Summary
Questo lavoro presenta un modello animale di fibrosi indotta da transizione endoteliale a mesenchimale, come si vede nei difetti cardiaci congeniti come la stenosi aortica critica o la sindrome del cuore sinistro ipoplasico, che consente una valutazione istologica dettagliata del tessuto, l'identificazione delle vie di segnalazione regolatorie e la verifica delle opzioni di trattamento.
Abstract
La fibroelastosi endocardica (EFE), definita dall'accumulo di tessuto subendocardico, ha un impatto importante sullo sviluppo del ventricolo sinistro (LV) e preclude ai pazienti con stenosi aortica critica congenita e sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) la riparazione chirurgica biventricolare anatomica curativa. La resezione chirurgica è attualmente l'unica opzione terapeutica disponibile, ma l'EFE spesso si ripresenta, a volte con un pattern di crescita ancora più infiltrativo nel miocardio adiacente.
Per comprendere meglio i meccanismi alla base dell'EFE e per esplorare le strategie terapeutiche, è stato sviluppato un modello animale adatto alla sperimentazione preclinica. Il modello animale prende in considerazione che l'EFE è una malattia del cuore immaturo ed è associata a disturbi del flusso, come supportato dalle osservazioni cliniche. Pertanto, il trapianto di cuore eterotopico di cuori di donatori di ratti neonatali è la base di questo modello.
Il cuore di un ratto neonatale viene trapiantato nell'addome di un ratto adolescente e collegato all'aorta infrarenale e alla vena cava inferiore del ricevente. Mentre la perfusione delle arterie coronarie preserva la vitalità del cuore del donatore, il ristagno del flusso all'interno del ventricolo sinistro induce la crescita dell'EFE nel cuore molto immaturo. Il meccanismo alla base della formazione di EFE è la transizione delle cellule endoteliali endocardiche in cellule mesenchimali (EndMT), che è un meccanismo ben descritto dello sviluppo embrionale precoce delle valvole e dei setti, ma anche la principale causa di fibrosi nell'insufficienza cardiaca. La formazione di EFE può essere osservata macroscopicamente entro pochi giorni dal trapianto. L'ecocardiografia transaddominale viene utilizzata per monitorare la vitalità dell'innesto, la contrattilità e la pervietà delle anastomosi. Dopo l'eutanasia, il tessuto EFE viene raccolto e mostra le stesse caratteristiche istopatologiche del tessuto EFE umano di pazienti affetti da HLHS.
Questo modello in vivo consente di studiare i meccanismi di sviluppo dell'EFE nel cuore e di testare le opzioni di trattamento per prevenire la formazione di questo tessuto patologico e offre l'opportunità di un esame più generalizzato della fibrosi indotta da EndMT.
Introduction
La fibroelastosi endocardica (EFE), definita dall'accumulo di collagene e fibre elastiche nel tessuto subendocardico, si presenta come un endocardio ispessito perlaceo o opaco; L'EFE subisce una crescita più attiva durante il periodo fetale e la prima infanzia1. In uno studio autoptico, il 70% dei casi con sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) è stato associato alla presenza di EFE2.
Le cellule che esprimono marcatori per i fibroblasti sono la principale popolazione cellulare in EFE, ma queste cellule esprimono contemporaneamente anche marcatori endoteliali endocardici, che è un'indicazione dell'origine di queste cellule EFE. Il nostro gruppo ha precedentemente stabilito che il meccanismo alla base della formazione di EFE coinvolge un cambiamento fenotipico delle cellule endoteliali endocardiche in fibroblasti attraverso la transizione endoteliale a mesenchimale (EndMT)3. L'EndMT può essere rilevata utilizzando la doppia colorazione immunoistochimica per marcatori endoteliali come il cluster di differenziazione (CD) 31 o l'endotelio vascolare (VE)-caderina (CD144) e marcatori di fibroblasti (ad esempio, actina alfa-muscolare liscia, α-SMA). Inoltre, abbiamo anche precedentemente stabilito il ruolo regolatore della via TGF-ß in questo processo con l'attivazione dei fattori di trascrizione SLUG, SNAIL, e TWIST3.
