Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Abstract

Tuberculose (tbc), wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak door een infectieus agens, doodde in 2022 1,6 miljoen mensen en werd alleen overtroffen door COVID-19 tijdens de pandemie van 2019-2021. De ziekte wordt veroorzaakt door de bacterie Mycobacterium tuberculosis (M.tb). De Mycobacterium bovis-stam Bacillus Calmette-Guérin (BCG), het enige tbc-vaccin, is het oudste goedgekeurde vaccin ter wereld dat nog steeds in gebruik is. Momenteel zijn er 12 vaccins in klinische proeven en tientallen vaccins in preklinische ontwikkeling. De voorkeursmethode die wordt gebruikt om de werkzaamheid van tbc-vaccins in preklinische onderzoeken te beoordelen, is de telling van bacteriekolonies door middel van de kolonievormende eenheden (CFU)-test. Deze tijdrovende test duurt 4 tot 6 weken, vereist aanzienlijke laboratorium- en incubatorruimte, heeft hoge reagenskosten en is gevoelig voor contaminatie. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor kolonietelling, de micro-CFU (mCFU), die een eenvoudige en snelle oplossing biedt om de werkzaamheidsresultaten van het M.tb-vaccin te analyseren. De mCFU-test vereist tien keer minder reagentia, verkort de incubatietijd met een factor drie, duurt 1 tot 2 weken om te voltooien, vermindert de laboratoriumruimte en de reagenskosten en minimaliseert de gezondheids- en veiligheidsrisico's die gepaard gaan met het werken met grote aantallen M.tb. Om de werkzaamheid van een tbc-vaccin te evalueren, kunnen bovendien monsters worden verkregen uit verschillende bronnen, waaronder weefsels van gevaccineerde dieren die besmet zijn met mycobacteriën. We beschrijven ook een geoptimaliseerde methode om een eencellige, uniforme en hoogwaardige mycobacteriële cultuur te produceren voor infectiestudies. Ten slotte stellen we voor dat deze methoden universeel worden toegepast voor preklinische studies naar de bepaling van de werkzaamheid van vaccins, wat uiteindelijk leidt tot tijdsbesparing bij de ontwikkeling van vaccins tegen tuberculose.

Introduction

Tuberculose (tbc) is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak door een enkel infectieus agens, bacterie Mycobacterium tuberculosis (M.tb), die meer mensen doodt dan welke andere ziekteverwekker dan ook. In 2021 was tuberculose verantwoordelijk voor 1,6 miljoen sterfgevallen en werd het overtroffen door COVID-19 tijdens de pandemie van 2019-20211. Bovendien was volgens het wereldwijde tbc-rapport van de Wereldgezondheidsorganisatie van 2022 de COVID-19-pandemie verantwoordelijk voor een toename van nieuwe tbc-gevallen. De WHO meldt ook grote dalingen in het aantal mensen met de diagnose tbc in deze periode, waardoor het aantal tbc-gevallenverder zou kunnen toenemen.

De Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is een levend verzwakte stam van de pathogene Mycobacterium bovis, die meer dan 100 jaar geleden voor het eerst als vaccin werd gebruikt. Dit is het enige vaccin tegen tuberculose en is het oudste goedgekeurde vaccin ter wereld dat nog steeds in gebruik is 2,3. Momenteel zijn er 12 vaccins in verschillende fasen van klinische proeven4, en tientallen vaccins zijn in preklinische ontwikkeling 5,6. Preklinische beoordeling van vaccins tegen tuberculose omvat de evaluatie van de veiligheid en immunogeniciteit7, die kan worden verkregen in diverse diermodellen zoals zebravissen, muizen, cavia's, konijnen, runderen en niet-menselijke primaten 8,9,10. Bovendien vereist het beoordelen van het vermogen van een vaccin om bescherming te induceren tegen M.tb-infectie en/of -overdracht, d.w.z. de werkzaamheid van het vaccin, een M.tb-provocatie in vivo 5,11. Interessant is dat BCG-vaccinatie niet-specifieke effecten induceert die de overleving van andere bacteriële en virale pathogenen beïnvloeden12,13 via het mechanisme van getrainde immuniteit14. Om de levensvatbare bacteriële belasting in een besmet dier te kwantificeren, is de voorkeursmethode de telling van bacteriekolonies door middel van de kolonievormende eenheden (CFU) assay 5,15. CFU is een eenheid die een schatting maakt van het aantal micro-organismen (bacteriën of schimmels) dat kolonies vormt onder specifieke groeiomstandigheden. CFU's zijn afkomstig van levensvatbare en replicatieve micro-organismen, en het absolute aantal levende micro-organismen in elke kolonie is moeilijk in te schatten. Het is onzeker of een kolonie is ontstaan uit één of meerdere micro-organismen. De CFU-eenheid weerspiegelt deze onzekerheid, vandaar dat er een grote variabiliteit kan worden waargenomen in replicaten van hetzelfde monster. Deze tijdrovende test vereist gespecialiseerde technici die zijn opgeleid om te werken in een faciliteit van bioveiligheidsniveau 3 (BSL3), een aanzienlijk laboratorium en incubatorruimte, duurt 4 tot 6 weken en is vatbaar voor besmetting.

