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मानव शुक्राणु में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन मिथुमी

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65493
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

ERRATUM NOTICE

Summary

उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति द्वारा शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण एक बंद-कक्ष प्रणाली में स्वतंत्र रूप से चलने वाले शुक्राणुओं की ऑक्सीजन खपत के माप की अनुमति देता है। तकनीक को मानव शुक्राणु में श्वसन को मापने के लिए लागू किया जा सकता है, जो शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल विशेषताओं और अखंडता पर जानकारी प्रदान करता है।

Abstract

वीर्य की गुणवत्ता का अध्ययन अक्सर नियमित वीर्य विश्लेषण द्वारा किया जाता है, जो वर्णनात्मक और अक्सर अनिश्चित होता है। पुरुष बांझपन परिवर्तित शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि से जुड़ा हुआ है, इसलिए शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का माप शुक्राणु की गुणवत्ता का एक संकेतक है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति एक बंद-कक्ष प्रणाली में कोशिकाओं या ऊतकों की ऑक्सीजन की खपत को मापने की एक विधि है। इस तकनीक को मानव शुक्राणु में श्वसन को मापने के लिए लागू किया जा सकता है और शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया की गुणवत्ता और अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देती है, जो शुक्राणु के मामले में एक प्राथमिक लाभ है। इस तकनीक को बरकरार या परमेबिलाइज्ड शुक्राणु के साथ लागू किया जा सकता है और बरकरार शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और व्यक्तिगत श्वसन श्रृंखला परिसरों की गतिविधि के अध्ययन की अनुमति देता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ उपकरण ऑक्सीजन की खपत की गणना करने के लिए संवेदनशील सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने के लिए सेंसर का उपयोग करता है। डेटा का उपयोग ऑक्सीजन खपत अनुपात के आधार पर श्वसन सूचकांक की गणना करने के लिए किया जाता है। नतीजतन, सूचकांक दो ऑक्सीजन खपत दरों के अनुपात हैं और आंतरिक रूप से सेल संख्या या प्रोटीन द्रव्यमान के लिए सामान्यीकृत हैं। श्वसन सूचकांक शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और शिथिलता का एक संकेतक हैं।

Introduction

जोड़ों में बांझपन के सभी मामलों में पुरुष बांझपन 40% -50% के लिए जिम्मेदार होने का अनुमान है। पारंपरिक वीर्य विश्लेषण पुरुष प्रजनन क्षमता को निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, लगभग 15% पुरुषों में सामान्य शुक्राणु पैरामीटर2 होते हैं। इसके अलावा, नियमित वीर्य विश्लेषण शुक्राणु समारोह के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करता है और सूक्ष्म शुक्राणु दोषों को प्रतिबिंबित नहीं करताहै।

शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया में एक विशेष संरचना होती है, क्योंकि उन्हें फ्लैगेला के चारों ओर एक पेचदार म्यान के रूप में व्यवस्थित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल म्यान में इंटरमाइटोकॉन्ड्रियल लिंकर द्वारा जुड़े माइटोकॉन्ड्रिया की एक चर संख्या होती है और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली 4,5 पर प्रोटीन व्यवस्था के आदेश से साइटोस्केलेटन में लंगर डाला जाता है। यह संरचना शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना विशेष रूप से मुश्किल बनाती है। इसलिए, शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के अधिकांश अध्ययन सीटू विश्लेषण या डिमेम्ब्रेनेटेड शुक्राणु6 में उपयोग करते हैं।

शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और कार्य को लगातार पुरुष बांझपन 7,8,9,10,11 से जोड़ा गया है, यह सुझाव देते हुए कि इन ऑर्गेनेल की संरचना और कार्य का विश्लेषण शुक्राणु विश्लेषण में शामिल करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार हो सकता है।

माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर ऊर्जा चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (ओएक्सपीओएस) के माध्यम से एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उत्पादन करने के लिए ऑक्सीजन का उपयोग करके। शुक्राणुओं में, विशेष रूप से, एटीपी (ग्लाइकोलाइसिस बनाम ओएक्सपीओएस) का स्रोत विवादित है, और अधिकांश डेटा विवादास्पद बना हुआ है और विभिन्नप्रयोगात्मक दृष्टिकोणों 4,12,13 पर निर्भर करता है। ऑक्सीमेट्री द्वारा श्वसन के माप माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता और सेल14,15,16 के ऊर्जा चयापचय में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। परंपरागत रूप से, इस तकनीक को क्लार्क ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग करके किया गया है- एक उपकरण जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए 50 से अधिक वर्षों17,18 से किया गया है। इसके अलावा, शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत का विश्लेषण क्लासिक क्लार्क ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड 19,20,21 का उपयोग करके किया गया है। ऑक्सीग्राफ (ओरोबोरोस) का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति(एचआरआर) शास्त्रीय श्वास-रोमेट्री उपकरणों का उपयोग करने की तुलना में उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है। ऑक्सीग्राफ इंजेक्शन पोर्ट के साथ दो कक्षों से बने होते हैं, और प्रत्येक कक्ष में एक ध्रुवीय ऑक्सीजन सेंसर होता है। इस तकनीक के साथ, ऊतक स्लाइड, कोशिकाओं और पृथक माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन का विश्लेषण करना संभव है। नमूना लगातार कक्ष में हिलाया जाता है, और प्रयोग के दौरान, ऑक्सीजन की खपत को मापा जाता है, और विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ऑक्सीजन दरों की गणना की जाती है। कक्ष कम ऑक्सीजन रिसाव दिखाते हैं, जो पारंपरिक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड डिवाइस14,23 पर एक फायदा है।