L'EndMT è un processo fisiologico che si verifica durante lo sviluppo cardiaco embrionale e porta alla formazione dei setti e delle valvole dai cuscinetti endocardici4, ma provoca anche fibrosi d'organo nell'insufficienza cardiaca, nella fibrosi renale o nel cancro e svolge un ruolo chiave nell'aterosclerosi vascolare 5,6,7,8. L'EndMT nella fibrosi cardiaca è regolata principalmente attraverso la via TGF-β, come abbiamo riportato 3,9. Sono stati descritti vari stimoli per indurre l'EndMT: infiammazione10, ipossia11, alterazioni meccaniche12 e disturbi del flusso, comprese le alterazioni del flusso sanguigno intracavitario13, e l'EndMT può anche essere una conseguenza di una malattia genetica14.
Questo modello animale è stato sviluppato utilizzando i componenti chiave dello sviluppo dell'EFE cardiaca, che sono l'immaturità e le alterazioni del flusso sanguigno intracavitario, in particolare il ristagno del flusso. L'immaturità è stata soddisfatta utilizzando cuori di ratto neonatale come donatori, poiché i ratti neonatali sono noti per essere immaturi dal punto di vista dello sviluppo subito dopo la nascita. Il trapianto di cuore eterotopico ha offerto la possibilità di limitare il flusso intracavitario15.
Da un punto di vista clinico, questo modello animale consente di studiare meglio l'impatto di EndMT sul ventricolo sinistro (LV) in crescita. La restrizione della crescita imposta al cuore fetale e neonatale attraverso la formazione di EFE indotta da EndMT16 preclude ai pazienti con ostruzioni del tratto di efflusso ventricolare sinistro (LVOTO) come la stenosi aortica critica congenita e la sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) la riparazione chirurgica biventricolare anatomica curativa17. Questo modello animale facilita lo studio dei meccanismi cellulari e della regolazione della formazione tissutale attraverso l'EndMT e consente di testare le opzioni di trattamento farmacologico 3,18.
L'ecocardiografia transaddominale viene utilizzata per monitorare la vitalità dell'innesto, la contrattilità e la pervietà delle anastomosi. Dopo l'eutanasia, la formazione di EFE può essere osservata macroscopicamente entro 3 giorni dal trapianto. Il tessuto EFE mostra le stesse caratteristiche istopatologiche del tessuto EFE umano di pazienti con LVOTO.
Quindi, questo modello animale, sebbene sviluppato per l'uso pediatrico nello spettro dell'HLHS, può essere applicato quando si studiano varie malattie basate sul meccanismo molecolare di EndMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in accordo con il Consiglio Nazionale delle Ricerche. 2011. Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio: ottava edizione. I protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Boston Children's Hospital.
Prima dell'intervento chirurgico, tutti gli strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave a vapore e il tampone Krebs-Henseleit modificato, con una concentrazione finale di 22 mmol/L KCl, viene preparato come soluzione cardioplegica (Tabella 1). La soluzione viene sterilizzata con filtro e conservata a 4 °C per una notte. Un microscopio operatorio (12,5x) è necessario per la procedura di trapianto di cuore di ratto neonatale eterotopico.
1. Preparazione e anestesia
- Utilizzare come riceventi ratti Lewis maschi/femmine con un peso di circa 150 g (5-6 settimane di età).
- Per iniziare, radere generosamente l'addome del ratto con un rasoio.
- Mettere il ratto in una camera di isoflurano e attivare il flusso di ossigeno a 2 L/min con isoflurano al 2% fino a quando l'animale non è adeguatamente sedato ma respira ancora spontaneamente. Iniettare 45 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale (IP), oltre a 300 U/kg di eparina. Confermare la corretta anestesia con un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
NOTA: Monitorare attentamente la respirazione spontanea e la frequenza cardiaca attraverso la palpazione del torace per garantire uno stato emodinamico stabile durante l'intero processo. - Per l'intubazione, posizionare il ratto su un ripiano obliquo (Figura 1), fissare i denti anteriori con una corda e posizionare la testa rivolta verso il chirurgo.
- Posizionare la luce all'esterno del collo sull'area delle corde vocali, afferrare la lingua con due dita e spingerla leggermente verso l'alto e verso sinistra per fornire una visione ottimale per l'intubazione. Utilizzare una cannula da 18 G, 2 in per un ratto da 100-150 g. Fissare il tubo intratracheale con del nastro adesivo.