In deze studie beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor kolonietelling, de micro-CFU (mCFU), en bieden we een eenvoudige en snelle oplossing om de resultaten 15,16,17,18,19,20 te analyseren. De mCFU-test vereist tien keer minder reagentia, verkort de incubatietijd met een factor drie, duurt 1 tot 2 weken om te voltooien, vermindert de laboratoriumruimte en de reagenskosten en minimaliseert de gezondheids- en veiligheidsrisico's die gepaard gaan met het werken met grote aantallen M.tb. We stellen voor dat deze methode universeel wordt toegepast voor preklinische studies naar het bepalen van de werkzaamheid van vaccins, wat uiteindelijk leidt tot een tijdsbesparing in de ontwikkeling van vaccins tegen tuberculose. Ten slotte is deze geoptimaliseerde methode van CFU-telling gebruikt om niet alleen mycobacteriën te kwantificeren, maar ook andere bacteriën, zoals Escherichia coli en Ralstonia solanacearum21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Het hier beschreven protocol is voor BCG, maar kan worden toegepast op alle mycobacteriën. BCG kan worden gebruikt als surrogaatbacterie voor tbc-experimenten wanneer BSL3-faciliteiten niet beschikbaar zijn22. De volgende procedures waarbij BCG wordt gebruikt, moeten worden uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) en moeten de toepasselijke bioveiligheidsrichtlijnen en goede laboratoriumpraktijken voor de manipulatie van micro-organismen van gevarengroep 2 volgen.

1. Voorbereiding van de cultuurmedia

  1. Bereid Middlebrook 7H9-bouillon aangevuld met 10% (v/v) oliezuur, albumine, dextrose en catalase (OADC) verrijking, volgens de instructies van de leverancier. Vul de bouillon aan met 0,05% (v/v) tyloxapol.
    OPMERKING: Tyloxapol is een niet-ionisch vloeibaar polymeer dat is gebruikt als oppervlakteactieve stof om de vorming van bacteriële klonten te voorkomen16.
  2. Bereid Middlebrook 7H10 solid medium aangevuld met 10% (v/v) OADC-verrijking volgens de instructies van de leverancier.
  3. Verdeel 40 ml medium per vierkante petrischaal (120 mm x 120 mm). Laat de platen drogen om condensatie aan het oppervlak van de agar tot een minimum te beperken.
    OPMERKING: Deze specifieke grootte van de petrischaal is van fundamenteel belang om directe transponering van ten minste 96 druppels van een plaat met 96 putjes mogelijk te maken. Effectief drogen van de platen zal later het uitplateren van kleine druppeltjes bacteriële suspensie vergemakkelijken en voorkomen dat de druppels zich verspreiden.
  4. Bereid Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) voor om het infectiemedium te produceren. Vul in beide gevallen het medium aan met 10% foetaal kalfsserum, 1% L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat. Voeg geen penicilline en streptomycine toe aan het medium.