अन्य कोशिकाओं के साथ, शुक्राणुओं के मामले में, एचआरआर उपकरण की संवेदनशीलता पारंपरिक श्वास-मिथुमिति की तुलना में अधिक है, जिसका अर्थ है कि एचआरआर उपकरण का उपयोग सीमित संख्या में बरकरार या परमेबिलाइज्ड शुक्राणु कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। एचआरआर द्वारा शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए दो मुख्य रणनीतियाँ हैं: (ए) बरकरार कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत को मापना, जिसमें ग्लूकोज जैसे सब्सट्रेट युक्त माध्यम में श्वसन समारोह को पुन: उत्पन्न करना शामिल है, या (बी) प्रत्येक फ़ंक्शन की अलग से निगरानी करने के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट्स के अलावा, ओएक्सपीएचओएस कॉम्प्लेक्स में से एक का उपयोग करके परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत को मापना।

वर्तमान अध्ययन में, हम मानव शुक्राणु कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन निर्धारित करने के लिए एचआरआर के उपयोग का वर्णन करते हैं।

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Protocol

प्रयोगों को संकाय डी मेडिसिना डी ला यूनिवर्सिड डी ला रिपुब्लिका, मोंटेवीडियो, उरुग्वे की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: बरकरार और परमेबिलाइज्ड मानव शुक्राणु में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति के लिए वर्कफ़्लो। प्रोटोकॉल को चार अलग-अलग चरणों में विभाजित किया गया था: 1) नमूना तैयार करना, 2) ओरोबोरोस उपकरण में ऑक्सीजन अंशांकन, 3) बरकरार और परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं के लिए ऑक्सीजन की खपत माप, और 4) उपकरण और विश्लेषण से डेटा निष्कर्षण। संक्षेप: CASA = कंप्यूटर-सहायता प्राप्त शुक्राणु विश्लेषण; बीडब्ल्यूडब्ल्यू = बिगर्स व्हिटन व्हिटिंगहैम माध्यम; एमआरएम = माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माध्यम; एडीपी = एडेनोसिन डाइफॉस्फेट; एफसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड -पी- ट्राइफ्लोरोमेथोक्सीफेनिलहाइड्राज़ोन; एए = एंटीमाइसिन ए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नोट: एचआरआर का उपयोग करके शुक्राणु कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए वर्कफ़्लो चित्रा 1 में दिखाया गया है। प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री, उपकरण और अभिकर्मकों पर जानकारी सामग्री की तालिका में प्रस्तुत की गई है।

1. नमूना तैयार करना

  1. नमूना संग्रह
    1. एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर में अनुशंसित 3 दिन के संयम के बाद हस्तमैथुन द्वारा ताजा स्खलित मानव वीर्य एकत्र करें। नमूने को तुरंत प्रयोगशाला में ले जाएं।
    2. पूरी तरह से24 को तरल ीकृत करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 30-60 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    3. द्रवीकरण के बाद, प्रयोग शुरू होने तक नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. कंप्यूटर-एडेड शुक्राणु विश्लेषण (CASA) के साथ शुक्राणु मूल्यांकन
    1. नमूना मिलाएं, और 7 μL को पूर्व-गर्म शुक्राणु गिनती कक्ष में लोड करें।
    2. कक्ष को प्रत्यक्ष प्रकाश माइक्रोस्कोप के पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) चरण पर रखें।
    3. कम्प्यूटरीकृत शुक्राणु विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और, गतिशीलता और एकाग्रता मॉड्यूल दर्ज करें ( मोट पर क्लिक करें)।
    4. उस विन्यास का चयन करें जो मानव शुक्राणु स्थितियों से मेल खाती है।
      नोट: कॉन्फ़िगरेशन को कक्ष के प्रकार और गहराई के साथ-साथ नमूना प्रजातियों और सिस्टम कासा के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    5. विश्लेषण बटन पर क्लिक करके यादृच्छिक रूप से प्रति कक्ष 10 अलग-अलग क्षेत्रों का विश्लेषण करें।
    6. नमूना एकाग्रता और गतिशीलता प्राप्त करने के लिए परिणाम पर क्लिक करें।
  3. सेल की तैयारी
    नोट: यदि HRR कैलिब्रेटेड नहीं है, तो कक्षों को तैयार करने से पहले चरण 2.1-2.2 से प्रारंभ करें (चरण 1.3). जब शुक्राणु कोशिकाओं को माध्यम में पुन: निलंबित किया जाता है तो तुरंत ऑक्सीजन की खपत को मापना महत्वपूर्ण होता है।
    1. आरटी में 10 मिनट के लिए 400 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सेमिनल प्लाज्मा को हटा दें, और पर्मेबिलाइज्ड कोशिकाओं के साथ अध्ययन के लिए बरकरार कोशिकाओं या माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माध्यम (एमआरएम) के साथ प्रयोगों के लिए बिगर्स व्हिटन व्हिटिंगहैम (बीडब्ल्यूडब्ल्यू) के 2 एमएल में शुक्राणुओं को फिर से निलंबित करें। मीडिया की रचनाओं को तालिका 1 में दिखाया गया है।
    3. शुक्राणु एकाग्रता अध्ययन के लिए चरण 1.2 में वर्णित चरणों को दोहराएं।

2. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमेट्री: ओएक्सपीएचओएस विश्लेषण।

