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Medicine

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65447
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

Summary

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Abstract

La tubercolosi (TB), la principale causa di morte in tutto il mondo per un agente infettivo, ha ucciso 1,6 milioni di persone nel 2022, superata solo dal COVID-19 durante la pandemia 2019-2021. La malattia è causata dal batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Il ceppo di Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), l'unico vaccino contro la tubercolosi, è il più antico vaccino autorizzato al mondo, ancora in uso. Attualmente, ci sono 12 vaccini in fase di sperimentazione clinica e dozzine di vaccini in fase di sviluppo preclinico. Il metodo di scelta utilizzato per valutare l'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi negli studi preclinici è l'enumerazione delle colonie batteriche mediante il test delle unità formanti colonie (CFU). Questo test richiede dalle 4 alle 6 settimane per essere concluso, richiede un notevole spazio in laboratorio e nell'incubatore, ha costi elevati per i reagenti ed è soggetto a contaminazione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per l'enumerazione delle colonie, il micro-CFU (mCFU), che offre una soluzione semplice e rapida per analizzare i risultati dell'efficacia del vaccino contro la tubercolosi . Il test mCFU richiede un numero dieci volte inferiore di reagenti, riduce di tre volte il periodo di incubazione, impiegando da 1 a 2 settimane per concludersi, riduce lo spazio di laboratorio e il costo dei reagenti e riduce al minimo i rischi per la salute e la sicurezza associati al lavoro con un gran numero di M.tb. Inoltre, per valutare l'efficacia di un vaccino contro la tubercolosi, è possibile ottenere campioni da una varietà di fonti, compresi tessuti di animali vaccinati infettati da micobatteri. Descriviamo anche un metodo ottimizzato per produrre una coltura micobatterica unicellulare, uniforme e di alta qualità per gli studi sulle infezioni. Infine, proponiamo che questi metodi siano universalmente adottati per gli studi preclinici sulla determinazione dell'efficacia dei vaccini, portando in ultima analisi a una riduzione dei tempi di sviluppo dei vaccini contro la tubercolosi.

Introduction

La tubercolosi (TBC) è la principale causa di morte in tutto il mondo a causa di un singolo agente infettivo, il batterio Mycobacterium tuberculosis (M.tb), che uccide più persone di qualsiasi altro agente patogeno. Nel 2021, la tubercolosi è stata responsabile di 1,6 milioni di decessi ed è stata superata dalla COVID-19 durante la pandemia 2019-20211. Inoltre, secondo il rapporto globale sulla tubercolosi del 2022 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, la pandemia di COVID-19 è stata responsabile di un aumento dei nuovi casi di tubercolosi. L'OMS segnala anche un forte calo del numero di persone a cui è stata diagnosticata la tubercolosi durante questo periodo, il che potrebbe aumentare ulteriormente il numerodi casi di tubercolosi.

Il Bacillus Calmette-Guérin (BCG) è un ceppo vivo attenuato del patogeno Mycobacterium bovis, utilizzato per la prima volta come vaccino più di 100 anni fa. Questo è l'unico vaccino contro la tubercolosi ed è il più antico vaccino autorizzato al mondo ancora in uso 2,3. Attualmente, ci sono 12 vaccini in diverse fasi di sperimentazione clinica4 e dozzine di vaccini sono in fase di sviluppo preclinico 5,6. La valutazione preclinica dei vaccini contro la tubercolosi include la valutazione della sicurezza e dell'immunogenicità7, che possono essere ottenute in diversi modelli animali come pesce zebra, topi, porcellini d'India, conigli, bovini e primati non umani 8,9,10. Inoltre, la valutazione della capacità di un vaccino di indurre protezione contro l'infezione e/o la trasmissione di M.tb, cioè l'efficacia del vaccino, richiede un challenge di M.tb in vivo 5,11. È interessante notare che la vaccinazione BCG induce effetti non specifici che influenzano la sopravvivenza di altri patogeni batterici e virali12,13 attraverso il meccanismo dell'immunità addestrata14. Per quantificare la carica batterica vitale in un animale infetto, il metodo di scelta è l'enumerazione delle colonie batteriche attraverso il test delle unità formanti colonie (CFU) 5,15. La CFU è un'unità che stima il numero di microrganismi (batteri o funghi) che formano colonie in specifiche condizioni di crescita. I CFU provengono da microrganismi vitali e replicativi e il numero assoluto di microrganismi viventi all'interno di ciascuna colonia è difficile da stimare. Non è chiaro se una colonia abbia avuto origine da uno o più microrganismi. L'unità CFU riflette questa incertezza, quindi si può osservare una grande variabilità nelle repliche dello stesso campione. Questo test richiede molto tempo e tecnici specializzati formati per lavorare in una struttura di livello di biosicurezza 3 (BSL3), un ampio spazio di laboratorio e incubatore, richiede da 4 a 6 settimane per concludersi ed è soggetto a contaminazione.