2. Voorbereiding van het monster

  1. Verkrijg monsters uit verschillende bronnen. Om CFU te kwantificeren om de werkzaamheid van een tbc-vaccin te evalueren, moet u doorgaans monsters nemen van gevaccineerde en niet-gevaccineerde dierlijke weefsels. Bijvoorbeeld muizenlong en milt11 of makaaklong, thoracale en perifere lymfeklieren, milt, lever, huid, bloed, beenmerg en bronchoalveolaire spoeling23. U kunt ook monsters nemen van in vitro culturen van macrofagen/dendritische cellen/neutrofielen die zijn geïnfecteerd met BCG 18,19,20,24,25,26.

3. Productie van BCG-cultuur

OPMERKING: Voor in vivo studies van tbc-vaccins is het doel om de werkzaamheid van BCG te verbeteren. Daarom worden BCG-gevaccineerde groepen meestal als controle gebruikt. BCG-stammen die worden gebruikt voor vaccinatie bij mensen zijn ideaal om in diermodellen te testen. In dit geval moet een BCG-kweek worden gereconstitueerd volgens de instructies van de leverancier27. Een BCG-kweek voor in vivo studies kan echter ook intern worden geproduceerd11. De productie van eencellige, uniforme en hoogwaardige BCG-kweek voor in-vitro-infectieprotocollen is zeer succesvol geproduceerd in verschillende onderzoeken 11,16,18,19,20,26,28,29, met behulp van het volgende protocol, dat ook kan worden gebruikt voor dierprovocatiestudies.

  1. Kweek 50 ml BCG in 7H9 bouillon, bij 37 °C, met roeren bij 200 omw/min. Varieer het volume volgens de behoeften van het experiment.
  2. Verzamel elke dag, gedurende 8-10 dagen, 100 μL van de cultuur en verdun deze door 900 μL PBS toe te voegen aan een cuvet van 1 ml. Ga vervolgens verder met het meten van de optische dichtheid van bacteriën (OD bij λ=600 nm; OD600) in een spectrofotometer. Teken een groeicurve van die waarden. Identificeer de mid-log-fase van de cultuur (wanneer de OD consequent per tijdseenheid verdubbelt).
  3. Bereid een volgende cultuur voor en incubeer tot het bereiken van de midden/late groeifase van de stam, zoals in de stappen 3.1 en 3.2. Gebruik de waarden die in de vorige stap zijn verkregen als richtlijn. Zorg ervoor dat de cultuur niet de stationaire groeifase bereikt (wanneer de OD begint te stabiliseren) om een cultuur van goede kwaliteit van levensvatbare bacteriën te behouden.
  4. Verzamel de cultuur in de midden/late groeifase van de stam. Centrifugeer op 3000 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant.
  5. Voeg 10 ml PBS toe om de bacteriën te wassen. Centrifugeer op 3000 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant.
  6. Resuspendeer de bacteriën met 5 ml infectiemedium. Plaats de buis gedurende 15 minuten in een ultrasoon bad, vol vermogen bij 80 Hz.
  7. Centrifugeer op 1000 x g gedurende 10 min. Verzamel het supernatans en vermijd de pellet, want deze is rijk aan bacteriële klonten die moeten worden vermeden in een hoogwaardige BCG-cultuur en gooi het weg.
  8. Meet de OD van de supernatant. Hier zijn culturen in de exponentiële groeifase, met een OD600 van 0,1, gelijk aan 1 x 107 CFU/ml.
    OPMERKING: Elk laboratorium moet zijn eigen BCG-groeicurven produceren voordat met experimenten wordt begonnen om een lineaire regressie tussen OD600 en CFU vast te stellen met behulp van de spectrofotometer. Houd er rekening mee dat spectrofotometers verschillende lichtpadafstanden hebben, waardoor de metingen die voor hetzelfde monster worden verkregen, kunnen variëren.
  9. Voer eenvoudige berekeningen uit om het aantal bacteriën vast te stellen dat aan elke gastheercelcultuur moet worden toegevoegd. Het aantal bacteriën per gastheercel is de Multiplicity of Infection (MOI). Gebruik een MOI van 10 bacteriën per gastheercel, wat de meest voorkomende MOI is die wordt gebruikt voor BCG-infectie-experimenten.

