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Biology

Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

In dieser Arbeit stellen wir zwei Protokolle zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogelmatrices vor, ohne dass eine externe Flüssigphase erforderlich ist.

Abstract

Synthetische Gennetzwerke bieten Wissenschaftlern und Ingenieuren eine Plattform, um neuartige Systeme mit Funktionen zu entwerfen und zu bauen, die auf genetischer Ebene kodiert sind. Während das vorherrschende Paradigma für den Einsatz von Gennetzwerken innerhalb eines zellulären Chassis liegt, können synthetische Gennetzwerke auch in zellfreien Umgebungen eingesetzt werden. Zu den vielversprechenden Anwendungen zellfreier Gennetzwerke gehören Biosensoren, da diese Geräte gegen biotische (Ebola-, Zika- und SARS-CoV-2-Viren) und abiotische (Schwermetalle, Sulfide, Pestizide und andere organische Verunreinigungen) Ziele nachgewiesen wurden. Zellfreie Systeme werden in der Regel in flüssiger Form in einem Reaktionsgefäß eingesetzt. Die Möglichkeit, solche Reaktionen in eine physikalische Matrix einzubetten, kann jedoch ihre breitere Anwendung in einer breiteren Palette von Umgebungen erleichtern. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Einbettung von Reaktionen der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) in eine Vielzahl von Hydrogelmatrices entwickelt. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Hydrogelen, die für diese Arbeit förderlich sind, ist die hohe Wasserrekonstitutionskapazität von Hydrogelmaterialien. Darüber hinaus besitzen Hydrogele physikalische und chemische Eigenschaften, die funktionell vorteilhaft sind. Hydrogele können für die Lagerung gefriergetrocknet und für die spätere Verwendung rehydriert werden. Es werden zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle für den Einschluss und die Analyse von CFPS-Reaktionen in Hydrogelen vorgestellt. Zunächst kann ein CFPS-System durch Rehydrierung mit einem Zelllysat in ein Hydrogel eingebaut werden. Das System innerhalb des Hydrogels kann dann für eine vollständige Proteinexpression durch das Hydrogel induziert oder konstitutiv exprimiert werden. Zweitens kann Zelllysat am Punkt der Polymerisation in ein Hydrogel eingebracht werden, und das gesamte System kann gefriergetrocknet und zu einem späteren Zeitpunkt mit einer wässrigen Lösung rehydriert werden, die den Induktor für das in dem Hydrogel kodierte Expressionssystem enthält. Diese Methoden haben das Potenzial, zellfreie Gennetzwerke zu ermöglichen, die Hydrogelmaterialien sensorische Fähigkeiten verleihen, mit dem Potenzial, über das Labor hinaus eingesetzt zu werden.

Introduction

Die synthetische Biologie integriert verschiedene Ingenieurdisziplinen, um biologisch basierte Teile, Geräte und Systeme zu entwerfen und zu konstruieren, die Funktionen ausführen können, die in der Natur nicht vorkommen. Die meisten Ansätze der synthetischen Biologie sind immer noch an lebende Zellen gebunden. Im Gegensatz dazu ermöglichen zellfreie Systeme der synthetischen Biologie ein noch nie dagewesenes Maß an Kontrolle und Freiheit beim Design, was eine erhöhte Flexibilität und eine verkürzte Zeit für die Entwicklung biologischer Systeme ermöglicht und gleichzeitig viele der Einschränkungen herkömmlicher zellbasierter Genexpressionsmethoden beseitigt 1,2,3. CFPS wird in einer zunehmenden Anzahl von Anwendungen in zahlreichen Disziplinen eingesetzt, darunter die Konstruktion künstlicher Zellen, das Prototyping genetischer Schaltkreise, die Entwicklung von Biosensoren und die Herstellung von Metaboliten 4,5,6. CFPS ist auch besonders nützlich für die Herstellung rekombinanter Proteine, die in lebenden Zellen nicht ohne weiteres exprimiert werden können, wie z. B. aggregationsanfällige Proteine, Transmembranproteine und toxische Proteine 6,7,8.