In questo studio, descriviamo un metodo ottimizzato per l'enumerazione delle colonie, il micro-CFU (mCFU), e offriamo una soluzione semplice e rapida per analizzare i risultati 15,16,17,18,19,20. Il test mCFU richiede un numero dieci volte inferiore di reagenti, riduce di tre volte il periodo di incubazione, impiegando da 1 a 2 settimane per concludersi, riduce lo spazio di laboratorio e il costo dei reagenti e riduce al minimo i rischi per la salute e la sicurezza associati al lavoro con un gran numero di M.tb. Proponiamo che questo metodo sia universalmente adottato per gli studi preclinici sulla determinazione dell'efficacia dei vaccini, portando in ultima analisi a una riduzione dei tempi di sviluppo dei vaccini contro la tubercolosi. Infine, questo metodo ottimizzato di enumerazione CFU è stato utilizzato per quantificare non solo i micobatteri ma anche altri batteri, come Escherichia coli e Ralstonia solanacearum21.

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Protocol

NOTA: Il protocollo qui descritto è per BCG ma può essere applicato a qualsiasi Micobatterio. Il BCG può essere utilizzato come batterio surrogato per gli esperimenti sulla tubercolosi quando le strutture BSL3 non sono disponibili22. Le seguenti procedure che utilizzano BCG devono essere eseguite in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e seguire le linee guida di biosicurezza appropriate e le buone pratiche di laboratorio per la manipolazione di microrganismi del gruppo di pericolo 2.

1. Preparazione dei terreni di coltura

  1. Preparare il brodo Middlebrook 7H9 integrato con il 10% (v/v) di acido oleico, albumina, destrosio e arricchimento di catalasi (OADC), secondo le istruzioni del fornitore. Integrare il brodo con lo 0,05% (v/v) di tyloxapol.
    NOTA: Tyloxapol è un polimero liquido non ionico che è stato utilizzato come tensioattivo per prevenire la formazione di grumi batterici16.
  2. Preparare il terreno solido Middlebrook 7H10 integrato con il 10% (v/v) di arricchimento OADC secondo le istruzioni del fornitore.
  3. Distribuire 40 mL di terreno per capsula di Petri quadrata (120 mm x 120 mm). Lasciare asciugare le piastre per ridurre al minimo la formazione di condensa sulla superficie dell'agar.
    NOTA: Questa dimensione specifica della capsula di Petri è fondamentale per consentire il trasposizione diretto di almeno 96 goccioline da una piastra a 96 pozzetti. Un'efficace asciugatura delle piastre faciliterà in seguito la placcatura di piccole goccioline di sospensione batterica e impedirà la diffusione delle goccioline.
  4. Preparare il terreno di infezione del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) o il terreno DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco. In entrambi i casi, integrare il terreno con il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio. Non aggiungere penicillina e streptomicina al terreno.