4. Eenheidstest voor het vormen van microkolonies

OPMERKING: Nadat een in vivo of in vitro infectie-experiment is voltooid, kan de telling van bacteriën worden uitgevoerd door mCFU. Voor in-vivo-onderzoek moeten de monsters eerst worden gehomogeniseerd in een kralenklopper of een andere weefselhomogenisator. Voor in-vitroculturen van macrofagen/dendritische cellen/neutrofielen die zijn geïnfecteerd met BCG, moeten monsters worden gelyseerd met een niet-ionisch reinigingsmiddel (bijv. 0,05%-oplossing van niet-ionisch, niet-denaturerend reinigingsmiddel).

  1. Seriële verdunningen met behulp van een plaat met 96 putjes: voer seriële 10-voudige verdunningen van de lysaten uit in een steriele plaat met 96 putjes volgens het schema in figuur 1A. Verdeel de lysaten over de rijen A en E. Voor elke plaat is het maximum aantal monsters en/of replicaten 24.
  2. Voeg 180 μL dH2O toe aan de resterende putjes om de seriële verdunning uit te voeren.
  3. Resuspendeer met een 12-kanaals pipet de lysaten in rij A en breng 20 μl over naar rij B (20 μl lysaat + 180 μl dH2O). Homogeniseer goed. Herhaal deze stap achtereenvolgens voor rij B en C tot de laatste verdunning in rij D.
    OPMERKING: We voeren meestal drie verdunningen uit (100, 101, 102, 103), waarbij we 4 rijen van de plaat (AD of EH) gebruiken voor elke set van 12 monsters en/of replicaten.
  4. Microdruppelplating: gebruik een meerkanaalspipet van 0,5-10 μl (dunne punten hebben de voorkeur) om 5 μl over te brengen van elke rij van de plaat met 96 putjes naar de massieve middelgrote vierkante plaat, volgens figuur 1B.
  5. Terwijl je de druppels van 5 μL langzaam pipettert, laat je ze de agar lichtjes raken. Dit zal helpen om de druppel van de punt naar de agar te verwijderen en de kans op het vasthouden van de vloeistof in de punt te verminderen.
  6. Laat de druppels drogen, sluit de agarplaat en incubeer deze bij 37 °C terwijl u de bacteriegroei in de gaten houdt. Eventueel kunnen de agarplaten in een afgesloten plastic zak worden geïncubeerd om te voorkomen dat de platen uitdrogen.
  7. Microkolonietelling: na ongeveer 6-10 dagen incubatie, controleer op individuele kolonies die met het blote oog zichtbaar zijn (figuur 2).
  8. Tel de kolonies met behulp van het objectief met de laagste vergroting (4x of lager) van een omgekeerde optische microscoop of vergrootglas. De tellingen moeten worden uitgevoerd in de verdunningen waar het aantal kolonies lager is dan 300 en hoger dan 30. U kunt ook een camera gebruiken om een foto van de druppel te maken om handmatig kolonies op de computer te tellen of software zoals ImageJ gebruiken om het tellen van kolonies te automatiseren.
  9. Gebruik de volgende vergelijking om celgetallen in kve/ml uit te drukken:
    Equation 1
    Waarbij C = aantal getelde kolonies, V = volume in μL en Dil = verdunning waarbij de kolonies werden geteld (100, 101, 102, 103). Als bijvoorbeeld 30 kolonies werden geteld in een druppel van 5 μL in verdunning 102, dan:
    Equation 2

Figure 1
Figuur 1. Schematische weergave van het mCFU-protocol. (A) Seriële 10-voudige verdunningen van de BCG-bevattende lysaten in een plaat met 96 putjes. (B) Vierkante petrischaal met vast kweekmedium en bedekt met 96 druppels van elk 5 μl. Druppels worden rechtstreeks vanaf de plaat met 96 putjes gepipetteerd met behulp van een meerkanaalspipet. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Microkolonie die eenheden van BCG vormt na 10 dagen incubatie. Links een foto van een vierkante petrischaal met daaroverheen 96 druppels van elk 5 μL, zoals eerder weergegeven in figuur 1B. Aan de rechterkant komen individuele foto's van 3 druppels overeen met een origineel lysaat (100) en twee verdunningen (101, 102). De foto's zijn gemaakt met een DSRL-camera die is uitgerust met een 18-55 mm zoomlens (plaat) of een 105 mm macrolens (druppels). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Telling van microkolonies in Fiji (ImageJ)