CFPS wird in der Regel in flüssigen Reaktionen durchgeführt. Dies kann jedoch ihren Einsatz in einigen Situationen einschränken, da jede flüssigkeitszellfreie Vorrichtung in einem Reaktionsgefäß enthalten sein muss. Der Grundgedanke für die Entwicklung der hier vorgestellten Methoden bestand darin, robuste Protokolle für die Einbettung zellfreier Geräte der synthetischen Biologie in Hydrogele bereitzustellen, nicht als Proteinproduktionsplattform an sich, sondern um die Verwendung von Hydrogelen als physisches Chassis für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors zu ermöglichen. Die Verwendung von Hydrogelen als CFPS-Chassis hat mehrere Vorteile. Hydrogele sind polymere Materialien, die trotz eines hohen Wassergehalts (manchmal über 98%) feste Eigenschaftenbesitzen 9,10,11. Sie werden als Pasten, Gleitmittel und Klebstoffe verwendet und sind in so unterschiedlichen Produkten wie Kontaktlinsen, Wundauflagen, Marineklebebändern, Bodenverbesserungsmitteln und Babywindeln enthalten 9,11,12,13,14. Hydrogele werden auch aktiv als Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten untersucht 9,15,16,17. Hydrogele können auch biokompatibel und biologisch abbaubar sein und einige eigene Reizreaktionen besitzen 9,18,19,20. Ziel ist es daher, eine Synergie zwischen molekularbiologischer Funktionalität und Materialwissenschaft zu schaffen. Zu diesem Zweck wurden Anstrengungen unternommen, die zellfreie synthetische Biologie mit einer Reihe von Materialien zu integrieren, darunter Kollagen, Laponit, Polyacrylamid, Fibrin, PEG-Peptid und Agarose 11,21,22 sowie Oberflächen aus Glas, Papier und Stoff zu beschichten 11,23,24 mit CFPS-Geräten. Die hier vorgestellten Protokolle demonstrieren zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen im Makromaßstab (d. h. >1 mm), wobei Agarose als Beispielmaterial verwendet wird. Agarose wurde aufgrund ihrer hohen Wasseraufnahmefähigkeit, ihrer kontrollierten Selbstgelierungseigenschaften und ihrer einstellbaren mechanischen Eigenschaften ausgewählt 11,24,25,26. Agarose unterstützt auch funktionelle CFPS, ist billiger als viele andere Hydrogel-Alternativen und biologisch abbaubar, was sie zu einer attraktiven Wahl als experimentelles Modellsystem macht. Diese Methoden haben sich jedoch bereits als geeignet für die Einbettung von CFPS in eine Reihe alternativer Hydrogele erwiesen11. Unter Berücksichtigung des breiten Anwendungsspektrums von Hydrogelen und der Funktionalität von CFPS können die hier vorgestellten Methoden eine Grundlage bieten, auf der Forscher biologisch verbesserte Hydrogelmaterialien entwickeln können, die für ihre Zwecke geeignet sind.

In früheren Studien wurden Mikrogelsysteme mit einem Größenbereich von 1 μm bis 400 μm verwendet, um CFPS in Hydrogelen durchzuführen, die in den Reaktionspuffer 23,27,28,29,30,31 getaucht sind. Die Anforderung, Hydrogele in CFPS-Reaktionspuffer einzutauchen, schränkt jedoch die Möglichkeiten für ihren Einsatz als eigenständige Materialien ein. Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogelen, ohne dass die Gele in Reaktionspuffer getaucht werden müssen. Zweitens ermöglicht die Verwendung von makroskaligen Gelen (zwischen 2 mm und 10 mm Größe) die Untersuchung der physikalischen Wechselwirkung zwischen Hydrogelen und zellfreier Genexpression. Zum Beispiel ist es mit dieser Technik möglich, zu untersuchen, wie die Hydrogelmatrix die CFPS-Reaktionen11 beeinflusst und wie CFPS-Reaktionen die Hydrogelmatrix31 beeinflussen können. Größere Abmessungen von Hydrogelen ermöglichen auch die Entwicklung neuartiger, bioprogrammierbarer Materialien32. Schließlich besteht durch die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele auch eine potenzielle Reduzierung des Bedarfs an Kunststoff-Reaktionsgefäßen. Für den Einsatz von zellfreien Sensoren hat dies klare Vorteile gegenüber Geräten, die auf Kunststoffware angewiesen sind. Zusammenfassend bietet die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele mehrere Vorteile für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors.

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Durchführung von CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogel-Matrizen zu ermöglichen. Es werden zwei verschiedene Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinproduktionsreaktionen in makroskalige Hydrogelmaterialien demonstriert (Abbildung 1). Bei Methode A werden CFPS-Komponenten in lyophilisierte Agarose-Hydrogele eingebracht, um ein aktives System zu bilden. Bei Methode B wird geschmolzene Agarose mit CFPS-Reaktionskomponenten vermischt, um ein vollständiges CFPS-Hydrogelsystem zu bilden, das dann lyophilisiert und bis zur Verwendung gelagert wird. Diese Systeme können mit einem Volumen Wasser oder Puffer und Analyt rehydriert werden, um die Reaktion zu starten.

In dieser Studie werden Escherichia coli-Zelllysat-basierte Systeme verwendet. Dies sind einige der beliebtesten experimentellen CFPS-Systeme, da die Herstellung von E. coli-Zelllysaten einfach und kostengünstig ist und hohe Proteinausbeuten erzielt . Das Zelllysat wird mit den makromolekularen Komponenten ergänzt, die für die Transkription und Translation erforderlich sind, einschließlich Ribosomen, tRNAs, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sowie Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Insbesondere demonstriert diese Arbeit die Produktion von eGFP und mCherry in Agarose-Hydrogelen unter Verwendung von E. coli-Zelllysaten und überwacht das Auftreten von Fluoreszenz mit einem Plattenleser und konfokaler Mikroskopie . Repräsentative Ergebnisse für den Mikrotiterplattenleser sind in Whitfield et al.31 zu sehen, und die zugrunde liegenden Daten sind öffentlich zugänglich33. Darüber hinaus wird die Expression fluoreszierender Proteine in den Gelen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie bestätigt. Die beiden Protokolle, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, ermöglichen den Zusammenbau und die Lagerung von CFPS-basierten genetischen Geräten in Materia mit dem Ziel, eine geeignete physikalische Umgebung für die Verteilung zellfreier Genschaltkreise in einer Weise zu schaffen, die den Feldeinsatz unterstützt.