2. Preparazione del campione

  1. Ottenere campioni da una varietà di fonti. Tipicamente, per quantificare la CFU per valutare l'efficacia di un vaccino contro la tubercolosi, è necessario acquisire campioni da tessuti animali vaccinati e non vaccinati. Ad esempio, polmone e milza di topo11 o polmone di macaco, linfonodi toracici e periferici, milza, fegato, pelle, sangue, midollo osseo e lavaggio broncoalveolare23. In alternativa, prelevare campioni da colture in vitro di macrofagi/cellule dendritiche/neutrofili infettati con BCG 18,19,20,24,25,26.

3. Produzione di coltura BCG

NOTA: Per gli studi in vivo sui vaccini contro la tubercolosi, l'obiettivo è quello di migliorare l'efficacia del BCG. Pertanto, i gruppi vaccinati con BCG sono solitamente utilizzati come controllo. I ceppi di BCG utilizzati per la vaccinazione umana sono ideali per i test su modelli animali. In questo caso, una coltura di BCG deve essere ricostituita secondo le istruzioni del fornitore27. Tuttavia, una coltura BCG per studi in vivo può anche essere prodotta internamente11. La produzione di colture BCG unicellulari, uniformi e di alta qualità per protocolli di infezione in vitro è stata prodotta con grande successo in diversi studi 11,16,18,19,20,26,28,29, utilizzando il seguente protocollo, che può essere utilizzato anche per studi di provocazione su animali.

  1. Coltura 50 mL di BCG in brodo 7H9, a 37 °C, con agitazione a 200 giri/min. Variare il volume in base alle esigenze dell'esperimento.
  2. Ogni giorno, per 8-10 giorni, raccogliere 100 μL di coltura e diluirli aggiungendo 900 μL di PBS in una cuvetta da 1 mL. Procedere quindi misurando la densità ottica dei batteri (OD a λ=600 nm; OD600) in uno spettrofotometro. Disegna una curva di crescita a partire da questi valori. Identificare la fase intermedia logaritmica della coltura (quando l'OD raddoppia in modo coerente per unità di tempo).
  3. Preparare una coltura successiva e incubare fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica medio/tardiva come nei passaggi 3.1 e 3.2. Utilizzare i valori ottenuti nel passaggio precedente come guida. Assicurarsi che la coltura non raggiunga la fase di crescita stazionaria (quando l'OD inizia a stabilizzarsi) per mantenere una coltura di buona qualità di batteri vitali.
  4. Raccogliere la coltura nella fase di crescita del log medio/tardivo. Centrifugare a 3000 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante.
  5. Aggiungere 10 ml di PBS per lavare i batteri. Centrifugare a 3000 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante.
  6. Risospendere i batteri con 5 ml di terreno di infezione. Immergere il tubo in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti, a piena potenza a 80 Hz.
  7. Centrifugare a 1000 x g per 10 min. Raccogliere il surnatante evitando il pellet in quanto ricco di grumi batterici che dovrebbero essere evitati in una coltura BCG di alta qualità e scartarlo.
  8. Misurare l'OD del surnatante. In questo caso, le colture in fase di crescita esponenziale, con un OD600 di 0,1, equivalgono a 1 x 107 CFU/mL.
    NOTA: Ogni laboratorio dovrebbe produrre le proprie curve di crescita BCG prima di iniziare gli esperimenti per stabilire una regressione lineare tra OD600 e CFU utilizzando lo spettrofotometro. Si prega di notare che gli spettrofotometri hanno diverse distanze del percorso della luce, che possono variare le letture ottenute per lo stesso campione.
  9. Esegui semplici calcoli per stabilire il numero di batteri da aggiungere a ciascuna coltura cellulare ospite. Il numero di batteri per cellula ospite è la molteplicità dell'infezione (MOI). Utilizzare un MOI di 10 batteri per cellula ospite, che è il MOI più comune utilizzato per gli esperimenti di infezione da BCG.

