbuiten. In dit model kunnen veel factoren de uitkomst van de procedure negatief beïnvloeden. Een juiste behandeling van het zeer kwetsbare weefsel als gevolg van de onvolwassenheid van het donorhart, een juiste behandeling van dieren tijdens anesthesie en microchirurgische vaardigheden op hoog niveau zijn dus basisvereisten voor het succes van dit model. Bij het uitvoeren van deze experimenten moet een optimale technische opstelling worden gebruikt, waaronder een chirurgische microscoop, beademingsapparaat voor kleine dieren en microchirurgische instrumenten. Hoewel het niet essentieel is, kan basisbewaking van de hartslag of lichaamstemperatuur nuttig zijn, vooral voor onervaren chirurgen, om de hemodynamica en diepte van de anesthesie te controleren.
Belangrijke chirurgische aspecten om in gedachten te houden zijn onder meer de onrijpheid van de neonatale donorharten, waardoor het weefsel erg kwetsbaar wordt en de opstijgende aorta en longstam kwetsbaar zijn voor scheuren. Elke behandeling moet dus met grote zorg worden uitgevoerd. Vanwege de kleine bloedvaten die voor anastomose worden gebruikt, wordt aanbevolen om arteriële anastomose uit te voeren met onderbroken hechtingen en intermitterend spoelen van de anastomoseplaats met gehepariniseerde zoutoplossing, wat helpt om trombusvorming te voorkomen. Selectie van neonatale ratten van de juiste leeftijd is vereist om het probleem op te lossen van het gebruik van harten die te onvolgroeid zijn en daarom zeer vatbaar zijn voor anastomoseruptuur. Aan de andere kant kan EndMT na een bepaalde leeftijd van ongeveer 7 dagen niet meer reproduceerbaar worden weergegeven in dit diermodel15.
EndMT is geïdentificeerd als het centrale mechanisme voor verschillende soorten hartfibrose en atherosclerose, maar het onderzoek is belemmerd door een gebrek aan in vivo modellen8. De belangrijkste ontwikkelingen op het gebied van EndMT-onderzoek beperken zich tot celkweekmodellen, die inherente beperkingen hebben 3,8,9. Bovendien zijn studies naar endocardiale endotheelcellen nog beperkter. Als alternatief worden endotheelcellen van de kransslagader vaak als vervanging gebruikt, omdat is gemeld dat ze gedeeltelijk afkomstig zijn van endocardiale cellen21. Daarom kan dit diermodel niet alleen worden gebruikt voor hartfibrose, maar ook om belangrijke pathomechanismen van flow-geïnduceerde EndMT bij atherosclerose te bestuderen. Voor aangeboren hartafwijkingen hebben we aangetoond dat we in staat zijn om de overgang van gezond endocardium naar EFE-weefsel te reproduceren via EndMT in ons rattenmodel, met EFE dat structureel lijkt op menselijk EFE-weefsel. Er is enige controverse over de cellulaire oorsprong van mesenchymale cellen in het EFE-weefsel. Clark et al.22 meldden dat epicardiale cellen bijdragen aan EFE, maar onze gegevens gaven aan dat het grootste deel van het EFE-weefsel wordt verkregen via endocardiale endotheelcellen die EndMT3 ondergaan. Experimenten op het niveau van één cel zijn momenteel aan de gang om de cellulaire oorsprong van EFE-weefsel vast te stellen.
Door middel van dit in vivo model kunnen de regulatietrajecten van EndMT worden bestudeerd. Het is aangetoond dat een onbalans, met name een toename van de TGF-ß-route en een verminderde signalering van botmorfogenetisch eiwit (BMP), een belangrijke rol speelt bij endocardiale cellen die transcriptiefactoren tot expressie brengen die EndMT reguleren. Als alternatief is ook gemeld dat Jagged/NOTCH-signalering en Wnt/ß-Catenin EndMT 3,23 induceren. De TGF-ß-route induceert de activering van transcriptiefactoren zoals SLUG, SNAIL en TWIST via SMAD-eiwitten, waardoor EndMT20,24 wordt gereguleerd. In dit diermodel hebben we deze mechanismen, die zijn bevestigd door immunohistochemische kleuring, kunnen recapituleren.
De stimulerende factoren voor EndMT-geïnduceerde fibrose in dit diermodel zijn onvolwassenheid en stagnatie van de stroom, terwijl andere modellen zijn ontworpen om EndMT te induceren door middel van genetische modificaties, hypertensie of dieetbeperkingen 9,25. In vergelijking met andere soorten zijn neonatale ratten erg onvolwassen bij de geboorte en daarom zijn ze bijzonder vatbaar voor het ondergaan van EndMT.
Wij en anderen hebben muizen gebruikt om de oorsprong van EFE beter te bestuderen via transgene afstammingstracering, maar verschillende beperkingen moeten worden besproken 3,22. Ten eerste zijn de sterftecijfers vanwege de complexiteit van het model hoger bij muizen dan bij ratten, en is de presentatie van EFE heterogener; Daarom is het RAT-model betrouwbaarder en reproduceerbaar. Echocardiografische metingen zijn cruciaal om de transplantaatfunctie gedurende de onderzoeksperiode te beoordelen, en we hebben aangetoond dat met deze maatregelen, evenals het beoordelen van de pulsatiliteit en doorgankelijkheid van de anastomosen, ook de transplantaatfunctie en contractiliteit kunnen worden bestudeerd. Met meer ervaring zouden nog meer geavanceerde analyses van het getransplanteerde hart, zoals stamanalyse van de LV, kunnen worden uitgevoerd in rattenmodellen. Het is momenteel onduidelijk of dezelfde pathofysiologische aandoening kan worden geïnduceerd bij andere grotere dieren dan knaagdieren, en dit vereist verder onderzoek.
Concluderend kan worden gesteld dat dit pediatrische diermodel de menselijke ziekte van EndMT nabootst en nuttig kan zijn om de regulatie van EndMT te bepalen en om farmacologische interventies te bestuderen om dit pathologische proces te remmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) en Single Ventricle Expansion Fund (to I.F.) en een Marietta Blau-beurs van de OeAD-GmbH uit fondsen van het Oostenrijkse federale ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Onderzoek BMBWFC (aan G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