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Protocol

1. Zelllysatpuffer und Medienvorbereitung

  1. Herstellung von 2x YT+P Agar und Medium
    1. Bereiten Sie 2x YT+P-Agar vor, indem Sie 16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22mL/L 1 M KH2PO4 und 15 g/L Agar abmessen. Für die 2x YT+P Brühe die vorherige Zusammensetzung befolgen, aber den Agar weglassen.
    2. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren der 2x YT+P.
  2. Vorbereitung des S30A-Puffers
    1. Bereiten Sie den S30A-Puffer mit 5,88 g/L Mg-Glutamat, 12,195 g/L K-Glutamat und 25 ml/L 2 M Tris vor, eingestellt auf pH 7,7 mit Essigsäure.
    2. Lagern Sie den S30A-Puffer bis zu 1 Woche bei 4 °C.
  3. Vorbereitung des S30B-Puffers
    1. Bereiten Sie den S30B-Puffer mit 5,88 g/L Mg-Glutamat und 12,195 g/L K-Glutamat vor, eingestellt auf pH 8,2 mit 2 M Tris.
    2. Lagern Sie den S30B-Puffer bis zu 1 Woche bei 4 °C.

2. Vorbereitung des Zelllysats (4-Tage-Protokoll)

  1. Tag 1
    1. Gießen Sie die 2x YT+P in Agarplatten, die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt sind.
    2. E. coli aus −80 °C Glycerin-Stamm streifen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  2. Tag 2
    1. Eine einzelne Kolonie von der 2x YT+P-Platte in 400 ml 2x YT+P-Bouillon (ergänzt mit Ampicillin) in einem 1-Liter-Kolben mit Schallblech inokuliert.
    2. 24 h bei 37 °C bei 220 U/min schütteln.
  3. Tag 3
    1. Messung und Aufzeichnung der OD600 der 24-h-Kulturen; Das Wachstum ist bei einem OD600 von 3-4 ausreichend.
      HINWEIS: Nehmen Sie ein 1 ml Aliquot Bakterienkultur und führen Sie eine serielle Verdünnung mit Medium (2x YT+P Brühe) durch, bevor Sie den OD600 nm messen. Berücksichtigen Sie den Verdünnungseffekt bei der Berechnung des OD600.
    2. Die Kultur gleichmäßig zwischen vorgekühlten 500-ml-Zentrifugenflaschen umfüllen.
    3. Bei 4.500 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
    4. Während des Zentrifugierens wird die S30A-Puffervorbereitung abgeschlossen, indem 2 ml/l 1 M DTT zum zuvor vorbereiteten S30A-Puffer hinzugefügt werden, gemischt und der Puffer auf Eis aufbewahrt wird.
    5. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 ml S30A-Puffer.
    6. Ziehen Sie die Flaschen kräftig vor, bis das gesamte Pellet vollständig aufgelöst ist, und halten Sie die Zellen so weit wie möglich auf Eis.
    7. Bei 4.500 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5 bis einschließlich 2.3.7.
    9. Geben Sie 40 ml S30A-Puffer in jede Zentrifugenflasche, resuspendieren Sie die Pellets und füllen Sie sie in vorgewogene 50-ml-Zentrifugenröhrchen um.
    10. Bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand durch Dekantieren und entfernen Sie den verbleibenden Überstand durch Pipette, wobei Sie ihn so weit wie möglich auf Eis lassen.
    11. Wiegen Sie die Zentrifugenröhrchen erneut, zeichnen Sie die neue Masse auf und berechnen Sie die Masse der Pellets.
    12. Pellets werden in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei −80 °C gelagert.
  4. Tag 4
    1. Die Pellets auf Eis auftauen.
    2. Pro 1 g Pellet Folgendes hinzufügen: 1,2 ml S30A-Puffer (DTT vor Gebrauch hinzugefügt), 275 μl Proteaseinhibitor (8 mM Stamm) und 25 μl Lysozym (10 mg/ml Stamm).
    3. Wirbeln Sie kräftig vor, bis die Pellets vollständig aufgelöst sind und keine Klumpen mehr verbleiben, und halten Sie sie so weit wie möglich auf Eis.
    4. Beschallen Sie die Zellsuspensionen in 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 120 W, 20 kHz, 30 % Amplitude und 20 s/40 s Ein-/Aus-Impulsen für 5 Minuten Beschallung.
    5. Bei 4.000 x g für 1 h bei 4 °C zentrifugieren, um die Zelltrümmer zu pelletieren.
    6. Den Überstand in frische 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
    7. Röhrchen bei 37 °C bei 220 U/min 80 min inkubieren.
    8. Bereiten Sie Dialysematerialien vor, indem Sie 1 ml/l 1 M DTT in den S30B-Puffer geben. Mischen Sie und geben Sie 900 ml in ein steriles 1-Liter-Becherglas. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu und halten Sie ihn bei 4 °C.
    9. Nach der Abflussreaktion wird der Zellextrakt aus Schritt 2.4.7 in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
    10. Verfestigen Sie den pelletfreien Überstand auf Eis in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    11. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen des produzierten Zellextrakts und hydratisieren Sie die erforderliche Anzahl von 10K MWCO-Dialysekassetten, indem Sie sie 2 Minuten lang in S30B eintauchen.
    12. Befüllen Sie die Kassetten über eine Spritze mit bis zu 3 ml Extrakt. Dialysieren Sie bis zu drei Kassetten pro 1-Liter-Becherglas unter Rühren bei 4 °C für 3 h.
    13. Nach Abschluss der Dialyse, die den Extrakt klärt, wird der Extrakt in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Bei 20.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
    14. Verfestigen Sie den geklärten Extrakt in einem frischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und wirbeln Sie kurz vor, um ihn zu mischen.
    15. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Extrakts mit einem Fluorometer.
    16. Verdünnen Sie den Extrakt auf eine Konzentration von 44,5 mg/ml mit vorgekühltemddH2O.
    17. Aliquot in 200 μl Aliquots auftragen, in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bei −80 °C lagern.