OPMERKING: De mCFU-methode maakt kwantificering van CFU van grote sets monsters mogelijk. Foto's van de druppeltjes kunnen worden opgenomen voor analyse achteraf om het tellen van kolonies te vergemakkelijken. Verschillende fotografische apparaten kunnen voor dit doel afbeeldingen produceren met voldoende kwaliteit. Deze omvatten digitale camera's, webcams, aan de camera bevestigde microscopen en vergrootglazen, en mobiele telefoons. Gratis beeldanalysesoftware zoals ImageJ biedt de mogelijkheid om handmatig of geautomatiseerd kolonies te tellen in die beelden. Om beide methoden te demonstreren, zal Fiji worden gebruikt, een distributie van ImageJ die verschillende tools voor wetenschappelijke beeldanalyse bevat30. Fiji kan worden gedownload van https://fiji.sc/.

  1. Handmatige telmethode
    1. Open de afbeelding met de mCFU in Fiji. Selecteer Plug-ins > Analyseer > Cell Counter.
    2. Selecteer in het menu Celteller de optie Initialiseren en selecteer vervolgens een teller (bijvoorbeeld Type 1).
    3. Ga verder door op elke kolonie te klikken. Elke klik wordt op de afbeelding weergegeven en zal de teller bijwerken (Figuur 3). Als u onbedoelde klikken ongedaan wilt maken, selecteert u Verwijderen.
    4. Registreer de waarde die op de teller wordt weergegeven. Klik op de knop Opnieuw instellen om de telling opnieuw in te stellen en een nieuwe afbeelding te openen om extra monsters te tellen.
      OPMERKING: Verdere instructies over deze plug-in zijn te vinden op https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. Geautomatiseerde telmethode
    1. Open de afbeelding met de mCFU in Fiji. Selecteer Afbeelding > Type > 8-bits. Hiermee wordt de afbeelding geconverteerd naar een 8-bits grijswaardenafbeelding.
    2. Selecteer het gereedschap Ovaal in de werkbalk en teken een ovaal rond het gebied met de kolonies (Figuur 4A). Het ovaal kan na het tekenen worden aangepast.
    3. Selecteer Bewerken > Buiten wissen om interferentie van de buitenruimte te verwijderen (Figuur 4B). Selecteer Afbeelding > pas > drempelwaarde aan.
    4. Verplaats de schuifregelaars in het drempelmenu totdat de kolonies rood worden weergegeven en achtergrondgeluid wordt geminimaliseerd (Figuur 4C).
    5. Selecteer Toepassen en sluit het drempelvenster. Er wordt een zwart-witbeeld gegenereerd (Figuur 4D).
    6. Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren. Geef in het venster deeltjes analyseren het bereik op voor koloniegebied (tussen 1 en oneindig, gemeten in vierkante pixels) en circulariteit (tussen 0 en 1, waarbij 1 een perfecte cirkel is; Figuur 4E).
    7. Selecteer Contouren in het pop-upmenu weergeven. Vink Weergaveresultaten aan voor gedetailleerde metingen voor elke kolonie in het resultatenvenster. Vink Resultaten wissen aan om eerdere metingen te wissen. Vink het vakje Samenvatten aan om de samengevatte resultaten van de metingen weer te geven (Figuur 4E).
    8. Start de analysator door OK te selecteren. Er verschijnt een nieuw venster met alle omlijnde kolonies die zijn gedetecteerd en geteld. Het resultatenvenster toont de details voor elke kolonie en het samengevatte resultatenvenster toont het totale aantal getelde kolonies (Figuur 4F).