नोट: एचआरआर अत्यधिक संवेदनशील ऑक्सीग्राफ (ऑक्सीग्राफ -2 के; सॉफ्टवेयर के साथ ओरोबोरोस इंस्ट्रूमेंट्स जीएमबीएच, इंसब्ब्रुक, ऑस्ट्रिया (डैटलैब, संस्करण 4.2; ओरोबोरोस इंस्ट्रूमेंट्स जीएमबीएच)। प्रयोगात्मक डेटा को ऑक्सीजन एकाग्रता बनाम समय (ओ2/106 कोशिकाओं के पीएमओएल के रूप में) और इन डेटा के वास्तविक समय परिवर्तनों के रूप में प्रदर्शित किया जाता है, जिससे प्रयोगकर्ता को जैविक और जैव रासायनिक नमूनों के श्वसन (ऑक्सीजन की खपत, ऑक्सीजन प्रवाह) को ट्रैक करने की अनुमति मिलती है, जबकि प्रयोग अभी भी चल रहा है। एचआरआर का उपयोग जीवित और मोटिव कोशिकाओं के श्वसन का पालन करने के लिए किया जा सकता है, जो शुक्राणु के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जिनकी गतिशीलता शुक्राणु की गुणवत्ता और प्रजनन क्षमता से जुड़ी है। प्रयोगशाला दो कक्षों के साथ एक एचआरआर ओरोबोरोस ऑक्सीग्राफ 2-के, ओरोबोरोस इंस्ट्रूमेंट्स का उपयोग करती है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों को दोनों 2 एमएल कक्षों के लिए स्वतंत्र रूप से किया जाना चाहिए।