4. Saggio dell'unità formante microcolonie

NOTA: Dopo aver completato un esperimento di infezione in vivo o in vitro , l'enumerazione dei batteri può essere eseguita mediante mCFU. Per gli studi in vivo , i campioni devono essere prima omogeneizzati in un battitore di perline o in un altro omogeneizzatore di tessuti. Per le colture in vitro di macrofagi/cellule dendritiche/neutrofili infettati da BCG, i campioni devono essere lisati utilizzando un detergente non ionico (ad esempio, una soluzione allo 0,05% di detergente non ionico e non denaturante).

  1. Diluizioni seriali utilizzando una piastra a 96 pozzetti: eseguire diluizioni seriali di 10 volte dei lisati, in una piastra sterile a 96 pozzetti secondo lo schema della Figura 1A. Distribuire i lisati sulle righe A ed E. Per ogni piastra, il numero massimo di campioni e/o repliche è 24.
  2. Aggiungere 180 μL di dH2O ai pozzetti rimanenti per eseguire la diluizione seriale.
  3. Utilizzando una pipetta a 12 canali, sospendere nuovamente i lisati nella fila A e trasferire 20 μL nella fila B (20 μL lisato + 180 μL dH2O). Omogeneizzare bene. Ripetere in sequenza questo passaggio per le righe B e C fino a raggiungere l'ultima diluizione nella riga D.
    NOTA: Di solito eseguiamo tre diluizioni (100, 101, 102, 103), utilizzando quindi 4 file della piastra (A-D o E-H) per ogni set di 12 campioni e/o repliche.
  4. Placcatura a microgoccia: utilizzare una pipetta multicanale da 0,5-10 μL (sono preferibili puntali sottili) per trasferire 5 μL da ciascuna fila della piastra a 96 pozzetti alla piastra quadrata media solida, secondo la Figura 1B.
  5. Pipettando lentamente le goccioline da 5 μL, lasciare che tocchino leggermente l'agar. Ciò contribuirà a rimuovere la gocciolina dalla punta verso l'agar e a ridurre la possibilità di ritenzione del liquido all'interno della punta.
  6. Lasciare asciugare le goccioline, chiudere la piastra di agar e incubarla a 37 °C monitorando la crescita batterica. Facoltativamente, incubare le piastre di agar in un sacchetto di plastica sigillato per evitare che le piastre si secchino.
  7. Conteggio delle microcolonie: dopo circa 6-10 giorni di incubazione, verificare la presenza di singole colonie, visibili ad occhio nudo (Figura 2).
  8. Contare le colonie utilizzando l'obiettivo con l'ingrandimento più basso (4x o inferiore) di un microscopio ottico invertito o di una lente d'ingrandimento. I conteggi devono essere eseguiti nelle diluizioni in cui il numero di colonie è inferiore a 300 e superiore a 30. In alternativa, utilizzare una fotocamera per scattare una foto della gocciolina per contare manualmente le colonie sul computer o utilizzare un software come ImageJ per automatizzare il conteggio delle colonie.
  9. Per esprimere il numero di celle in CFU/mL, utilizzare la seguente equazione:
    Equation 1
    Dove C = numero di colonie contate, V = volume placcato in μL e Dil = diluizione dove sono state contate le colonie (100, 101, 102, 103). Ad esempio, se 30 colonie sono state contate in una gocciolina da 5 μL nella diluizione 102, allora:
    Equation 2

Figure 1
Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo mCFU. (A) Diluizioni seriali di 10 volte dei lisati contenenti BCG in una piastra a 96 pozzetti. (B) Piastra di Petri quadrata contenente terreno di coltura solido e ricoperta da 96 goccioline da 5 μL ciascuna. Le goccioline vengono pipettate direttamente dalla piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Unità formanti microcolonie di BCG dopo 10 giorni di incubazione. A sinistra, una foto di una capsula di Petri quadrata sovrapposta a 96 goccioline da 5 μL ciascuna, come precedentemente rappresentato nella Figura 1B. A destra, le singole foto di 3 goccioline corrispondono a un lisato originale (100) e due diluizioni (101, 102). Le foto sono state scattate utilizzando una fotocamera DSRL dotata di un obiettivo zoom 18-55 mm (piastra) o di un obiettivo macro da 105 mm (goccioline). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Conteggio delle unità formanti microcolonie nelle Figi (ImageJ)

NOTA: Il metodo mCFU consente la quantificazione CFU di grandi insiemi di campioni. Le immagini delle goccioline possono essere registrate per l'analisi posteriore per facilitare il conteggio delle colonie. Diversi dispositivi fotografici possono produrre immagini con una qualità sufficiente per questo scopo. Questi includono fotocamere digitali, webcam, microscopi e lenti d'ingrandimento collegati alla fotocamera e telefoni cellulari. Un software gratuito di analisi delle immagini come ImageJ offre la possibilità di contare manualmente o automaticamente le colonie in quelle immagini. Per dimostrare entrambi i metodi, verrà utilizzato Fiji, che è una distribuzione di ImageJ che include diversi strumenti per l'analisi scientifica delle immagini30. Le Figi possono essere scaricate da https://fiji.sc/.

  1. Metodo di conteggio manuale
    1. Aprire l'immagine contenente l'mCFU in Figi. Seleziona Plugin > Analizza > contatore di celle.
    2. Nel menu Contatore di celle, selezionare Inizializza , quindi selezionare un contatore (ad esempio, Tipo 1).
    3. Procedi cliccando su ogni colonia. Ogni clic verrà visualizzato sull'immagine e aggiornerà il contatore (Figura 3). Per annullare i clic accidentali, selezionare Elimina.
    4. Registrare il valore visualizzato sul contatore. Fare clic sul pulsante Ripristina per reimpostare il conteggio e aprire una nuova immagine per contare altri campioni.
      NOTA: Ulteriori istruzioni su questo plugin sono disponibili all'https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. Metodo di conteggio automatizzato
    1. Aprire l'immagine contenente l'mCFU in Figi. Selezionare Immagine > Tipo > 8 bit. Questo convertirà l'immagine in un'immagine in scala di grigi a 8 bit.
    2. Selezionate lo strumento Ovale nella barra degli strumenti e disegnate un ovale attorno all'area con le colonie (Figura 4A). L'ovale può essere regolato dopo essere stato disegnato.
    3. Selezionare Modifica > Cancella esterno per rimuovere qualsiasi interferenza dall'area esterna (Figura 4B). Selezionare Immagine > Regola > soglia.
    4. Spostare i cursori nel menu della soglia fino a quando le colonie non vengono visualizzate in rosso e il rumore di fondo è ridotto al minimo (Figura 4C).
    5. Selezionare Applica e uscire dalla finestra della soglia. Viene generata un'immagine in bianco e nero (Figura 4D).
    6. Selezionare Analizza > Analizza particelle. Nella finestra Analizza particelle, specificare l'intervallo per l'area della colonia (compresa tra 1 e infinito, misurata in pixel quadrati) e la circolarità (tra 0 e 1, dove 1 è un cerchio perfetto; Figura 4E).
    7. Selezionare Contorni nel menu a comparsa Mostra. Controllare Visualizza risultati per misurazioni dettagliate per ogni colonia nella finestra dei risultati. Selezionare Cancella risultati per cancellare eventuali misurazioni precedenti. Selezionare la casella Riepiloga per visualizzare i risultati riepilogativi delle misurazioni (Figura 4E).
    8. Avviare l'analizzatore selezionando OK. Viene visualizzata una nuova finestra che mostra tutte le colonie delineate che sono state rilevate e conteggiate. Nella finestra dei risultati vengono visualizzati i dettagli di ogni colonia, mentre nella finestra dei risultati riepilogati vengono visualizzati i conteggi totali delle colonie (Figura 4F).
      NOTA: Le impostazioni per le dimensioni e la circolarità variano in base alla risoluzione e all'ingrandimento dell'immagine, nonché alle dimensioni e alla forma delle colonie. Ripetere il processo più volte fino a trovare le impostazioni migliori che rilevano tutte le colonie. Ulteriori istruzioni sul plug-in per l'analisi delle particelle sono disponibili all'indirizzo https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