NOTA: Per l'intubazione si consigliano lenti chirurgiche con ingrandimento 3,5x. - Collegare la cannula per intubazione al ventilatore per animali di piccola taglia e regolare le impostazioni secondo le istruzioni del produttore in base alle dimensioni dell'animale.
NOTA: Utilizzare le seguenti impostazioni per un ratto di 150 g: modalità volume; frequenza respiratoria, 55/min; volume corrente, 1,3 mL 50 % rapporto I/E, ma questo può essere regolato in modo appropriato secondo necessità. Assicurare un corretto movimento toracico bilaterale e uniforme e somministrare isoflurano in modo continuo allo 0,5%-2% attraverso il ventilatore. - Posizionare il ratto su un termoforo (per mantenere la normale temperatura corporea) in posizione supina con la coda rivolta verso il chirurgo. Sterilizzare l'addome tre volte con una soluzione di betadine e il 70% di etanolo alternativamente. Somministrare il lubrificante per gli occhi e coprire il ratto con un telo chirurgico sterile, lasciando scoperto l'addome.
2. Preparazione chirurgica e trapianto eterotopico del cuore del donatore neonatale nel ratto ricevente
- Eseguire una laparotomia della linea mediana utilizzando un bisturi a 15 lame per l'incisione cutanea e utilizzare le forbici per aprire la parete addominale anteriore, seguita dall'esposizione smussata dell'aorta addominale retroperitoneale e della vena cava inferiore (IVC) con applicatori con punta di cotone.
- Mobilizzare l'intestino (compreso il colon discendente) e posizionarlo verso il quadrante superiore destro. Coprire l'intestino con una garza calda imbevuta di soluzione salina. Utilizzare divaricatori per garantire un'esposizione ottimale dell'IVC e dell'aorta addominale.
- Eseguire una dissezione smussata dell'IVC infrarenale e dell'aorta addominale verso la biforcazione. Legare tutte le arterie e le vene ramificate infrarenali (ad es. arteria mesenterica inferiore e arterie linfonodali) con una sutura di nylon 10-0.
NOTA: C'è una grande variabilità nell'anatomia di questi rami laterali. Monitora visivamente il polso e la frequenza cardiaca dell'aorta quando non sono disponibili altri monitoraggi emodinamici. Valutare la corretta profondità dell'anestesia ogni 15 minuti attraverso un test di pizzicamento delle dita dei piedi. Regolare di conseguenza la concentrazione di isoflurano. - Dopo che il cuore del donatore è stato prelevato da un ratto neonatale, consegnare il cuore asportato in condizioni sterili in una vasca chirurgica contenente il tampone Krebs-Henseleit sul campo operatorio. Irrigare il cuore del donatore in modo intermittente con una soluzione cardioplegica ghiacciata.
NOTA: Quando è disponibile un secondo chirurgo, il cuore deve essere preparato contemporaneamente, poiché un secondo chirurgo riduce il tempo di anestesia totale dell'animale ricevente e il tempo di ischemia del cuore del donatore. Quando non è disponibile un secondo chirurgo, coprire l'addome del ricevente con soluzione salina calda e monitorare l'animale durante la procedura di raccolta. - Applicare quattro piccole pinze vascolari atraumatiche ai segmenti distale e prossimale dell'aorta infrarenale e all'IVC. Se necessario, occludere temporaneamente un vaso renale sfavorevole con una sutura di seta 7-0 e rilasciare la sutura dopo la procedura. Posizionare una sutura di nylon 10-0 verticalmente sulla parete anteriore dell'aorta per facilitare l'aortotomia. Eseguire un'aortotomia con due piccoli tagli orizzontali (a forma di cuneo) con microforbici tirando leggermente verso l'alto la sutura.
NOTA: Per rimuovere eventuali coaguli di sangue, si consiglia di lavare il lume aortico con soluzione fisiologica eparinizzata. - Posizionare il cuore del donatore sul lato sinistro (dal punto di vista dell'animale) dell'aorta e fissare l'aorta infrarenale del ricevente e l'aorta ascendente del donatore da un lato all'altro nelle posizioni delle ore 12 e delle ore 6 dell'aortotomia con punti di sutura. Continuare con la terza e la quarta sutura a ore 3 e a ore 9, capovolgendo delicatamente il cuore sul lato destro dell'aorta dopo la terza sutura. Completare l'anastomosi arteriosa aggiungendo da una a due suture ad ogni intercapedine.