      OPMERKING: De instellingen voor grootte en rondheid zijn afhankelijk van de resolutie en vergroting van de afbeelding en de grootte en vorm van de kolonies. Herhaal het proces meerdere keren totdat de beste instellingen zijn gevonden die alle kolonies detecteren. Verdere instructies over de plug-in voor het analyseren van deeltjes zijn te vinden op https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Figure 3
Figuur 3. Een handmatige methode voor het tellen van mCFU met behulp van de celteller-plug-in op Fiji-software. De blauwe stippen geven kolonies aan waarop de gebruiker al heeft geklikt. Het menu aan de rechterkant toont het aantal kolonies dat tot nu toe is geteld (het aantal is 41). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Een geautomatiseerde methode voor het tellen van mCFU met behulp van Fiji-software. (A, B) Het interessegebied met de kolonies wordt geselecteerd met behulp van het ovale selectiegereedschap en het buitengebied wordt verwijderd met het commando buiten wissen. (C, D) Met behulp van de drempeltool wordt een zwart-witbeeld van de kolonies gegenereerd. (E, F) Het aantal kolonies wordt gekwantificeerd met behulp van de tool deeltjes analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hier beschreven mCFU-test verhoogt de hoeveelheid informatie die uit een enkele petrischaal kan worden gehaald tot ten minste 96 keer. Figuur 5 toont een vergelijking van twee methoden voor medicijnafgifte voor het hergebruikte gebruik van saquinavir (SQV)31,32 als een op de gastheer gericht medicijn voor de behandeling van tuberculose. In deze test werden vier verschillende stammen van Mycobacterium tuberculosis gebruikt om primaire menselijke macrofagen te infecteren. M. tuberculose H37Rv-laboratoriumstam en drie klinische stammen geïsoleerd uit patiënten met actieve tuberculose door Dr. Ricardo Jorge van het Portugese Nationale Instituut voor Gezondheid (INSA): een geneesmiddelgevoelige stam (INSA-code 33427), een meervoudig resistente (MDR) stam (INSA-code 34192) en een extensief resistente (XDR) stam (INSA-code 163761). Elke infectie door elke stam werd verder vermenigvuldigd in acht verschillende behandelingscondities, waarbij drie verschillende concentraties van vrij medicijn of liposoom-geladen medicijn werden vergeleken met de respectievelijke niet-behandelde controles. Ten slotte werd elke aandoening geanalyseerd op vier verschillende tijdstippen na infectie. Om de intracellulaire bacteriegroei te kwantificeren, was de totale hoeveelheid lysaten die uit elk tijdstip werd geëxtraheerd 32. Dit werd gevolgd door drie seriële verdunningen van elk lysaat, waardoor het aantal tot 128 monsters toenam. Vermenigvuldigd met de vier geanalyseerde tijdstippen resulteert dit in 512 monsters. Omdat het experiment werd herhaald met macrofagen van ten minste drie verschillende bloeddonoren, steeg het totale aantal geanalyseerde monsters tot 1536. Met behulp van de hier beschreven mCFU-methode was dit experiment goed voor slechts 16 vierkante petrischalen versus 1536 die nodig zouden zijn met behulp van het standaard CFU-protocol. Zoals te zien is in figuur 5, kunnen de resultaten die met deze methode worden verkregen, statistisch significante verschillen tussen behandelingen aantonen.