Figure 3
Figura 3. Un metodo manuale per il conteggio di mCFU utilizzando il plug-in del contatore di cellule sul software Fiji. I punti blu indicano le colonie già cliccate dall'utente. Il menu a destra mostra il numero di colonie contate fino a quel momento (il conteggio è 41). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Un metodo automatizzato per il conteggio di mCFU utilizzando il software Fiji. (A, B) L'area di interesse con le colonie viene selezionata utilizzando lo strumento di selezione ovale e l'area esterna viene rimossa utilizzando il comando Cancella esterno. (C, D) Un'immagine in bianco e nero delle colonie viene generata utilizzando lo strumento soglia. (E, F) Il numero di colonie viene quantificato utilizzando lo strumento Analizza particelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

Il test mCFU qui descritto aumenta la quantità di informazioni che possono essere recuperate da una singola capsula di Petri ad almeno 96 volte. La Figura 5 illustra un confronto tra due metodi di somministrazione del farmaco per l'uso riproposto di saquinavir (SQV)31,32 come farmaco diretto all'ospite per il trattamento della tubercolosi. In questo test, quattro diversi ceppi di Mycobacterium tuberculosis sono stati utilizzati per infettare i macrofagi umani primari. M. tuberculosis Ceppo di laboratorio H37Rv e tre ceppi clinici isolati da pazienti con tubercolosi attiva dal Dr. Ricardo Jorge (INSA) dell'Istituto Nazionale Portoghese di Sanità: un ceppo sensibile ai farmaci (codice INSA 33427), un ceppo multiplo resistente ai farmaci (MDR) (codice INSA 34192) e un ceppo estensivamente resistente ai farmaci (XDR) (codice INSA 163761). Ogni infezione da parte di ciascun ceppo è stata ulteriormente moltiplicata in otto diverse condizioni di trattamento, confrontando tre diverse concentrazioni di farmaco libero o caricato con liposomi ai rispettivi controlli non trattati. Infine, ogni condizione è stata analizzata in quattro diversi punti temporali post-infezione. Per quantificare la crescita batterica intracellulare, la quantità totale di lisati estratti da ciascun punto temporale è stata di 32. Questo è stato seguito da tre diluizioni seriali per ciascun lisato che hanno portato il numero a 128 campioni. Moltiplicato per i quattro punti temporali analizzati risulta in 512 campioni. Poiché l'esperimento è stato ripetuto utilizzando macrofagi di almeno tre diversi donatori di sangue, il numero totale di campioni analizzati è aumentato a 1536. Utilizzando il metodo mCFU qui descritto, questo esperimento ha rappresentato solo 16 piastre di Petri quadrate contro le 1536 che sarebbero necessarie utilizzando il protocollo CFU standard. Come mostrato nella Figura 5, i risultati ottenuti con questo metodo possono dimostrare differenze statisticamente significative tra i trattamenti.

Figure 5
Figura 5. Il metodo mCFU è in grado di produrre elevate quantità di dati da un piccolo numero di piastre di agar. Questa serie di esperimenti ha testato l'efficacia del farmaco saquinavir (SQV) nell'indurre l'uccisione intracellulare di ceppi di laboratorio e clinici di M.tb nei macrofagi umani. L'SQV è stato somministrato alle colture di macrofagi in forma libera o caricato in liposomi (LipSQV). I trattamenti sono stati eseguiti in tre diverse concentrazioni: 50, 20 e 10 μg/mL. I macrofagi sono stati infettati con diversi ceppi di M.tb per 3 ore e poi trattati con concentrazioni selezionate di LipSQV e SQV libero. I liposomi senza il farmaco (LipUnloaded) e il DMSO sono stati utilizzati come controlli. Per valutare la sopravvivenza intracellulare batterica, in punti temporali discreti, i macrofagi sono stati lisati e le diluizioni seriali della sospensione batterica sono state piastrate su piastre di agar 7H10. Le unità mCFU sono state contate dopo 2-3 settimane. Le linee mostrano la media di mCFU per campione da almeno 3 esperimenti indipendenti. Le barre rappresentano la percentuale media di mCFU calcolata rispetto ai rispettivi controlli al giorno 7 post-infezione. I simboli rappresentano ogni esperimento con macrofagi di un donatore diverso. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Sono stati eseguiti confronti di più gruppi utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita da un test post-hoc di Holm-Sidak. * P ≤0,05, ** P ≤0,01, *** P ≤0,001. Questa cifra è stata modificata da33. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La tubercolosi è un importante problema di salute pubblica con un'importanza crescente, in particolare nei paesi a basso e medio reddito. L'interruzione delle strutture sanitarie per la diagnosi e il trattamento della tubercolosi durante la pandemia di COVID-19 ha causato un impatto negativo sull'incidenza di nuovi casi1. Inoltre, i ceppi di M.tb multi-farmaco ed estensivamente resistenti ai farmaci e la co-infezione di M.tb e HIV devono essere affrontati con urgenza per controllare questa epidemia 1,34. Nuovi vaccini per sostituire o migliorare il BCG sono attualmente in fase di sperimentazione clinica e nuovi candidati potrebbero arrivare sul mercato nei prossimi anni35. Lo sviluppo di nuovi candidati vaccini contro la tubercolosi si basa su studi preclinici che utilizzano diversi modelli animali. La determinazione dell'efficacia del vaccino nei modelli animali richiede la quantificazione della carica batterica negli organi infetti per dimostrare l'effetto protettivo del vaccino 5,36. Attualmente, esistono metodi diretti e indiretti per quantificare la carica batterica nei topi infetti e nei primati non umani. I metodi diretti includono preparati istologici e colorazione batterica utilizzando auramine-o fluorescente e Ziehl-Neelsen37, la quantificazione della carica micobatterica in campioni basata su RT-qPCR38 e altri.

Il saggio di inibizione della crescita dei micobatteri (MGIA) è un test in vitro basato sul sistema BACTEC MGIT ed è un metodo sensibile utilizzato per quantificare la carica micobatterica viva in animali vaccinati e non vaccinati. Il sistema è uno strumento completamente automatizzato in grado di testare la presenza di micobatteri in provette appositamente progettate. Il flaconcino contiene un reporter fluorescente che reagisce alla concentrazione di ossigeno nel campione. La fluorescenza è proporzionale alla quantità di ossigeno consumata, dando un'indicazione del numero di batteri vivi presenti nel campione, ogni ora39. Nel metodo MGIA, PBMC e campioni di siero autologo vengono raccolti da animali e co-coltivati con micobatteri per 96 ore. Quindi, i monociti aderenti vengono lisati per rilasciare micobatteri intracellulari. Il sistema quantificherà indirettamente la carica batterica misurando il consumo di ossigeno40. Questo metodo è tipicamente utilizzato per gli studi sulla resistenza ai farmaci, ma è stato recentemente applicato alla valutazione dell'efficacia del vaccino contro la tubercolosi40.

Questi metodi possono essere integrati con la CFU standard per determinare il numero totale di micobatteri vitali. Ad esempio, la valutazione dei candidati vaccini in un esperimento di provocazione M.tb con aerosol murino si ottiene enumerando le colonie ottenute dai tessuti mediante CFU11.