3. Herstellung lyophilisierter Hydrogele (Methode A)

  1. Wiegen Sie 0,75 g Agarose, fügen Sie ddH2Ozu einem Volumen von 100 ml hinzu und erhitzen Sie sie in 30 s Stößen bei hohen Temperaturen, um geschmolzene Agarosebrühe zu erzeugen.
  2. Mit einer Pipette 50 μl geschmolzene Agarose in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und das Gel 20-30 Minuten lang polymerisieren lassen (die Polymerisation erfolgt schneller, wenn die Gele in einen Kühlschrank umgefüllt werden).
  3. Die Mikrozentrifugenröhrchen, die die polymerisierten Gele enthalten, werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
  4. Entfernen Sie den Deckel der Zentrifugenröhrchen, decken Sie die Öffnungen der Zentrifugenröhrchen mit Wachsfolie ab und stechen Sie die Folie mehrmals mit einer Nadel oder Pipettenspitze ein.
  5. Die Mikrozentrifugenröhrchen mit den polymerisierten Gelen für 1-2 h in eine Lagerung bei −80 °C überführen.
  6. Die Zentrifugenröhrchen aus der Lagerung bei −80 °C zurückgewinnen und in einen Gefriertrockner geben, um sicherzustellen, dass die Röhrchen vollständig trocken sind.
  7. Schalten Sie den Gefriertrockner mit folgenden Einstellungen ein: Temperatur: −20 °C, Druck: 0,1 mbar.
  8. Lassen Sie das Gel über Nacht gefriertrocknen.
  9. Holen Sie die Gele aus dem Gefriertrockner und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei −80 °C.
    HINWEIS: Gele können gefriergetrocknet bis zu 1 Jahr gelagert werden.

4. Vorbereitung des 14-fachen Energielösungsvorrats

  1. Kombinieren Sie alle Reaktionskomponenten (Tabelle 1) in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis, um eine 14-fache Energielösung herzustellen.
  2. Aliquotieren Sie die 14x-Energielösung in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei −80 °C (es können Aliquots mit kleineren Volumina verwendet werden).
    HINWEIS: Die 14x-Energielösung kann mehrere Monate bei −80 °C gelagert werden, wenn ein wiederholtes Einfrieren der Röhrchen vermieden wird.

5. Vorbereitung der 4x Aminosäurebrühe

  1. Tauen Sie alle 20 Aminosäurekomponenten eines RTS-Aminosäure-Sampler-Kits auf Eis auf. Wirbeln Sie die Aminosäuren vor, um sicherzustellen, dass sie vollständig aufgelöst sind.
  2. In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen werden alle 20 Aminosäuren vermischt und 12 ml steriler ddH2O-Vortex hinzugefügt, bis die Lösung klar wird und nur einen leichten Hauch von weißer Färbung aufweist.
  3. Aliquotieren Sie die 4x Aminosäuren in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (500 μL Aliquots).
  4. Die Aliquots der 4-fachen Aminosäurelösung in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei −80 °C lagern.

6. Zellfreie Pufferkalibrierung

HINWEIS: Der CFPS-Puffer, der für die Hydrogelreaktionen verwendet wurde, wurde für optimale DTT-, Mg-Glutamat- und K-Glutamat-Konzentrationen gemäß dem Protokoll von Banks et al.34 kalibriert, das von Sun et al.35 modifiziert wurde. Die Zusammensetzungen der Kalibrierreaktionen wurden mit der Methode der Versuchsplanung (DOE) ausgewählt, wobei sieben Faktorstufen für K-Glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-Glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) und DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) JMP Pro 15 wurde verwendet, um ein benutzerdefiniertes DOE-Design zu generieren (Tabelle 2) und die Analyse durchzuführen, um die optimalen Faktorkonzentrationen zu bestimmen.