Figure 5
Figuur 5. De mCFU-methode kan grote hoeveelheden gegevens produceren van een klein aantal agarplaten. Deze reeks experimenten testte de werkzaamheid van het medicijn saquinavir (SQV) om intracellulaire doding van M.tb-laboratorium - en klinische stammen in menselijke macrofagen te induceren. SQV werd toegediend aan de macrofaagculturen in zijn vrije vorm of geladen in liposomen (LipSQV). De behandelingen werden uitgevoerd in drie verschillende concentraties: 50, 20 en 10 μg/ml. Macrofagen werden gedurende 3 uur geïnfecteerd met verschillende M.tb-stammen en vervolgens behandeld met geselecteerde concentraties LipSQV en vrije SQV. Liposomen zonder het medicijn (LipUnloaded) en DMSO werden gebruikt als controles. Om de bacteriële intracellulaire overleving te evalueren, werden macrofagen op discrete tijdstippen gelyseerd en werden seriële verdunningen van de bacteriële suspensie op 7H10-agarplaten geplateerd. mCFU-eenheden werden na 2-3 weken geteld. Lijnen geven de gemiddelde mCFU per monster weer van ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Balken vertegenwoordigen het gemiddelde mCFU-percentage berekend ten opzichte van de respectieve controles op dag 7 na infectie. Symbolen vertegenwoordigen elk experiment met macrofagen van een andere donor. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Meerdere groepsvergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door een Holm-Sidak post-hoctest. * p ≤0,05, ** p ≤0,01, *** p ≤0,001. Dit cijfer is gewijzigd van33. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tbc is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid dat steeds belangrijker wordt, vooral in lage- en middeninkomenslanden. De verstoring van zorginstellingen voor het diagnosticeren en behandelen van tuberculose tijdens de COVID-19-pandemie had een negatief effect op de incidentie van nieuwe gevallen1. Bovendien moeten de multi-drug en extensief resistente M.tb-stammen en de co-infectie van M.tb en HIV dringend worden aangepakt om deze epidemie onder controle te krijgen 1,34. Nieuwe vaccins om BCG te vervangen of te verbeteren bevinden zich momenteel in klinische proeven en nieuwe kandidaten zouden de komende jaren op de markt kunnen komen35. De ontwikkeling van nieuwe kandidaat-vaccins tegen tuberculose is gebaseerd op preklinische studies met diverse diermodellen. De bepaling van de werkzaamheid van het vaccin in diermodellen vereist kwantificering van de bacteriële belasting in de geïnfecteerde organen om het beschermende effect van het vaccin aan te tonen 5,36. Momenteel zijn er directe en indirecte methoden om de bacteriële belasting bij geïnfecteerde muizen en niet-menselijke primaten te kwantificeren. De directe methoden omvatten histologische preparaten en bacteriële kleuring met behulp van fluorescerende auramine-o en Ziehl-Neelsen37, de kwantificering van mycobacteriële belasting in monsters op basis van RT-qPCR38 en andere.

De mycobacteriële groeiremmingstest (MGIA) is een in-vitrotest op basis van het BACTEC MGIT-systeem en is een gevoelige methode die wordt gebruikt om de levende mycobacteriële belasting bij gevaccineerde en niet-gevaccineerde dieren te kwantificeren. Het systeem is een volledig geautomatiseerd instrument dat kan testen op de aanwezigheid van Mycobacteriën in speciaal ontworpen reageerbuisjes. De flacon bevat een fluorescerende reporter die reageert op de zuurstofconcentratie in het monster. De fluorescentie is evenredig met de hoeveelheid verbruikte zuurstof en geeft een indicatie van het aantal levende bacteriën dat elk uur in het monster aanwezig is39. Bij de MGIA-methode worden PBMC's en autologe serummonsters van dieren verzameld en gedurende 96 uur samen met mycobacteriën gekweekt. Vervolgens worden aanhangende monocyten gelyseerd om intracellulaire mycobacteriën vrij te maken. Het systeem zal de bacteriële belasting indirect kwantificeren door het zuurstofverbruik te meten40. Deze methode wordt meestal gebruikt voor onderzoeken naar resistentie tegen geneesmiddelen, maar is onlangs toegepast op de evaluatie van de werkzaamheid van het tbc-vaccin40.

Deze methoden kunnen worden aangevuld met de standaard CFU om het totale aantal levensvatbare mycobacteriën te bepalen. De evaluatie van kandidaat-vaccins in een M.tb-provocatie-experiment met muizenaerosol wordt bijvoorbeeld bereikt door kolonies op te sommen die zijn verkregen uit weefsels door CFU11.