  1. उपकरण की तैयारी
    1. एचआरआर चालू करें, और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए इसे श्वसनमिति सॉफ्टवेयर (डैटलैब) से कनेक्ट करें।
    2. ऑक्सीग्राफ कक्ष में 70% इथेनॉल को डीडीएच2ओ के साथ बदलें। इसे 750 आरपीएम पर कक्ष में चुंबकीय हलचल बार के साथ लगातार हिलाएं। इसे 10 मिनट के लिए छोड़ दें, और बाद में डबल-डिस्टिल्ड (डीडी) एच2ओ को हटा दें।
    3. हर बार 5 मिनट के लिए डीडीएच2ओ के साथ कक्ष को तीन बार धोएं।
      नोट: कक्षों से शेष इथेनॉल को हटाने के लिए यह कदम आवश्यक है। शुक्राणु कोशिकाएं इथेनॉल के प्रति बहुत संवेदनशील होती हैं। यदि यह चरण छोड़ दिया जाता है तो रिकॉर्डिंग से छेड़छाड़ की जा सकती है।
  2. ऑक्सीजन सेंसर का अंशांकन
    नोट: अंशांकन प्रक्रिया उपकरण के आधार पर थोड़ा भिन्न होती है। निर्माता25 द्वारा वर्णित ध्रुवीय ऑक्सीजन सेंसर का एक वायु अंशांकन करें। इस खंड में, अंशांकन प्रोटोकॉल को संक्षेप में समझाया गया है।
    1. कक्ष में सेल की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी माध्यम के डीडीएच 2 ओ, और पिपेट2एमएल को हटा दें। स्टॉपर रखें, एक एयर एक्सचेंज बुलबुला छोड़ दें।
      नोट: आवश्यक माध्यम की सटीक मात्रा निर्धारित करने के लिए कक्ष की मात्रा जानना महत्वपूर्ण है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए 750 आरपीएम पर स्टिर बार के साथ माध्यम को हिलाकर सेंसर झिल्ली के प्रदर्शन की निगरानी करने के लिए ऑक्सीजन अंशांकन मान रिकॉर्ड करें ( लेआउट > 01 कैलिब्रेशन एक्सप्रेस जीआर 3-टेम्प पर क्लिक करें)। अन्य सेटिंग्स का उपयोग करें जैसा कि उल्लेख किया गया है: सेंसर के लिए लाभ: 2; ध्रुवीकरण वोल्टेज: 800 एमवी; डेटा रिकॉर्डिंग अंतराल: 2.0 सेकंड।
      नोट: यह पोलरोग्राफिक सेंसर से एक स्थिर संकेत के साथ ±2 pmol-s-1-mL-1 के भीतर एकO2 ढलान असंशोधित (लाल रेखा) प्राप्त करने की उम्मीद है।
    3. बाएं माउस बटन और शिफ्ट कुंजी को दबाए रखते हुए माउस को खींचें ताकि उस क्षेत्र का चयन किया जा सके जहां ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तन (वाई 1 ओ 2 एकाग्रता, नीली रेखा) स्थिर है।
    4. ओ 2 अंशांकन विंडो खोलें (ऑक्सीग्राफ > ओ2 अंशांकन पर क्लिक करें)। एयर कैलिब्रेशन में, चयनित चिह्न को चरण 2.2.3 में चयनित क्षेत्र में परिवर्तित करें. कैलिब्रेट पर क्लिक करके समाप्त करें और क्लिपबोर्ड पर कॉपी करें।
    5. रिकॉर्डिंग बंद करें, और Oxygraph > Ok Control > Save और Disकनेक्ट पर क्लिक करके सहेजें।
      नोट: इस डेटासेट को सहेजना आवश्यक है ताकि इसका उपयोग दिन के सभी प्रयोगों में किया जा सके। अंशांकन प्रत्येक माध्यम के लिए प्रति दिन केवल एक बार किया जाता है।
  3. डिजिटोनिन-परमेबिलाइजेशन अनुमापन
    1. कक्ष खोलें, और माध्यम को अंदर रखें।
    2. कक्ष में कम से कम 24 x 10 6 और एमआरएम के 2 एमएल की अंतिम मात्रा में 70 x 106 शुक्राणु कोशिकाओं से अधिक लोड न करें।
      नोट: प्रयोग के अंत में ऑक्सीजन की खपत को समायोजित करने के लिए कक्ष में कोशिकाओं की संख्या को मापना महत्वपूर्ण है। अनुशंसित कोशिकाओं की कम संख्या को मापा नहीं जा सकता है।
    3. स्टॉपर को अंदर धकेलकर कक्ष को बंद करें, और शीर्ष पर शेष तरल को हटा दें। अंशांकन के लिए समान सेटिंग्स के साथ प्रयोग शुरू करें: सरगर्मी गति: 750 आरपीएम; तापमान: 37 डिग्री सेल्सियस; सेंसर के लिए लाभ: 2; ध्रुवीकरण वोल्टेज: 800 एमवी; और डेटा रिकॉर्डिंग अंतराल: 2.0 एस।
    4. अंशांकन लोड करने के लिए, निचले कोने में Pos कैलिब बॉक्स पर डबल-क्लिक करें। चरण 2.2 में किए गए अंशांकन को खोलें ( फ़ाइल से कॉपी > ऑक्सीग्राफ > ओ 2 अंशांकन पर क्लिक करें), और कैलिब्रेट पर क्लिक करें और क्लिपबोर्ड पर कॉपी करें।
      नोट: पीओएस कैलिब बॉक्स पीले से हरे रंग में बदल जाएगा। डेटा को प्रति वॉल्यूम चार्ट में ठीक किए गए ऑक्सीजन प्रवाह में प्रदर्शित किया जाता है (लेआउट 05 फ्लक्स प्रति वॉल्यूम असंशोधित)। ऑक्सीग्राफ > लेआउट में विभिन्न लेआउट उपलब्ध हैं।
    5. 0.5 एम एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) के 5 μL, 2 M ग्लूटामेट के 10 μL, और 0.4 M Malate के 2.5 μL (अंतिम सांद्रता: 1.25 mM, 10 mM, और 0.5 mM) जोड़ें। सिग्नल स्थिर होने तक ऑक्सीजन की खपत को मापें।
      नोट: स्टॉपर में लोडिंग पोर्ट के माध्यम से इंजेक्शन के लिए प्रेसिजन हैमिल्टन माइक्रो-सिरिंज का उपयोग किया जाता है। क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रति दवा एक सिरिंज का उपयोग करें। पंजीकरण करने के लिए एफ 4 पर क्लिक करें, और उपचार जोड़े जाने पर ऑक्सीजन रजिस्टर में चिह्नित करें।
      नोट: सब्सट्रेट ्स अल्ट्राप्योर पानी में तैयार किए जाते हैं और 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं।
    6. ऑक्सीजन की खपत अधिकतम स्तर तक पहुंचने तक लगातार चरणों में 10 एमएम डिजिटोनिन के 1 μL को जोड़कर ट्रिटेट करें।
      नोट: पानी, 70% इथेनॉल, और 100% इथेनॉल के साथ पूरी तरह से धोना आवश्यक है यदि एक ही कक्ष का उपयोग एक ही दिन में दो प्रयोगों के लिए किया जाता है।
      नोट: डिजिटोनिन अल्ट्राप्योर पानी में तैयार किया जाता है और 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  4. बरकरार और परमेबिलाइज्ड शुक्राणु कोशिकाओं (कॉम्प्लेक्स I या कॉम्प्लेक्स II) के लिए नियमित श्वसन मूल्यांकन प्रोटोकॉल
    1. कक्ष खोलें, और माध्यम को अंदर रखें।
    2. कक्ष में कम से कम 24 x 10 6 और 70 x 106 शुक्राणु कोशिकाओं को बीडब्ल्यूडब्ल्यू (बरकरार सेल विश्लेषण) या एमआरएम (परमेबिलाइज्ड सेल विश्लेषण) के 2 एमएल की अंतिम मात्रा में लोड करें।
    3. अंशांकन के लिए समान सेटिंग्स के साथ प्रयोग प्रारंभ करें (यह चरण 2.3.3 में वर्णित है)।
    4. चरण 2.3.4 में वर्णित चरण 2.2 में किए गए अंशांकन को लोड करें।
    5. कोशिकाओं के श्वसन को कम से कम 5 मिनट के लिए रिकॉर्ड करें जब तक कि एक स्थिर संकेत प्राप्त न हो। यह माप बरकरार कोशिकाओं में बेसल श्वसन से मेल खाती है।
    6. यदि प्रयोग बरकरार कोशिकाओं के साथ है, तो चरण 2.4.9 पर आगे बढ़ें। परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं के लिए, 10 एमएम डिजिटोनिन के 4.5 μL इंजेक्ट करें (अंतिम एकाग्रता: 22.5 μM)। 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को गर्म करें।
    7. सब्सट्रेट्स जोड़ें: कॉम्प्लेक्स I के लिए 2 M ग्लूटामेट का 10 μL और 0.4 M Malate का 2.5 μL (अंतिम सांद्रता: 10 mM और 0.5 mM, क्रमशः) या कॉम्प्लेक्स II के लिए 1 M सक्सिनेट का 20 μL (अंतिम एकाग्रता: 10 mM)। ऑक्सीजन की खपत को तब तक मापें जब तक कि सिग्नल बढ़ और स्थिर न हो जाए। यह अवस्था 4 है, जिसका अर्थ है एडीपी की अनुपस्थिति में बेसल कॉम्प्लेक्स I या बेसल कॉम्प्लेक्स II समर्थित श्वसन।
      नोट: सब्सट्रेट ्स अल्ट्राप्योर पानी में तैयार किए जाते हैं और 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं।
    8. 0.5 एम एडीपी के 5 μL इंजेक्ट करें (अंतिम एकाग्रता: 1.25 mM)। ऑक्सीजन की खपत को तब तक मापें जब तक कि सिग्नल बढ़ और स्थिर न हो जाए। एडीपी को जोड़ने से कॉम्प्लेक्स I या कॉम्प्लेक्स II (राज्य 3, परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं में) के माध्यम से अधिकतम ऑक्सीजन की खपत के अनुरूप संकेत बढ़ जाता है।
    9. 4 मिलीग्राम / एमएल ऑलिगोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता: 2 μg / mL), एक एटीपी सिंथेटेस अवरोधक के 1 μL जोड़ें। ऑक्सीजन की खपत को तब तक मापें जब तक कि सिग्नल कम न हो जाए और स्थिर न हो जाए।
      नोट: ऑलिगोमाइसिन इथेनॉल में तैयार किया जाता है और 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
    10. 0.1 एमएम के 1 μL को 1 mM कार्बोनिल साइनाइड-पी-ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी-फेनिलहाइड्राज़ोन (FCCP) को क्रमिक चरणों में जोड़कर टिट्रेट करें जब तक कि अधिकतम अयुग्मित श्वसन दर तक नहीं पहुंच जाती। ऑक्सीजन की खपत को तब तक मापें जब तक कि सिग्नल बढ़ और स्थिर न हो जाए।
      नोट: एफसीसीपी इथेनॉल में तैयार किया जाता है और 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
    11. एफसीसीपी की अंतिम एकाग्रता नमूना-निर्भर है। जब ऑक्सीजन की खपत कम होने लगे तो दवा को इंजेक्ट करना बंद कर दें।
    12. अंत में, 5 mM एंटीमाइसिन A (2.5 μM अंतिम एकाग्रता) के 1 μL इंजेक्ट करें। यह माइटोकॉन्ड्रियल और अवशिष्ट ऑक्सीजन खपत (गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन) के बीच भेदभाव करने के लिए एक जटिल III अवरोधक है। कॉम्प्लेक्स I के विश्लेषण के लिए, एए के बजाय इस कॉम्प्लेक्स के अवरोधक 1 mM rotenone (0.5 μM अंतिम एकाग्रता) के 1 μL जोड़ें। ऑक्सीजन की खपत को तब तक मापें जब तक कि सिग्नल कम न हो जाए और स्थिर न हो जाए।
      नोट: दवाओं को इथेनॉल में तैयार किया जाता है और 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

3. डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण

Figure 2
चित्रा 2: एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति प्रयोग से श्वसन मापदंडों का अधिग्रहण। (ए, बी) रेखांकन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, जैसा कि चित्र 1 में वर्णित है, क्रमशः बरकरार और परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं के लिए। इन मापदंडों को पहले15 वर्णित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. बाएं माउस बटन और शिफ्ट कुंजी दबाकर माउस को उन क्षेत्रों का चयन करने के लिए खींचें जहां प्रति वॉल्यूम ऑक्सीजन फ्लक्स सहसंबद्ध है (वाई 2 ओ 2 ढलान अनकोर, लाल रेखा) सब्सट्रेट या अवरोधक के इंजेक्शन के बाद स्थिर है। चित्रा 2 पहले वर्णितरजिस्टर से प्राप्त विभिन्न मापदंडों को दर्शाता है।
    नोट: पैरामीटर प्रयोग पर निर्भर करते हैं; वे सभी इस प्रकार हैं: बरकरार कोशिकाओं में बेसल श्वसन और ग्लूटामेट / मैलेट या सक्सिनेट (राज्य 4), एडीपी (राज्य 3), ऑलिगोमाइसिन (प्रोटॉन रिसाव), एफसीसीपी (अधिकतम श्वसन दर), रोटेनोन / एए (गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन) की उपस्थिति में श्वसन। परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं में, बेसल श्वसन अवस्था 3 से मेल खाती है।
  2. मार्क्स > स्टैटिस्टिक्स विंडो पर क्लिक करें, और डेटा निर्यात करें।
  3. प्रति 1 मिलियन शुक्राणु कोशिकाओं में प्राप्त डेटा को सामान्य करें। ढलानों की इकाइयाँ pmolO 2.s-1.mL-10−6 कोशिकाएँ हैं।
  4. सूचकांकों की गणना करने से पहले सभी मूल्यों से गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत को घटाएं।
  5. पहलेवर्णित विभिन्न समीकरणों का उपयोग करके सूचकांकों की गणना करें:
    Equation 1

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Representative Results

शुक्राणु कोशिकाओं में डिजिटोनिन की इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव शुक्राणु कोशिकाओं में OXPHOS में वास्तविक समय के परिवर्तनों की निगरानी के लिए HRR के उपयोग को प्रस्तुत करते हैं। चूंकि विधि का उपयोग बरकरार या डिजिटोनिन-परमेबिलाइज्ड शुक्राणु का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, इसलिए हम पहले शुक्राणु कोशिकाओं को परमेबिलाइज करने के लिए आवश्यक डिजिटोनिन एकाग्रता के मानकीकरण को प्रस्तुत करते हैं (चित्रा 3)।

डिजिटोनिन का उपयोग रासायनिक परमेबिलाइजेशन के लिए किया जाता है, जो सब्सट्रेट्स को कोशिकाओं में प्रवेश करने और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को मापने की अनुमति देता है। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली अखंडता से समझौता किए बिना कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक इष्टतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इस यौगिक को बरकरार कोशिकाओं में टाइट किया जाना चाहिए। हमने एडीपी, ग्लूटामेट और मैलेट की उपस्थिति में एक अनुमापन किया। श्वसन दर को बेसलाइन पर और डिजिटोनिन के क्रमिक जोड़ के बाद मापा गया था (चित्रा 3 ए)। डिटर्जेंट एकाग्रता बढ़ने के साथ ऑक्सीजन की खपत बढ़ जाती है और एक ऐसे बिंदु तक पहुंच जाती है जहां बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की अखंडता से समझौता किया जाने लगता है ( चित्रा 3 ए में लाल तीर)। चित्रा 3 बी 4 प्रतिनिधि प्रयोगों की औसत ± मानक त्रुटि दिखाता है। परिणाम से पता चलता है कि 22.5 μM (चित्रा 3 ए, बी) की डिजिटोनिन एकाग्रता पर परमेबिलाइजेशन इष्टतम है। माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि कम हो जाती है जब बहुत अधिक मात्रा में डिजिटोनिन का उपयोग किया जाता है।