  1. Gewinnen Sie den zellfreien Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C und tauen Sie ihn auf Eis auf.
  2. Tauen Sie die 4x Aminosäuren, 14x Energielösung, 40% PEG-8000, Plasmid-DNA, 3 M K-Glutamat, 100 mM Mg-Glutamat und 100 mM DTT-Vorräte auf Eis auf.
  3. Erstellen Sie einen Kalibrierungs-Mastermix, indem Sie 12,5 μl der 4-fachen Aminosäuren, 3,57 μl der 14-fachen Energielösung, 2,5 μl 40 % PEG-8000, 3 μg Plasmid-DNA und 10 μl zellfreien Extrakt (44,5 mg/ml) kombinieren und bis zu 35 μl pro Reaktion mit ddH2O herstellen.
  4. Verteilen Sie die 35 μl Mastermix in die Vertiefungen einer schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte.
  5. Fügen Sie gemäß dem DOE-Design das entsprechende Volumen an Mg-Glutamat, K-Glutamat und DTT zu jeder Reaktion hinzu, zusammen mitddH2O, um jede Reaktion auf bis zu 50 μl zu erhöhen.
  6. Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den beschriebenen Plattenleseeinstellungen (für mCherry): Anregung: 587 nm, Emission: 610 nm, Wellenlängenbandbreite: 12 nm, Optik: oben, Temperatur: 37 °C, wobei die Fluoreszenzmesswerte alle 5 Minuten für 4 h Gesamtlesezeit erfasst werden. Inkubieren Sie die Platten durch Schütteln auf einer gepulsten Einstellung bei 60 U/min.
  7. Laden Sie die Ergebnisse in das JMP-DOE-Design hoch und generieren Sie ein Vorhersageprofil, um die optimalen Konzentrationsniveaus für K-Glutamat, Mg-Glutamat und DTT basierend auf den gewünschten Antwortvariablen zu bestimmen. In diesem Fall waren die maximale Fluoreszenz und die Reaktionsgeschwindigkeit die Antwortvariablen.
  8. Kombinieren Sie die Reagenzien wie in Tabelle 3 gezeigt, um den 2X CFPS-Puffer zu erstellen
  9. Aliquotieren und bei −80 °C lagern

7. CFPS in rehydrierten lyophilisierten Hydrogelen (Methode A)

ANMERKUNG: Die in den CFPS-Reaktionen verwendeten Plasmide wurden unter Verwendung von Komponenten aus dem modularen EcoFlex-Toolkit für E. coli36 hergestellt und in Whitfield et al. beschrieben.11 Die mCherry und eGFP standen unter der Kontrolle des konstitutiven JM23100 Promotors. Diese Komponenten sind bei Addgene erhältlich.

  1. Den zellfreien Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C zurückgewinnen und ca. 20 Minuten auf Eis auftauen lassen.
  2. Sammeln Sie den 2-fachen CFPS-Puffer und die Plasmid-DNA und tauen Sie sie auf Eis auf.
  3. Sammeln Sie die gefriergetrockneten Hydrogele und lassen Sie sie 15 Minuten lang Raumtemperatur erreichen, indem Sie die Gele auf der Bank stehen lassen.
  4. Übertragen Sie die Gele in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und schneiden Sie die Gele bei Bedarf mit einem Skalpell zu, damit sie in die Vertiefungen passen.
  5. In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 10 μl zellfreien Extrakt mit 25 μl 2x CFPS-Puffer und 4 μg Plasmid-DNA mischen; bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl mitddH2Oherstellen, um die CFPS-Lösung herzustellen.
  6. Pipettieren Sie die CFPS-Lösung auf die gefriergetrockneten Hydrogele.
  7. Lassen Sie die Gele 5-10 Minuten bei Raumtemperatur im CFPS-System einweichen.
  8. Übertragen Sie die Gele mit einem Spatel auf eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte.
  9. Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den in Schritt 6.6 beschriebenen Einstellungen des Plattenlesers. Repräsentative Ergebnisse liegen in früheren Studienvor 31,33.