De hier beschreven mCFU-methode kan een aanzienlijke verbetering zijn ten opzichte van de klassieke CFU-methode, omdat deze sneller uit te voeren is en goedkoper is in termen van gebruikte reagentia en in termen van benodigde laboratoriumruimte. Deze methode maakt het mogelijk om een grote reeks monsters in één experiment gelijktijdig te vergelijken, waardoor de effecten van variaties van test tot test worden verminderd. Zoals te zien is in het experiment beschreven in figuur 5, werd bijvoorbeeld de CFU bepaald voor 1536 monsters met behulp van de mCFU-methode in 16 vierkante petrischalen, wat neerkomt op een 96-voudige vermindering van het aantal gebruikte platen. Dit is relevanter voor experimenten met primaire biologische en klinische monsters, waar de beschikbaarheid een probleem kan zijn. De compacte vorm waarin de kolonies op een agarplaat worden weergegeven, maakt het gebruik van gespecialiseerde of gangbare beeldopnameapparatuur gemakkelijk mogelijk. Dit, in combinatie met geautomatiseerde methoden voor het tellen van kolonies, zoals hier beschreven met behulp van de Fiji-software, helpt de afhankelijkheid van het vermogen van de gebruiker om de CFU te identificeren en te kwantificeren te verminderen. Toch lijdt deze methode, net als de standaard CFU-techniek, aan het onvermogen om gefuseerde kolonies te onderscheiden, wat leidt tot een mogelijke ondervertegenwoordiging van de CFU. Dit kan echter worden geminimaliseerd door een hogere verdunning te selecteren om de kwantificering uit te voeren of door de kolonies onder de microscoop te tellen voordat hun overgroei resulteert in een fusie van kolonies. Dit is relevanter als het monster kolonies produceert met heterogene groeisnelheden. Onderzoekers moeten in die gevallen de mCFU-implementatie valideren voor hun specifieke experimentele omstandigheden.

De kritieke stappen binnen het protocol zijn de volgende punten: de seriële verdunningen moeten worden uitgevoerd met behulp van een plaat met 96 putjes en de verdunningen moeten grondig worden gemengd; het plateren van microdruppels moet worden uitgevoerd met een meerkanaalspipet van 0,5-10 μl om 5 μl over te brengen van elke rij van de plaat met 96 putjes naar de massieve middelgrote vierkante plaat, zonder het medium aan te raken en te beschadigen; De telling van de microkolonies moet worden uitgevoerd tussen 6-10 dagen incubatie. Bij het tellen moet er echter voor worden gezorgd dat de kolonies niet te groot of te klein zijn.

De aanpassingen en probleemoplossing van de techniek omvatten het gebruik van verschillende bacteriestammen. Daarom moet voor elke soort het optimale groeimedium worden gebruikt. De beperkingen van de techniek zijn identiek aan de beperkingen van de conventionele CFU-methode, waaronder de moeilijkheid om bacteriën in lage verdunningen te tellen. Bovendien zijn specifieke beperkingen van deze methode onder meer de noodzaak om een microscoop te gebruiken om de kolonies op te sommen.

Ten slotte kan deze methode worden gebruikt om de bacteriële belasting te kwantificeren in tbc-vaccinatiestudies en voor testen op geneesmiddelresistentie/vatbaarheid en gastheer-pathogeen interactiestudies. Figuur 5 toont bijvoorbeeld de toepassing van mCFU voor de bepaling van intracellulaire doding van M.tb-stammen , waaronder klinische stammen, multiresistente en extensief resistente stammen die worden behandeld met verschillende geneesmiddelformuleringen, in menselijke macrofagen. Belangrijk is dat deze methode ook kan worden toegepast op elk micro-organisme, op voorwaarde dat aan de kweekvoorwaarden voor elk organisme wordt voldaan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DP en PJGB verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door interne financiering van de Faculteit der Geneeskunde, Universidade Católica Portuguesa, en externe financiering van Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), in het kader van de subsidies UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 en EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).

Tags

Geneeskunde Nummer 197 Vaccins Tuberculose Mycobacterium Tuberculosis Bacillus Calmette-Guérin TB-vaccin Klinische proeven Preklinische ontwikkeling Opsomming van bacteriekolonies Kolonievormende eenheden Analyse MCFU-test Reagenskosten Incubatietijd Laboratoriumruimte Gezondheids- en veiligheidsrisico's
Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pires, D., Bettencourt, P. J. G.… More

Pires, D., Bettencourt, P. J. G. Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis. J. Vis. Exp. (197), e65447, doi:10.3791/65447 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter