Summary
ここでは、外液相を必要とせずに、無細胞タンパク質合成反応をマクロスケールのヒドロゲルマトリックスに組み込むための2つのプロトコルを紹介します。
Abstract
合成遺伝子ネットワークは、科学者やエンジニアが遺伝子レベルでエンコードされた機能を備えた新しいシステムを設計および構築するためのプラットフォームを提供します。遺伝子ネットワークの展開のための支配的なパラダイムは細胞シャーシ内にありますが、合成遺伝子ネットワークは無細胞環境でも展開できます。無細胞遺伝子ネットワークの有望な用途には、バイオセンサーが含まれ、これらのデバイスは生物(エボラ、ジカ、およびSARS-CoV-2ウイルス)および非生物的(重金属、硫化物、農薬、およびその他の有機汚染物質)の標的に対して実証されています。無細胞システムは通常、反応容器内に液体の形で展開されます。しかし、このような反応を物理マトリックスに埋め込むことができれば、より広い環境でのより広範な適用が容易になる可能性があります。この目的のために、無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を様々なヒドロゲルマトリックスに組み込む方法が開発されている。この作業に役立つヒドロゲルの重要な特性の1つは、ヒドロゲル材料の高い水再構成能力です。さらに、ヒドロゲルは、機能的に有益な物理的および化学的特性を有する。ヒドロゲルは、貯蔵のために凍結乾燥し、後で使用するために再水和することができる。ヒドロゲルにCFPS反応を含めることとアッセイするための2つの段階的なプロトコルが提示されます。まず、CFPSシステムは、細胞ライセートによる再水和 を介して ヒドロゲルに組み込むことができます。次いで、ヒドロゲル内の系を構成的に誘導または発現させて、ヒドロゲルを介した完全なタンパク質発現を得ることができる。第2に、細胞ライセートを重合時点でヒドロゲルに導入することができ、システム全体を凍結乾燥し、ヒドロゲル内にコードされた発現系の誘導物質を含む水溶液で後で再水和することができる。これらの方法は、ヒドロゲル材料に感覚能力を付与する無細胞遺伝子ネットワークを可能にする可能性があり、実験室を超えて展開する可能性があります。
Introduction
合成生物学は、多様な工学分野を統合して、自然界には見られない機能を実行できる生物学的ベースの部品、デバイス、およびシステムを設計およびエンジニアリングします。ほとんどの合成生物学のアプローチは、依然として生細胞に結びついています。対照的に、無細胞合成生物学システムは、前例のないレベルの制御と設計の自由度を促進し、従来の細胞ベースの遺伝子発現法の制約の多くを排除しながら、生物学的システムのエンジニアリングの柔軟性を高め、時間を短縮します1,2,3。CFPSは、人工細胞の構築、遺伝子回路のプロトタイピング、バイオセンサーの開発、代謝物の生成など、多くの分野でますます多くのアプリケーションで使用されています4,5,6。CFPSは、凝集しやすいタンパク質、膜貫通タンパク質、毒性タンパク質など、生細胞では容易に発現できない組換えタンパク質の産生にも特に有用です6,7,8。
CFPSは通常、液体反応で行われます。ただし、液体セルフリーデバイスを反応容器内に封じ込める必要があるため、状況によっては展開が制限される可能性があります。ここで紹介したメソッドの開発の理論的根拠は、無細胞合成生物学デバイスをヒドロゲルに組み込むための堅牢なプロトコルを提供することであり、タンパク質生産プラットフォーム自体としてではなく、代わりに、実験室を超えてセルフリーデバイスを展開するための物理的なシャーシとしてヒドロゲルを使用できるようにすることでした。CFPSシャーシとしてヒドロゲルを使用することには、いくつかの利点があります。ヒドロゲルは、高い含水量(時には98%を超える)にもかかわらず、固体特性9,10,11を有する高分子材料である。それらはペースト、潤滑剤、接着剤として用途があり、コンタクトレンズ、創傷被覆材、船舶用粘着テープ、土壌改良剤、ベビーおむつなど、さまざまな製品に含まれています9,11,12,13,14。ヒドロゲルはまた、薬物送達ビヒクルとして活発に研究されている9、15、16、17。ヒドロゲルはまた、生体適合性、生分解性であり得、そしてそれら自身のいくつかの刺激応答を有する9、18、19、20。したがって、ここでの目標は、分子生物学由来の機能と材料科学の相乗効果を生み出すことです。この目的のために、無細胞合成生物学をコラーゲン、ラポナイト、ポリアクリルアミド、フィブリン、PEGペプチド、アガロース11,21,22などのさまざまな材料と統合し、ガラス、紙、布の表面をコーティングする努力がなされてきました11,23,24CFPS デバイスで使用します。ここで紹介するプロトコルは、アガロースを例示的な材料として使用して、CFPS反応をマクロスケール(すなわち>1 mm)のヒドロゲルマトリックスに埋め込むための2つの方法を示しています。アガロースは、その高い吸水能力、制御された自己ゲル化特性、および調整可能な機械的特性のために選択されました11、24、25、26。また、アガロースは機能性CFPSをサポートし、他の多くのヒドロゲル代替品よりも安価で、生分解性であるため、実験モデルシステムとして魅力的な選択肢となっています。しかしながら、これらの方法は、代替ヒドロゲル11の範囲にCFPSを埋め込むのに適切であると以前に実証されている。ヒドロゲルの幅広い用途とCFPSの機能性を考慮すると、ここで実証された方法は、研究者が自分の目的に適した生物学的に強化されたヒドロゲル材料を開発するための基礎を提供することができます。