8. Zellfreie Proteinsynthese in einsetzbaren Hydrogelen (Methode B)

  1. Zellfreier Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C gewinnen und ca. 20 Minuten auf Eis auftauen.
  2. Sammle die Plasmid-DNA und taue sie auf Eis auf.
  3. In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis werden 10 μl zellfreier Extrakt mit 3 μg Plasmid-DNA und 25 μl 2x CFPS-Puffer kombiniert, was ein Gesamtvolumen von 37,5 μl ergibt.
  4. 3 g Agarose abmessen und zu 100 ml ddH2O-Puffer hinzufügen, um3%ige Agarose zu erhalten.
  5. Die 3%ige Agarose wird in 30 s Stößen bei hoher Leistung in der Mikrowelle erhitzt.
  6. Pipettieren Sie 12,5 μl geschmolzene Agarose in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die eine CFPS-Mischung enthalten, bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl.
  7. Lassen Sie die geschmolzene Agarose abkühlen, aber nicht polymerisieren, und lassen Sie die Agarose in einem auf 50 °C eingestellten Heizblock.
  8. Kombinieren Sie die geschmolzene Agarose mit der CFPS-Lösung; Durch Pipettieren und Rühren mit der Spitze mischen und darauf achten, dass Sie sich schnell bewegen, um eine Gelpolymerisation zu vermeiden, bevor die CFPS-Lösung eingemischt werden kann.
  9. Lassen Sie die Gele bei Raumtemperatur abkühlen und polymerisieren Sie ca. 2 min.
  10. Die polymerisierte Agarose mit einem Spatel in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren.
  11. Die schockgefrorenen Hydrogele für 1 h bei −80 °C lagern.
  12. Holen Sie die Gele aus der Lagerung zurück; Entfernen Sie die Deckel der Mikrozentrifugenröhrchen, bedecken Sie die Röhrchen mit Wachsfolie und stechen Sie die Folie durch, damit die Feuchtigkeit abtrocknen kann.
  13. Schalten Sie den Gefriertrockner mit folgenden Einstellungen ein: Temperatur: −20 °C, Druck: 0,1 mbar, Gefriertrocknung für 18 h (über Nacht).
  14. Lagern Sie die gefriergetrockneten CFPS-Geräte bis zur Verwendung bei −80 °C.
  15. Die gefriergetrockneten CFPS-Geräte mit einem ungefähren Feuchtvolumen von 50 μL können mit 50 μLddH2Oohne überschüssige Flüssigkeit rehydriert werden. Die Rehydrierung dauert ca. 30 Minuten.
  16. Übertragen Sie die Gele mit einem Spatel auf eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte.
  17. Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den in Schritt 6.6 beschriebenen Einstellungen des Plattenlesers. Repräsentative Ergebnisse sind in früheren Publikationenverfügbar 31,33.

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Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen, wobei Abbildung 1 eine schematische Übersicht der beiden Ansätze zeigt. Beide Methoden eignen sich für die Gefriertrocknung und Langzeitlagerung. Methode A ist aus zwei Gründen die am häufigsten verwendete Methodik. Erstens hat sich gezeigt, dass es das am besten anwendbare Verfahren für die Arbeit mit einer Reihe von Hydrogelmaterialien11 ist. Zweitens ermöglicht Methode A das parallele Testen genetischer Konstrukte. Methode B eignet sich besser für die Herstellung eines optimierten Systems und den Einsatz vor Ort. Beide Protokolle ermöglichen es, viele Proben auf einmal vorzubereiten, um die experimentelle Reproduzierbarkeit zu unterstützen. Diese Eigenschaft ist auch für die langfristige Entwicklung der Technologie nützlich, da gefriergetrocknete Geräte in trockenem Zustand versendet und bei Bedarf vor Ort rekonstituiert werden können.

Der im Protokoll und in Abbildung 1 beschriebene Ansatz kann für die Expression einzelner Genkonstrukte oder für die Co-Expression mehrerer Gene verwendet werden. Die in Abbildung 2 dargestellten Daten zeigen die Expression von eGFP und mCherry in einem 0,75%igen Agarose-Gel. Konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Proteinexpression im gesamten Hydrogel, einschließlich der inneren Ebenen, homogen war. Insbesondere war die Proteinsynthese nicht auf die äußeren Ränder des Hydrogels beschränkt, und die interne Fluoreszenz war nicht das Ergebnis der Proteindiffusion. Um dies zu bestätigen, war es möglich, die Proteindiffusion von einem Hydrogel zum anderen zu beobachten, indem ein eGFP-exprimierendes Hydrogel in physischen Kontakt mit einem mCherry-exprimierenden Hydrogel gebracht wurde. Die Diffusionsrate zwischen den beiden war nicht ausreichend, um die ausgedehnte Lokalisierung von roter oder grüner Fluoreszenz im Inneren des Materials zu erklären. Dieses Experiment veranschaulicht auch einen entscheidenden Vorteil des Einsatzes zellfreier Bauelemente in Hydrogelen - die Bauelementfunktionalität kann räumlich in einer Weise organisiert werden, die bei flüssigzellfreien Reaktionen nicht möglich ist. Darüber hinaus ist für die Bildung von Gennetzwerken die gleichzeitige Synthese von mehr als einem Genprodukt erforderlich. Die in Abbildung 2 (untere Reihe) gezeigten Ergebnisse bestätigten die Co-Expression von mCherry und eGFP in Agarose. In dieser Arbeit wurden beide Proteine exprimiert, und es gab keine räumliche Konkurrenz zwischen den Proteinen. Auch hier zeigt eine Überlagerung des roten und grünen Wellenlängenbereichs die gleichmäßige räumliche Verteilung beider Proteine innerhalb des Hydrogels.