NOTA: È necessario prestare attenzione a evitare di toccare l'aorta ascendente del donatore o l'aorta addominale del ricevente con il forcipe durante la creazione dell'anastomosi per evitare danni ai tessuti. - Ruotare il ratto in senso antiorario, con la testa rivolta verso la mano sinistra del chirurgo. Spostare l'aorta del donatore sul lato sinistro dell'aorta addominale per consentire una visione ottimale dell'IVC.
- Eseguire una venotomia sull'IVC, leggermente prossimale all'anastomosi aortica, utilizzando una lama 11 per la puntura e microforbici per un'adeguata regolazione dimensionale in base al diametro del tronco polmonare del donatore. Anche in questo caso, lavare il lume intracavale con soluzione fisiologica.
- Iniziare con l'anastomosi venosa tra l'IVC del ricevente e il tronco polmonare del donatore, che si ottiene al meglio posizionando suture di nylon 11-0 interrotte sulla parete posteriore del vaso, a partire dalle posizioni delle ore 12 e delle ore 6 (relative all'IVC), quindi posizionare una sutura continua in nylon 11-0 sulla parete anteriore (dalle ore 6 verso la posizione delle ore 12).
- Coprire le anastomosi con piccole strisce di una spugna di gelatina assorbibile e rimuovere le pinze microvascolari a partire da quella distale. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per comprimere leggermente le spugne per ottenere un'emostasi ottimale.
- Osservare il riempimento dei vasi coronarici dell'innesto al momento del rilascio delle pinze microvascolari distali e assicurarsi che il cuore del donatore inizi a battere immediatamente quando la pinza prossimale viene rilasciata.
NOTA: La vitalità dell'innesto può essere valutata da 0 a 4 intraoperatoriamente secondo un punteggio di Stanford modificato19 per confermare un'adeguata funzione dell'innesto. - Riposizionare l'intestino nell'addome facendo attenzione a non distorcere l'anastomosi arteriosa e venosa.
- Somministrare meloxicam (1 mg/kg) ed ethiqa XR (0,65 mg/kg) per via sottocutanea mentre l'animale è completamente anestetizzato per accertare l'analgesia postoperatoria. Quindi, chiudere la parete addominale con una sutura continua 5-0 riassorbibile in viryl prima di chiudere la pelle con una sutura in vicryl riassorbibile 6-0 per via intracutanea.
NOTA: le linee guida relative agli errori comuni e alla risoluzione dei problemi sono presentate nella Tabella 2.
3. Prelievo del cuore del donatore neonatale
- Collocare il ratto donatore neonatale in una camera insufflata con isoflurano (2%) per la sedazione. Somministrare ketamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), nonché eparina (300 U/kg) per via intraperitoneale.
- Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi e posizionare il ratto in posizione supina con la coda rivolta verso di te. Sterilizzare l'intero torace e la parete addominale con betadine ed etanolo al 70% tre volte alternativamente. Coprire il ratto con un telo chirurgico sterile.
- Utilizzando un microscopio operatorio 12,5x, rimuovere l'intera parete toracica anteriore iniziando con un'incisione orizzontale utilizzando un bisturi a 15 lame in corrispondenza dell'ipfoide, seguita da incisioni verticali lateralmente fino alle ascelle su entrambi i lati con le forbici. La parete toracica anteriore può quindi essere rimossa continuando con un'altra incisione orizzontale proprio sotto il collo.
- Sezionare l'IVC, la vena cava superiore destra e sinistra e i vasi polmonari con le forbici, quindi circondare e legare tutti i vasi con una sutura di seta 7-0. Somministrare 3 mL di soluzione di Krebs-Henseleit modificata ghiacciata e ad alto contenuto di potassio nell'atrio destro perforando l'IVC con un ago da 30 G e spingendo leggermente il diaframma verso il basso con una pinza.
- Tagliare l'IVC, le SVC, i vasi polmonari e l'aorta con le forbici. Eseguire il transetto delle arterie polmonari il più lontano possibile e dell'aorta distale rispetto al tronco brachiocefalico per garantire una lunghezza adeguata utilizzando un bisturi a 11 lame.