एचआरआर द्वारा शुक्राणु श्वसन के सफल और उप-मानक रजिस्टर का प्रतिनिधित्व
शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की निगरानी के दौरान, रजिस्टर को ओ 2 एकाग्रता (नीली रेखा) और ओ 2 प्रवाह प्रति मात्रा सहसंबद्ध (लाल रेखा) के रूप में देखा जा सकता है, जिसकी गणना डैटलैब 4 विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ की जाती है। चित्र 4 वीर्य के नमूने से बरकरार (चित्रा 4 ए, बी) और डिजिटोनिन-परमेबिलाइज्ड (चित्रा 4 सी, डी) शुक्राणु कोशिकाओं के प्रतिनिधि वक्र दिखाता है। चित्रा 4 ए वीर्य के नमूने से बरकरार शुक्राणु कोशिकाओं की एक सफल रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करता है, जहां ऑक्सीजन की खपत को संशोधित करने वाली दवाओं के प्रभाव देखे जाते हैं, और सूचकांकों की गणना के लिए मापदंडों को निकालना संभव है। एक्सोजेनस सब्सट्रेट्स की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत द्वारा बरकरार कोशिकाओं में बेसल श्वसन दर्ज किया जाता है। फिर, गैर-फॉस्फोराइलिंग श्वसन दर को एटीपी सिंथेज़ अवरोधक (ऑलिगोमाइसिन) जोड़कर मापा गया था। इसके बाद, प्रोटोनोफोर एफसीसीपी को विभिन्न सांद्रता में इंजेक्ट किया गया था और अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल अयुग्मित श्वसन दर निर्धारित की गई थी। यह दवा आंतरिक झिल्ली की प्रोटॉन पारगम्यता में वृद्धि की ओर ले जाती है, जो प्रोटॉन के निष्क्रिय आंदोलन को केमियोस्मोटिक ढाल को नष्ट करने की अनुमति देती है जो ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि का कारण बनती है। अंत में, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को रोकने के लिए एए को जोड़ा गया था।

प्राप्त डेटा की गुणवत्ता सेल नंबर से निकटता से संबंधित है। एक अच्छा रिकॉर्ड प्राप्त करने के लिए उच्च बेसल ऑक्सीजन की खपत होना महत्वपूर्ण है। बाद का विश्लेषण ओ2 खपत में सूक्ष्म परिवर्तनों पर निर्भर करता है जो बेसल लाइन पर्याप्त उच्च नहीं होने पर पता नहीं लगाया जा सकता है। अनुशंसित से कम सेल गणना चित्रा 4 बी जैसे परिणाम का कारण बन सकती है।

जटिल I या II विशिष्ट सब्सट्रेट्स के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि वक्र क्रमशः चित्रा 4 C और चित्रा 4D में दिखाए गए हैं। माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स I या कॉम्प्लेक्स II के माध्यम से ऑक्सीजन की खपत का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं के परमेबिलाइजेशन के बाद सब्सट्रेट ्स मैलेट और ग्लूटामेट या सक्सिनेट को जोड़ा गया था। फिर, एटीपी (राज्य 3, सक्रिय परिसर I या II निर्भर श्वसन) में रूपांतरण के लिए एडीपी जोड़ा जाता है। अंत में, रोटेनोन या एए को क्रमशः कॉम्प्लेक्स I या II को रोकने के लिए प्रशासित किया जाता है।

परिणामों की व्याख्या के लिए, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि ऑलिगोमाइसिन द्वारा बाधित सेलुलर श्वसन बरकरार कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में प्रोटॉन रिसाव दर का प्रत्यक्ष माप है, जो परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं (एडीपी के बिना) की स्थिति 4 के बराबर है (चित्रा 2 बी)। बरकरार कोशिकाओं (गैर-परमेबिलाइज्ड) के मामले में, यह राशि बेसल माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत के अंश को इंगित करती है जो एटीपी संश्लेषण से स्वतंत्र है। एफसीसीपी की कई खुराक जोड़ने के बाद अधिकतम श्वसन दर तक पहुंच जाती है। बरकरार कोशिकाओं में दो कारकों पर निर्भर करता है; इलेक्ट्रॉन परिवहन परिसरों की गतिविधि और प्रत्येक कोशिका में माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या। एडीपी को जोड़ने के बाद परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं की अवस्था 3 बहिर्जात सब्सट्रेट्स (चित्रा 2 बी)7 की संतृप्त सांद्रता पर बरकरार सेल के बेसल श्वसन जैसा दिखता है। तालिका 2 चित्र 4 में रिकॉर्ड से गणना किए गए सूचकांकों का एक उदाहरण दिखाती है।

Figure 3
चित्रा 3: मानव शुक्राणु कोशिकाओं के परमेबिलाइजेशन के लिए डिजिटोनिन की इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण। ग्लूटामेट, मैलेट और एडेनोसिन डाइफॉस्फेट के साथ एमआरएम माध्यम में श्वसन दर 37 डिग्री सेल्सियस पर मापी गई थी। (ए) प्रतिनिधि श्वसन ट्रेस। नीली रेखा ओ 2 एकाग्रता है, और लाल रेखा प्रति आयतन सहसंबद्ध ओ2 प्रवाह का प्रतिनिधित्व करती है। (बी) माइटोकॉन्ड्रिया श्वसन दर का अर्थ है ± मानक त्रुटि, एन = 4। लाल तीर इष्टतम एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षिप्त नाम: डिग = डिजिटोनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ओरोबोरोस उपकरण का उपयोग करके प्राप्त ऑक्सीजन खपत दर के लिए प्रतिनिधि श्वसन निशान। श्वसन दर को (ए, बी) बरकरार और (सी, डी) परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं में 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया था। नीली रेखा ओ 2 एकाग्रता है, और लाल रेखा प्रति आयतन सहसंबद्ध ओ2 प्रवाह का प्रतिनिधित्व करती है। ए, सी, और डी में दरों को 30 x 10 6 शुक्राणु कोशिकाओं से अधिक मापा गया था, जबकि बी में दर 14 x 106 शुक्राणु कोशिकाओं के साथ मापा गया था। संक्षेप: ओलिगो = ऑलिगोमाइसिन; एफसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड -पी- ट्राइफ्लोरोमेथोक्सीफेनिलहाइड्राज़ोन; ग्लू/मल = ग्लूटामेट/मैलेट; एडीपी = एडेनोसिन डाइफॉस्फेट; एए = एंटीमाइसिन ए; सड़न = रोटोनोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: क्रमशः बरकरार या परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए बीडब्ल्यूडब्ल्यू और एमआरएम मीडिया की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: एचआरआर सूचकांक के प्रतिनिधि उदाहरण। चित्र 4 में दिखाए गए निशान से डेटा प्राप्त किया गया था। सूचकांकों की गणना चित्रा 2 और प्रोटोकॉल खंड 3 के अनुसार की गई थी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