Il metodo mCFU qui descritto può rappresentare un miglioramento sostanziale rispetto al metodo classico CFU, in quanto è più rapido da eseguire e poco costoso in termini di reagenti utilizzati e in termini di spazio di laboratorio richiesto. Questo metodo consente il confronto simultaneo di un ampio set di campioni in un singolo esperimento, riducendo così gli effetti delle variazioni da saggio a saggio. Ad esempio, come mostrato nell'esperimento descritto nella Figura 5, l'UFC è stato determinato per 1536 campioni utilizzando il metodo mCFU in 16 piastre di Petri quadrate, il che rappresenta una riduzione di 96 volte del numero di piastre utilizzate. Ciò è più rilevante per gli esperimenti che utilizzano campioni biologici e clinici primari, in cui la disponibilità può essere un problema. La forma compatta in cui le colonie sono visualizzate su una piastra di agar consente convenientemente l'uso di apparecchiature specializzate o comuni per la registrazione delle immagini. Questo, in combinazione con metodi automatizzati di conteggio delle colonie come quello descritto qui utilizzando il software Fiji, aiuta a ridurre la dipendenza dalla capacità dell'utente di identificare e quantificare la CFU. Ciononostante, come la tecnica CFU standard, questo metodo soffre dell'incapacità di distinguere le colonie fuse che porta a una potenziale sottorappresentazione della CFU. Tuttavia, questo può essere ridotto al minimo selezionando una diluizione più alta per eseguire la quantificazione o contando le colonie al microscopio prima che la loro crescita eccessiva si traduca in una fusione delle colonie. Ciò è più rilevante se il campione produce colonie con tassi di crescita eterogenei. In questi casi, i ricercatori dovrebbero convalidare l'implementazione di mCFU per le loro specifiche condizioni sperimentali.

I passaggi critici all'interno del protocollo sono i seguenti: le diluizioni seriali effettuate devono essere eseguite utilizzando una piastra a 96 pozzetti e le diluizioni devono essere accuratamente miscelate; la placcatura a microgocce deve essere eseguita con una pipetta multicanale da 0,5-10 μL per trasferire 5 μL da ciascuna fila della piastra a 96 pozzetti alla piastra quadrata del terreno solido, senza toccare e danneggiare il terreno; Il conteggio delle microcolonie deve essere eseguito tra i 6-10 giorni di incubazione. Tuttavia, al momento del conteggio, è necessario prestare attenzione per garantire che le colonie non siano eccessivamente grandi o troppo piccole.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi della tecnica includono l'utilizzo di diversi ceppi batterici. Pertanto, per ogni ceppo, è necessario utilizzare il terreno di coltura ottimale. I limiti della tecnica sono identici a quelli del metodo convenzionale CFU, che includono la difficoltà di enumerare i batteri a basse diluizioni. Inoltre, le limitazioni specifiche di questo metodo includono la necessità di utilizzare un microscopio per enumerare le colonie.

Infine, questo metodo può essere utilizzato per quantificare la carica batterica negli studi di vaccinazione contro la tubercolosi e per testare gli studi di resistenza/suscettibilità ai farmaci e gli studi di interazione ospite-patogeno. Ad esempio, la Figura 5 mostra l'applicazione di mCFU per la determinazione dell'uccisione intracellulare di ceppi di M.tb , compresi ceppi clinici, ceppi multi-resistenti ed estensivamente resistenti ai farmaci trattati con diverse formulazioni farmacologiche, nei macrofagi umani. È importante sottolineare che questo metodo può essere applicato anche a qualsiasi microrganismo, a condizione che siano soddisfatte le condizioni di coltura per ciascun organismo.

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Disclosures

DP e PJGB dichiarano che lo studio è stato condotto in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti interni della Facoltà di Medicina, Universidade Católica Portuguesa, e da finanziamenti esterni della Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), nell'ambito delle sovvenzioni UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 e EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates VWR 734-2781
DSLR 15-55 mm lens Nikon AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera Nikon D3400
DSLR macro lens Sigma MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum Gibco 10270106
Fiji Software https://fiji.sc/ Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896
L-glutamine Gibco 25030-081
Middlebrook 7H10 BD 262710
Middlebrook 7H9 BD 271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl) Gilson FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl) Gilson FA10011
Mycobacterium bovis BCG  American Type Culture Collection ATCC35734 strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment BD 211886
Phosphate buffered saline (PBS) NZYTech MB25201
RPMI 1640 medium Gibco 21875091
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC VWR 634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm Corning BP124-05
Tyloxapol Sigma-Aldrich T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H VWR 142-0051

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