- Separare il tronco polmonare e l'aorta ascendente con microforbici e sciacquare il cuore con una soluzione cardioplegica ghiacciata utilizzando una siringa da 3 ml.
4. Recupero del ricevente e monitoraggio dell'innesto
- Dopo l'intervento chirurgico, dai al ratto tutto il tempo per svegliarsi, che di solito si verifica in una finestra temporale di 15 minuti, e lascialo recuperare su un termoforo.
NOTA: Non sono necessari antibiotici a causa del bassissimo rischio di infezione e per non compromettere il modello sperimentale, e non viene applicata alcuna restrizione al cibo o all'acqua. - Dopo il trapianto, monitorare quotidianamente la funzione dell'innesto mediante palpazione del cuore trapiantato, ma considerare che questo a volte può essere difficile da valutare a causa della sovrapposizione intestinale.
NOTA: L'ecocardiografia addominale può misurare in modo più accurato la vitalità dell'innesto. Per l'ecocardiografia, sedare leggermente il ratto con isoflurano (1-2%) inalato attraverso un cono nasale e posizionarlo su un termoforo. L'ecocardiografia viene solitamente eseguita il giorno postoperatorio (POD) 1, POD 7 e POD 14. Per consentire la valutazione della frequenza cardiaca e della contrattilità, è possibile ottenere facilmente viste dell'asse lungo e dell'asse corto (Figura 2A, B). Per valutare le anastomosi, utilizzare l'ecocardiografia Doppler (Figura 3A) e confermare la formazione di tessuto EFE come uno strato endocardico eco-luminoso all'interno della cavità ventricolare sinistra (Figura 3B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vitalità e battitura dell'innesto
In questo lavoro, la vitalità dell'innesto è stata valutata visivamente dopo che tutte le pinze erano state rimosse ed è stato consentito un tempo di riperfusione approssimativo di 10-15 minuti con un addome aperto per l'osservazione dell'innesto. Lo stesso sistema di punteggio per verificare oggettivamente la vitalità del trapianto è stato utilizzato per la valutazione visiva al termine dell'intervento chirurgico e per l'ecocardiografia su POD 1, POD 7 e POD 14.
0 = nessuna funzione d'organo; 1 = funzione dell'organo (a riposo), contrazione minima; 2 = funzione d'organo debole o parziale; 3 = riduzione del tasso o dell'intensità contrattile, ma funzione omogenea dell'organo; 4 = contrazione ottimale dell'atrio e del ventricolo (120-160 battiti/min). Un punteggio di 3 o 4 è stato valutato come un successo. La valutazione palpatoria dell'innesto da donatore addominale è stata utilizzata per monitorare la vitalità dell'innesto tra i punti temporali della valutazione ecocardiografica.
Mortalità e tasso di successo della vitalità dell'innesto
La procedura è stata introdotta in un nuovo team chirurgico presso il centro di studio tra ottobre 2022 e dicembre 2022 e durante questo periodo sono stati eseguiti 19 trapianti di cuore di ratto eterotopico neonatale presso il centro di studio. Il tasso di sopravvivenza operatoria immediata è stato del 79% e il tasso di successo della vitalità del trapianto (mostrando un cuore da donatore vitale e pulsante) è stato dell'84%. Le caratteristiche della procedura sono presentate nella tabella 3.
Tra i 12 animali sopravvissuti, 2 hanno richiesto l'eutanasia prima dell'endpoint dello studio di 2 settimane, 1 a causa di un ileo (n = 1) e l'altro a causa del dolore non alleviato con farmaci antidolorifici (n = 1) e 2 sono stati soppressi in base alla progettazione 1 settimana dopo l'intervento chirurgico.
In tre ratti, il punteggio di Stanford modificato applicato è aumentato da 3 a 4 tra la classificazione visiva postoperatoria immediata e la valutazione ecocardiografica su POD 1. Tra gli otto ratti sopravvissuti all'endpoint di 14 giorni, i punteggi di Stanford modificati all'ecocardiografia erano quattro per sette animali e tre per un animale. La causa più comune di morte in questa serie è stata l'insufficienza emodinamica dovuta all'eccessiva perdita di sangue come conseguenza del cuore molto immaturo e, quindi, dei vasi donatori fragili per l'anastomosi o i lunghi tempi di anestesia.
Valutazione istologica del tessuto EFE
Dopo l'eutanasia con CO2 del ratto ricevente, è stata eseguita una re-laparotomia in preparazione sterile. L'innesto del donatore è stato asportato e immediatamente posto in una soluzione fisiologica salina su ghiaccio per un'ulteriore lavorazione. Una fetta orizzontale è stata resecata a livello ventricolare medio del ventricolo destro e sinistro, posta nel mezzo di inclusione a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelata in azoto liquido (Figura 4A). Tutto il resto del tessuto è stato congelato con azoto liquido e conservato in un congelatore a -80°C per ulteriori analisi. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio invertito (Figura 4B-D).
La colorazione immunoistochimica come gold standard per identificare l'EndMT è stata eseguita utilizzando il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (blu), la VE-Caderina come marcatore endoteliale (rosso) e la α-SMA come marcatore dei fibroblasti (verde). Anche le proteine SMAD fosforilate e il fattore di trascrizione SLUG/SNAIL sono stati colorati nel tessuto EFE (Figura 5A-E)3,20.
Figura 1: Ripiano obliquo per l'intubazione. Il ratto viene posizionato sulla schiena, con i denti anteriori fissati con una corda e la testa rivolta verso il chirurgo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Vista ecocardiografica dell'asse longitudinale del ventricolo sinistro. (A) Cuore di ratto nativo che indica un riempimento normale durante la diastole. (B) Innesto donatore con ristagno di flusso all'interno del ventricolo sinistro. Diminuzione del carico di volume durante la diastole. Abbreviazioni: LV = ventricolo sinistro; MV = valvola mitrale; LVOT = tratto di efflusso ventricolare sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Anastomosi e valutazione dell'EFE. (A) Studio ecocardiografico color Doppler che indica anastomosi arteriose pervie (freccia rossa) e venose (freccia blu). (B,C): Superficie endocardica eco-luminosa all'interno della cavità ventricolare sinistra indicativa di EFE (frecce bianche). Abbreviazioni: LV = ventricolo sinistro; EFE = fibroelastosi endocardica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione macroscopica e microscopica dei tessuti . (A) Sezione trasversale ventricolare media attraverso il ventricolo sinistro e il ventricolo sinistro. Le frecce bianche puntano verso il tessuto EFE. (B) colorazione con ematossilina-eosina, (C) tricromica di Masson (MTS) e (D) colorazione con elastina van Gieson (EVG). L'ampio ingrandimento indica che il tessuto EFE (frecce nere) contiene elevate quantità di collagene organizzato (blu in MTS) e fibre di elastina (nero in EVG). Abbreviazioni: LV = ventricolo sinistro; RV = ventricolo destro; EFE = fibroelastosi endocardica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Confronto tra immagini istologiche e immunoistologiche. (A) Colorazione con ematossilina-eosina. (B-E) Colorazione immunoistochimica; Tessuto EFE doppiamente colorato per (B,C) VE-Caderina e α-SMA, (D) CD31 e fosfo-SMAD2/SMAD3 (colocalizzato con i nuclei colorati con DAPI in blu) e (E) CD31 e SLUG/SNAIL (colocalizzato con i nuclei colorati con DAPI in blu), indicativi di EndMT, come mostrato dalle frecce bianche. Abbreviazioni: LV = ventricolo sinistro; EFE = fibroelastosi endocardica; EndMT = transizione da endoteliale a mesenchimale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 1 litro di acqua distillata sterilizzata | |
| NaCl | 118 mmol/L |
| Kcl | 22 mmol/L |
| KH2PO4 | 1,2 mmol/l |
| MgSO4 | 1,2 mmol/L |
| NaHCO3 | 25 mmol/L |
| Glucosio | 11 mmol/L |
| CaCl2 | 2,5 mmol/L |
Tabella 1: Composizione del tampone di Krebs-Henseleit modificato. La soluzione cardioplegica ad alto contenuto di potassio (22 mmol/L KCl) viene preparata, sterilizzata con filtro e conservata a 4 °C per una notte.
| Errori comuni e risoluzione dei problemi | ||
| L'innesto non inizia a battere/le arterie coronarie non si riempiono dopo aver rilasciato le pinze | Verificare la formazione di trombi in anastomosi arteriosa | |
| Verificare il tempo di ischemia (=tempo totale di arresto) (non deve superare i 100 minuti) | ||
| Tempo di sveglia lungo o il ratto non si sveglia dopo l'intervento chirurgico | Monitorare la forza e la frequenza del polso durante l'intervento chirurgico e ridurre l'inalazione di isoflurano, se l'emodinamica è debole | |
| L'intestino livido o necrotico immediatamente postoperatorio è sospetto di una ridotta emodinamica intraoperatoria, spesso a causa del lungo tempo di anestesia | ||
| Emodinamica debole subito dopo la laparotomia | Regolare il flusso di isoflurano per l'anestesia | |
| Valutare l'intubazione e il corretto movimento del torace: l'intubazione unilaterale, lo pneumotorace, l'ostruzione del lume endotracheale sono fallimenti comuni all'inizio. | ||
| Il topo si sveglia ma muore nelle prime 24 ore | Estesa perdita di sangue durante l'intervento chirurgico | |
| Se all'autopsia si riscontra un aumento della quantità di sangue nell'addome, è molto probabile che sia dovuto al fallimento dell'anastomosi | ||
Tabella 2: Errori comuni e risoluzione dei problemi. Un monitoraggio approfondito e una rivalutazione delle procedure non riuscite sono fondamentali per ottenere un alto tasso di sopravvivenza in questo modello.
| Peso del ratto ricevente in grammi, mediana [IQR] | 150 [50] |
| Età del donatore in giorni, mediana [IQR] | 3 [1] |
| Peso del donatore in grammi, mediana [IQR] | 9 [2] |
| Tempo di ischemia dell'innesto in minuti, mediano [IQR] | 100 [25] |
| Tasso di successo postoperatorio, n | 16/19 (=84%) |
Tabella 3: Caratteristiche della procedura. Selezione del ricevente e del donatore, tempo di ischemia dell'innesto e tasso di sopravvivenza. Abbreviazione: IQR = intervallo interquartile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo modello animale di trapianto eterotopico di cuore di ratto donatore neonatale nell'addome del ricevente crea la possibilità di studiare la fibrosi derivata da EndMT attraverso una valutazione istologica dettagliata del tessuto, identificare le vie di segnalazione regolatorie e testare le opzioni di trattamento. Poiché l'EndMT è il meccanismo alla base delle malattie fibrotiche del cuore, questo modello ha un grande valore nel campo della cardiochirurgia pediatrica e non solo. In questo modello, molti fattori possono influenzare negativamente l'esito della procedura. Pertanto, la corretta manipolazione del tessuto molto fragile a causa dell'immaturità del cuore del donatore, la corretta manipolazione dell'animale durante l'anestesia e le competenze microchirurgiche di alto livello sono requisiti fondamentali per il successo di questo modello. Durante l'esecuzione di questi esperimenti è necessario utilizzare una configurazione tecnica ottimale, che includa un microscopio operatorio, un ventilatore per piccoli animali e strumenti microchirurgici. Sebbene non sia indispensabile, il monitoraggio di base della frequenza cardiaca o della temperatura corporea potrebbe essere utile, soprattutto per i chirurghi inesperti, al fine di monitorare l'emodinamica e la profondità dell'anestesia.
Tra gli aspetti chirurgici importanti da tenere in considerazione c'è l'immaturità dei cuori del donatore neonatale, che rende il tessuto molto fragile e lascia l'aorta ascendente e il tronco polmonare vulnerabili alle lacerazioni. Pertanto, qualsiasi manipolazione deve essere eseguita con grande attenzione. A causa dei piccoli vasi utilizzati per l'anastomosi, si consiglia di eseguire l'anastomosi arteriosa con punti interrotti e lavaggio intermittente del sito di anastomosi con soluzione fisiologica eparinizzata, che aiuta a evitare la formazione di trombi. La selezione di ratti neonatali di età appropriata è necessaria per superare il problema dell'utilizzo di cuori troppo immaturi e, quindi, altamente suscettibili alla rottura dell'anastomosi. D'altra parte, dopo una certa età di circa 7 giorni, EndMT non può più essere mostrato in modo riproducibile in questo modello animale15.
L'EndMT è stato identificato come il meccanismo centrale per vari tipi di fibrosi cardiaca e aterosclerosi, ma la ricerca è stata ostacolata dalla mancanza di modelli in vivo 8. I principali sviluppi nel campo della ricerca EndMT sono limitati ai modelli di coltura cellulare, che hanno limitazioni intrinseche 3,8,9. Inoltre, gli studi sulle cellule endoteliali endocardiche sono ancora più limitati. In alternativa, le cellule endoteliali coronarie sono spesso utilizzate come sostituti, poiché è stato riportato che provengono in parte da cellule endocardiche21. Quindi, questo modello animale può essere utilizzato non solo per la fibrosi cardiaca, ma per studiare importanti meccanismi patopatologici dell'EndMT indotta dal flusso nell'aterosclerosi. Per le cardiopatie congenite, abbiamo dimostrato la capacità di riprodurre la transizione dall'endocardio sano al tessuto EFE attraverso EndMT nel nostro modello di ratto, con EFE che assomiglia strutturalmente al tessuto EFE umano. C'è una certa controversia riguardo all'origine cellulare delle cellule mesenchimali all'interno del tessuto EFE. Clark et al.22 hanno riportato che le cellule epicardiche contribuiscono all'EFE, ma i nostri dati hanno indicato che la maggior parte del tessuto EFE deriva da cellule endoteliali endocardiche sottoposte a EndMT3. Sono attualmente in corso esperimenti a livello di singola cellula per accertare l'origine cellulare del tessuto EFE.
Attraverso questo modello in vivo, è possibile studiare i percorsi regolatori dell'EndMT. È stato dimostrato che uno squilibrio, in particolare un aumento della via TGF-ß e una compromissione della segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP), svolgono un ruolo importante nelle cellule endocardiche che esprimono i fattori di trascrizione che regolano EndMT. In alternativa, è stato riportato che anche la segnalazione Jagged/NOTCH e la Wnt/ß-catenina inducono EndMT 3,23. La via TGF-ß induce l'attivazione di fattori di trascrizione come SLUG, SLUG e TWIST tramite proteine SMAD, regolando così EndMT20,24. In questo modello animale, siamo stati in grado di ricapitolare questi meccanismi, che sono stati confermati dalla colorazione immunoistochimica.
I fattori stimolanti per la fibrosi indotta da EndMT in questo modello animale sono l'immaturità e il ristagno del flusso, mentre altri modelli sono progettati per indurre EndMT attraverso modificazioni genetiche, ipertensione o restrizioni dietetiche 9,25. Rispetto ad altre specie, i ratti neonatali sono molto immaturi alla nascita e, pertanto, sono particolarmente suscettibili di sottoporsi a EndMT.
Noi e altri abbiamo usato i topi per studiare meglio le origini dell'EFE attraverso il tracciamento del lignaggio transgenico, ma diverse limitazioni devono essere discusse 3,22. In primo luogo, a causa della complessità del modello, i tassi di mortalità sono più alti nei topi rispetto ai ratti e la presentazione dell'EFE è più eterogenea; Pertanto, il modello RAT è più affidabile e riproducibile. Le misure ecocardiografiche sono cruciali per valutare la funzione del trapianto durante tutto il periodo di studio e abbiamo dimostrato che con queste misure, oltre a valutare la pulsatilità e la pervietà delle anastomosi, è possibile studiare anche la funzione del trapianto e la contrattilità. Con una maggiore esperienza, analisi ancora più avanzate del cuore trapiantato, come l'analisi della deformazione del ventricolo sinistro, potrebbero essere eseguite in modelli di ratto. Al momento non è chiaro se la stessa condizione fisiopatologica possa essere indotta in animali più grandi diversi dai roditori, e ciò richiede ulteriori indagini.
In conclusione, questo modello animale pediatrico imita la malattia umana di EndMT e può essere utile per determinare la regolazione di EndMT e per studiare interventi farmacologici per inibire questo processo patologico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) e Single Ventricle Expansion Fund (a I.F.) e da una borsa di studio Marietta Blau della OeAD-GmbH da fondi forniti dal Ministero Federale Austriaco dell'Istruzione, della Scienza e della Ricerca BMBWFC (a G.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R.
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G.
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