एचआरआर गंभीर रूप से कई चरणों पर निर्भर करता है: (ए) उपकरण रखरखाव, (बी) ऑक्सीजन सेंसर का सटीक अंशांकन, (सी) अनकपलर अनुमापन26, और अंत में, (डी) माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का प्रतिनिधित्व करने वाले सूचकांकों का पर्याप्त उपयोग। उपकरण का रखरखाव महत्वपूर्ण है। नियमित रूप से ध्रुवीय ऑक्सीजन सेंसर की झिल्ली को बदलने और वाद्य पृष्ठभूमि को सही करने की सिफारिश की जाती है। कक्षों से शुक्राणुओं के संग्रह के बाद व्यापक धुलाई अच्छी प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, खासकर उन प्रयोगशालाओं में जिनमें उपकरणों का उपयोग अक्सर विभिन्न ऊतकों या कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। शुक्राणु रोटेनोन, एए, ऑलिगोमाइसिन और एफसीसीपी की थोड़ी मात्रा के प्रति भी संवेदनशील होते हैं, इसलिए धोने के चरण को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए (इथेनॉल के साथ कम से कम तीन बार और आसुत जल के साथ तीन बार)। अंशांकन एक महत्वपूर्ण कदम है; यह हर दिन और उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक मीडिया के लिए किया जाना चाहिए (प्रोटोकॉल चरण 2.2 देखें)। अनकपलर अनुमापन को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए, क्योंकि प्रवाह की अधिकतम उत्तेजना प्राप्त करने और अति-अनुमापन से बचने के लिए इष्टतम अनकपलर सांद्रता का उपयोग किया जाना चाहिए, जो विरोधाभासी रूप से श्वसनको रोकता है। इष्टतम अनकपलर एकाग्रता सेल प्रकार, सेल एकाग्रता और माध्यम पर निर्भर करती है और बरकरार कोशिकाओं की तुलना में परमेबिलाइज्डकोशिकाओं के लिए अलग है। इस प्रकार, शुक्राणु के नमूनों के मामले में, जिसमें शुक्राणु कोशिकाएं विषम हो सकती हैं, अनकपलर को प्रत्येक नमूने28,29,30 के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। श्वसनमिति के बाद, कई पैरामीटर प्राप्त किए जाते हैं जिन्हें विश्लेषण से पहले कोशिकाओं की संख्या के लिए सही किया जाना चाहिए। तीन सूचकांकों की गणना की जाती है जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की व्याख्या के लिए अनुमति देते हैं, और इनमें माइटोकॉन्ड्रिया और कोशिकाओं की संख्या से स्वतंत्र होने का लाभ होता है। हम श्वसन नियंत्रण अनुपात (आरसीआर) के उपयोग पर प्रकाश डालते हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन की दक्षता को इंगित करता है और शिथिलता7 के कई संभावित साइटों के प्रति संवेदनशील है। हालांकि, प्रयोग31 के आधार पर अन्य मापदंडों और सूचकांकों का उपयोग किया जा सकता है।

एचआरआर की सीमाएं निम्नानुसार हैं: (ए) डिवाइस स्वचालित नहीं है, इसलिए इसे ऑपरेटर की निरंतर उपस्थिति की आवश्यकता होती है और समय लेने वाला होता है; (बी) एचआरआर डिवाइस में केवल दो कक्ष हैं, और केवल दो परख एक साथ किए जा सकते हैं; (सी) कक्ष एकल-उपयोग नहीं हैं और अवरोधकों या किसी अन्य प्रकार के ऊतक से दूषित हो सकते हैं; (घ) यद्यपि उपकरण की संवेदनशीलता बहुत अधिक है, हमारी टीम ने पाया कि ऑक्सीजन की खपत में भिन्नता का पता लगाने के लिए कम से कम 12 मिलियन/एमएल शुक्राणु की आवश्यकता होती है, इसलिए हम ऑलिगोज़ोस्पर्मिक पुरुषों से शुक्राणु को माप नहीं सके; और (ई) ऑपरेटर को पता होना चाहिए कि माप नमूने में मौजूद सभी कोशिकाओं के लिए हैं। वीर्य के नमूने विषम होते हैं और इसमें अन्य सेल प्रकार (जैसे, ल्यूकोसाइट्स) होते हैं। संदूषण से बचने के लिए, ल्यूकोसाइट्स7 की कम सांद्रता वाले नमूनों का उपयोग करना आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, ऑक्सीमीटर प्रयोगों (जैसे, तैरना-ऊपर या तैरना-नीचे) से पहले एक अतिरिक्त शुक्राणु शोधन चरण किया जा सकता है।