Tabelle 1: Die 14x Energielösungsaktien. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Design eines experimentellen Arrays zur Optimierung von DTT, Mg-Glutamat und K-Glutamat innerhalb der zellfreien Proteinsynthesereaktionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Die 2x CFPS-Pufferkomponenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der beiden Protokolle. Bei der ersten Methode (Methode A, die in dieser Arbeit demonstriert wird) werden Hydrogelmaterialien zuerst hergestellt und dann ohne zellfreie Komponenten gefriergetrocknet (Schritt 1). Diese getrockneten Hydrogele können gelagert und bei Bedarf rekonstituiert werden (Schritt 2) mit dem richtigen Volumen der zellfreien Reaktion vor der Inkubation für die Proteinproduktion (Schritt 3). Die Variante des Verfahrens, Methode B, umfasst alle oder einige der zellfreien Reaktionskomponenten in der anfänglichen Hydrogelherstellung. Nach der Gefriertrocknung (Schritt 1) können die Hydrogele dann in Wasser allein oder in einem Puffer, der einen interessierenden Analyten enthält, rekonstituiert werden (Schritt 2). Die Proteinproduktion (Schritt 3) läuft wie bisher weiter. Ein drittes Verfahren, bei dem gefriergetrocknete zellfreie Komponenten mit Hydrogelpolymeren rekonstituiert werden, ist in Whitfield et al.11 beschrieben, hat aber bisher nur mit einer begrenzten Anzahl von Hydrogelen Anwendung gefunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Zellfreie Proteinsynthese von eGFP und mCherry in einem Hydrogel unter Verwendung von E. coli-Zelllysaten. Agarose-Gele (0,75 %) wurden ohne DNA-Template (oben) mit 4 μg eGFP- oder mCherry-Template (Mitte) oder mit 4 μg eGFP- und mCherry-Template (unten) hergestellt. Die Hydrogele wurden vor der konfokalen Mikroskopie in den roten und grünen Kanälen für 4 h inkubiert. Eine Überlagerung der beiden Kanäle wird ebenfalls angezeigt, und die Überlagerung enthält das DIC-Bild (Differential Interference Contrast). Hydrogele, die entweder eGFP- oder mCherry-Template enthielten, wurden separat hergestellt, aber in physischem Kontakt miteinander inkubiert. Der Durchmesser des Gels beträgt 6 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Im Folgenden werden zwei Protokolle für den Einbau von CFPS-Reaktionen auf Basis von E. coli-Zelllysaten in Agarose-Hydrogele beschrieben . Diese Methoden ermöglichen eine gleichzeitige Genexpression im gesamten Material. Das Protokoll kann für andere CFPS-Systeme angepasst werden und wurde zusätzlich zu den hier beschriebenen im Labor hergestellten Zelllysaten erfolgreich mit kommerziell erhältlichen CFPS-Kits durchgeführt. Wichtig ist, dass das Protokoll die Genexpression in Abwesenheit einer externen flüssigen Phase ermöglicht. Das bedeutet, dass das System in sich geschlossen ist und kein zellfreies Reaktionsbad benötigt. Im Gegensatz zu früheren Methoden, bei denen CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogelen auftraten, entfällt bei dieser Methode der Bedarf an externen Puffern und Reaktionsgefäßen. Es wird erwartet, dass diese Methoden es den Forschern ermöglichen werden, die Verwendung von Hydrogelmaterialien als Chassis für zellfreie Geräte der synthetischen Biologie zu untersuchen und letztendlich einen Weg zu finden, um solche Geräte aus dem Labor zu bringen.

Entscheidend für den Erfolg beider Ansätze ist der Einsatz hochwertiger Zelllysate. Ein hochwertiges Zelllysat sollte eine hohe Proteinkonzentration (>40 mg/ml) aufweisen, für die Dauer der Zubereitung kalt gelagert werden und keine wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen durchlaufen haben. Darüber hinaus ist es entscheidend, dass die DNA-Vorlagen von hoher Reinheit sind. Um dies zu erreichen, sollten Plasmide mit einem hochreinen Plasmidpräparationskit mit hoher Ausbeute aus Zellen extrahiert werden, damit Transkriptionsreaktionen in der CFPS-Umgebung ablaufen können. Diese kritischen Phasen gelten für alle CFPS-Anwendungen und sind nicht nur für diese Methode geeignet. Nichtsdestotrotz ist es die Vorbereitung der CFPS-Komponenten, die den größten Einfluss auf die Wirksamkeit der Protokolle hat. Bei den Materialien muss eine effektive, schnelle Gefriertrocknung der Hydrogele erreicht werden. Wenn der Gefriertrockner keine ausreichend kalte Temperatur (unter −45 °C) erreicht, wird das Gel getrocknet und nicht gefriergetrocknet, was die innere Struktur der Hydrogelmatrix beeinträchtigen und zu einer Degradation der eingebetteten CFPS-Systeme führen kann. Methode B hat auch ein einzigartiges Problem; Insbesondere muss bei der Zugabe des CFPS-Gemischs zu der geschmolzenen Agarose, um das Gel zu bilden, die geschmolzene Agarose ausreichend abkühlen lassen, bevor das CFPS-Gemisch zugegeben wird, um einen thermischen Abbau der CFPS-Reaktionen zu verhindern. Wenn Sie die Agarose jedoch zu stark abkühlen lassen, führt dies zur Polymerisation des Gels und verhindert die Zugabe des CFPS-Systems. Schließlich besitzen Hydrogele einen gewissen Grad an Autofluoreszenz, der mit den Fluoreszenzsignalen, die während der CFPS-Reaktionen erzeugt werden, in Konflikt geraten kann. Es ist daher wichtig, geeignete Negativkontrollen und genetische Reporter einzubeziehen, die nicht die gleichen Fluoreszenzeigenschaften wie das Material aufweisen.

Die hier gezeigten Protokolle konzentrieren sich auf die Verwendung von Agarose als Modellhydrogel. Agarose ist ein hervorragendes Modellsystem für diese Arbeit, da es weit verbreitet und kostengünstig ist und hervorragende Proteinproduktionsfähigkeiten aufweist. Frühere Untersuchungen haben auch gezeigt, dass Agarose ein Ersatz für das Crowding-Agens PEG in CFPS-Reaktionen sein kann, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkungen zwischen dem Polymerchassis und den CFPS-Reaktionen die Proteinproduktion verbessern können11. Diese Methoden sind jedoch auch für Modifikationen mit einer Vielzahl alternativer Hydrogel-Matrizen mit unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften zugänglich. Die Methode wurde auf Xanthangummi, Alginat, Acylgellangummi, Polyacrylamid, Hyaluronsäure-Hydrogele und die Poloxamer-Gele F-108 und F-1279 angewendet. In einigen Szenarien wird eine reduzierte Proteinproduktion im Vergleich zu flüssigen Kontrollen oder anderen Hydrogelen beobachtet. Nichtsdestotrotz kann in diesen Szenarien ein Kompromiss eingegangen werden, bei dem die Funktionalität des Materials selbst (z. B. seine Hafteigenschaften oder Biokompatibilität) von erheblichem Nutzen ist, so dass eine Verringerung der Proteinproduktion akzeptiert werden kann. Es können auch Modifikationen an den Konzentrationen der Hydrogele vorgenommen werden. Für Agarose sind die Verfahren beispielsweise für Polymerkonzentrationen im Bereich von 0,5 % bis 1,5 % w/v geeignet. Eine höhere Gelkonzentration führt in der Regel in materieller Hinsicht zu einem robusteren Gerät, das widerstandsfähiger gegen die Handhabung ist und die CFPS-Reaktion im Inneren besser konserviert. Der Nachteil bei erhöhter Gelkonzentration besteht jedoch darin, dass die Reaktion eine reduzierte Produktionsrate oder Proteinausbeute haben kann11,37. Der Zusammenhang zwischen der Polymerkonzentration und der Proteinproduktion ist jedoch nicht linear und variiert je nach verwendetem Hydrogel11. Daher ist für jedes neue Hydrogel-Polymer ein gewisses Maß an Experimenten erforderlich, um die Funktionalität des Materials gegen die Funktionalität der Zellen abzuwägen.

Die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Materialien ohne externe Puffer stellt einen interessanten Weg für den Einsatz zellfreier Bauelemente dar. Zellfreie Geräte haben den Vorteil, dass sie die Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen außerhalb einer kontrollierten Laborumgebung überflüssig machen. Darüber hinaus entfällt durch die Einbettung von Reaktionen in Hydrogele die Notwendigkeit von Reaktionsgefäßen (in der Regel Kunststoffwaren) nach der Rekonstitution. Angesichts der Tatsache, dass viele Hydrogele biologisch abbaubar sind, bietet dies einen potenziellen Weg zur Reduzierung von Kunststoffabfällen. Ebenso zeigt das hier beschriebene Protokoll, dass sowohl Hydrogel als auch CFPS für die Gefriertrocknung geeignet sind. Wiederholte Gefriertrocknungszyklen werden zwar nicht empfohlen und beeinträchtigen wahrscheinlich die CFPS- und Hydrogelfunktion bei Einwegprodukten. Die Möglichkeit, die Komponenten gefriertrocknen und rekonstituieren, reduziert das Gewicht des Geräts und macht eine Kühlkette während des Transports überflüssig. Diese Eigenschaften vereinfachen letztendlich die Logistik und reduzieren die Transportkosten für die Geräte. Darüber hinaus haben Hydrogele viele nützliche funktionelle Eigenschaften; Sie können beispielsweise als Pasten, Schmiermittel und Klebstoffe fungieren. Hydrogele können auch biokompatibel und biologisch abbaubar sein und eigenständige Reizreaktionen besitzen. Zusammengenommen kann eine Synergie zwischen biologischer Funktionalität und Materialwissenschaft erreicht werden, um eine neue Klasse von bioprogrammierbaren Materialien zu schaffen.

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Disclosures

Nichts.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich sehr für die Unterstützung durch die Auszeichnungen des Biotechnology and Biological Sciences Research Council BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) und BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) sowie des Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories Award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Die Daten zu dieser Veröffentlichung sind unter folgender Adresse verfügbar: 10.25405/data.ncl.22232452. Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

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Biologie Ausgabe 196 Zellfreie Proteinsynthese CFPS Synthetische Biologie Synthetische Gennetzwerke Hydrogele Biosensoren Genexpression Proteinexpression
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Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

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