एचआरआर का एक विकल्प बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग है। शुक्राणु चयापचय को मापने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ पर बाह्य प्रवाह विश्लेषक के फायदे निम्नानुसार हैं: (ए) बाह्य प्रवाह विश्लेषक एक बड़े पैमाने पर स्वचालित उपकरण है; (बी) यह उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए 24-वेल और 96-वेल प्लेटों में ऑक्सीजन की खपत को माप सकता है, जिसका अर्थ है कि इसके लिए जैविक नमूनों की थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है; और (सी) यह शुक्राणु ग्लाइकोलाइटिक फ्लक्स के अतिरिक्त माप की अनुमति देता है। बाह्य प्रवाह विश्लेषक पर एचआरआर के कुछ फायदे इस प्रकार हैं: (ए) एचआरआर के साथ, उपकरण और उपभोग्य सामग्रियों की लागत कम है; (बी) एचआरआर के साथ, बाह्य प्रवाह विश्लेषक के रूप में प्रत्येक माप की तीन से चार प्रतिकृतियों की आवश्यकता नहीं होती है, जिसके लिए उच्च प्रतिदीप्ति परिवर्तनशीलता को संबोधित करने के लिए इन प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है; (ग) एचआरआर के साथ सब्सट्रेट अनकपलर इनहिबिटर अनुमापन प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता अधिक है; और (ग) कोशिकाओं की गति में निगरानी की जाती है और संलग्न नहीं होती है। ऑक्सीमेट्री मोटिव (जीवित) और बरकरार (गैर-परमेबिलाइज्ड) शुक्राणु 7,31,32 की ऑक्सीजन खपत का विश्लेषण कर सकती है। यह शुक्राणु के मामले में एक फायदा है क्योंकि प्लास्टिक की सतह पर शुक्राणु आसंजन संभावित रूप से उनके आंदोलन पैटर्न और कार्य को बदल सकता है।

एचआरआर पारंपरिक श्वास-मिथुमिति की तुलना में अधिक संवेदनशील है और मानव शुक्राणु में चिकित्सा उपयोग के लिए उपयुक्त है, जिसके लिए प्रत्येक वीर्य के नमूने से कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि नहीं की जा सकती है (जैसे सुसंस्कृत कोशिकाएं)। इस तकनीक का उपयोग सामान्य और बांझ दोनों पुरुषों से अधिकांश वीर्य के नमूनों से शुक्राणु श्वसन की निगरानी के लिए किया जा सकता है। आरसीआर का उपयोग मानव शुक्राणु कार्यात्मक स्थिति के एक अच्छे संकेतक के रूप में किया जा सकता है, और 3.15 का कट-ऑफ मूल्य (संवेदनशीलता और विशिष्टता क्रमशः 73% और 61%) सामान्य और असामान्य पारंपरिक वीर्यविश्लेषण के साथ शुक्राणु के नमूनों के बीच अंतर करता है। एचआरआर का उपयोग शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय को समझने के लिए किया जा सकता है, जो पुरुष बांझपन के लिए जिम्मेदार हो सकता है, और मानक वीर्य विश्लेषण का पूरक हो सकता है।

ओरोबोरो उपकरणों की नवीनतम नई पीढ़ी अन्य शुक्राणु कार्यों के साथ संयोजन में ऑक्सीजन की खपत के विश्लेषण की अनुमति देती है, जैसे कि एच 2 ओ2का उत्पादन, और शुक्राणु समारोह को समझने में मदद कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम फर्टिलब एंड्रोलॉजी क्लिनिक, विशेष रूप से जोस मारिया मोंटेस और एंड्रिया टोरेंट्स को धन्यवाद देना चाहते हैं, जिन्होंने हमें दाताओं तक पहुंच की अनुमति दी। फंडिंग: एसी Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021) से अनुदान द्वारा समर्थित है। अतिरिक्त धन प्रोग्रामा डी डेसररोलो डी सिएनसियास बासिकास (पेडेसिबा, उरुग्वे) से प्राप्त किया गया था। पी.आई. और आर.एस. Universidad de la República (I+D, CSIC 2014) द्वारा समर्थित हैं; आई + डी, सीएसआईसी 2016, इनिशिएशियन ए ला इन्वेस्टिगासियोन, सीएसआईसी 2019 और FMV_1_2017_1_136490 एएनआईआई- उरुग्वे)। पी.आई. POS_FMV_2018_1_1007814 और सीएपी-यूडीईएलएआर 2020 द्वारा समर्थित है। आंकड़ों को Biorender.com का उपयोग करके चित्रित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid free- Bovine serum albumine Sigma Aldrich A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma Aldrich A5285
Animycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920
DatLab sofware version 4,2 Oroboros Instruments GmbH N/A
D-glucose Sigma Aldrich G7021
Digitonin Sigma Aldrich D141
EGTA Sigma Aldrich E4378
HEPES Sigma Aldrich H3375
L glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L malic acid Sigma Aldrich M1000
Magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Microliter Syringes Hamilton 87900 or 80400
Microscope camera Basler acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ Nikon N/A
Monopotassium phosphate Sigma Aldrich P5655
MOPS Sigma Aldrich M1254
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Oxygraph-2 K Oroboros Instruments GmbH N/A
Potassium chloride Sigma Aldrich P3911
Power O2k-Respirometer Oroboros Intruments 10033-01
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saccharose Sigma Aldrich S0389
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium lactate Sigma Aldrich L7022
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research Microptic N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600 Millennium Sciences CELL-VU N/A
Succinate disodium salt Sigma Aldrich W327700

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References

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उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमेट्री माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन मानव शुक्राणु वीर्य की गुणवत्ता शुक्राणु विश्लेषण पुरुष बांझपन शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि ऑक्सीजन की खपत बंद-कक्ष प्रणाली शुक्राणु की गुणवत्ता शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया बरकरार शुक्राणु परमेबिलाइज्ड शुक्राणु श्वसन श्रृंखला परिसर उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ उपकरण ऑक्सीजन एकाग्रता ऑक्सीजन खपत दर श्वसन सूचकांक।

Erratum

Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 09/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

मानव शुक्राणु में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन मिथुमी
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Irigoyen, P., Sapiro, R., Cassina, A. High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. J. Vis. Exp. (196), e65493, doi:10.3791/65493 (2023).

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