以前の研究では、1μmから400μmのサイズ範囲のミクロゲル系を使用して、反応バッファー23、27、28、29、30、31に沈めたヒドロゲルでCFPSを実行しました。しかし、CFPS反応バッファー内にヒドロゲルを沈める必要があるため、それ自体が材料として展開する機会が制限されます。ここに示すプロトコルにより、ゲルを反応バッファーに沈めることなく、ヒドロゲル内でCFPS反応を行うことができます。第二に、マクロスケールゲル(サイズが2 mmから10 mm)を使用すると、ヒドロゲルと無細胞遺伝子発現との間の物理的相互作用の研究が可能になります。例えば、この技術により、ヒドロゲルマトリックスがCFPS反応11にどのように影響し、CFPS反応がヒドロゲルマトリックス31にどのように影響し得るかを研究することができる。より大きなサイズのヒドロゲルはまた、新規のバイオプログラム可能な材料の開発を可能にする32。最後に、CFPS反応をヒドロゲルに組み込むことにより、プラスチック反応容器の要件も削減できる可能性があります。セルフリーセンサーの展開では、プラスチック製品に依存するデバイスに比べて明らかな利点があります。まとめると、CFPS反応をヒドロゲルに組み込むことは、実験室を超えてセルフリーデバイスを展開するためのいくつかの利点を提供します。
ここで紹介する方法の全体的な目標は、ヒドロゲルマトリックス内でCFPS反応を操作できるようにすることです。無細胞タンパク質生産反応をマクロスケールのヒドロゲル材料に組み込むための2つの異なる方法が実証されています(図1)。 方法Aでは、CFPS成分を凍結乾燥アガロースヒドロゲルに導入して活性系を形成します。 方法Bでは、溶融アガロースをCFPS反応成分と混合して完全なCFPSヒドロゲルシステムを形成し、凍結乾燥して必要になるまで保管します。これらのシステムは、反応を開始するために、大量の水またはバッファーと分析物で再水和することができます。
この研究では、 大腸菌 細胞ライセートベースのシステムを使用しています。 これらは、大腸菌 細胞ライセートの調製が簡単で安価であり、高いタンパク質収率を達成するため、最も人気のある実験用CFPSシステムの一部です。細胞ライセートは、リボソーム、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、開始因子、伸長因子、終結因子など、転写および翻訳の実行に必要な高分子成分で補完されます。具体的には、この論文では、 大腸菌 細胞ライセートを使用したアガロースヒドロゲルでのeGFPおよびmCherryの生産を実証し、プレートリーダーと共焦点顕微鏡を使用して蛍光の出現を監視します。マイクロタイタープレートリーダーの代表的な結果はWhitfieldら31に見られ、基礎となるデータは公開されている33。さらに、ゲル全体にわたる蛍光タンパク質の発現は、共焦点顕微鏡を用いて確認される。この論文で実証された2つのプロトコルは、フィールド展開をサポートする方法で無細胞遺伝子回路の分布に適した物理的環境を作り出すことを最終目標として、 マテリアでの CFPSベースの遺伝子デバイスの組み立てと保存を可能にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 細胞ライセートバッファーおよび培地調製
- 2x YT+P寒天培地の調製
- 16 g/L トリプトン、10 g/L 酵母エキス、5 g/L NaCl、40 mL/L 1 M K 2 HPO 4、22 mL/L 1 M KH2PO4、および 15 g/L 寒天を測定して、2x YT+P寒天を調製します。2x YT + Pブロスの場合は、前の組成に従いますが、寒天は省略します。
- 2x YT+Pをオートクレーブして滅菌します。
- S30Aバッファーの準備
- 酢酸でpH 7.7に調整した 5.88 g/L Mg-グルタミン酸、12.195 g/L K-グルタミン酸、および 25 mL/L 2 M トリスを含む S30A バッファーを調製します。
- S30Aバッファーを4°Cで最大1週間保管します。
- S30Bバッファーの準備
- 5.88 g/L Mg-グルタミン酸および12.195 g/L K-グルタミン酸を含むS30Bバッファーを調製し、pH 8.2 に調整し、2 M トリスで調製します。
- S30Bバッファーを4°Cで最大1週間保管します。
2.細胞ライセートの調製(4日間のプロトコル)
- 1日目
- 2x YT+Pを100 μg/mLのアンピシリンを添加した寒天プレートに注ぎます。
- ストリーク 大腸菌 を-80°Cグリセロールストックから、37°Cで一晩インキュベートした。
- 2日目
- 2 x YT + Pプレートから1 Lのバッフルフラスコ内の400 mLの2 x YT + Pブロス(アンピシリンを補給)に単一のコロニーを接種します。
- 220 rpmの振とうしながら37°Cで24時間インキュベートします。
- 3日目
- 24時間培養物のOD600 を測定して記録します。成長は3-4のOD600 で十分です。
注:1 mLの細菌培養アリコートを採取し、OD600 nmを測定する前に培地(2x YT+Pブロス)で段階希釈を行います。OD600を計算するときは、希釈効果を考慮してください。 - 予め冷却した500 mL遠心分離ボトル間で培養液を均等に移します。
- 4,500 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 遠心分離中に、以前に調製したS30Aバッファーに2 mL/Lの1 M DTTを添加し、混合し、バッファーを氷上で維持することにより、S30Aバッファー調製を完了します。
- 細胞ペレットを200 mLのS30Aバッファーに再懸濁します。
- ペレット全体が完全に可溶化されるまでボトルを激しくボルテックスし、細胞を可能な限り氷上に保ちます。
- 4,500 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 手順 2.3.5-2.3.7 (両端を含む) を繰り返します。
- 各遠心分離機ボトルに40 mLのS30Aバッファーを加え、ペレットを再懸濁して、事前に計量した50 mLの遠沈管に移します。
- 4,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 デカンテーションにより上清を廃棄し、ピペットで残留上清を除去し、できるだけ氷上に保持する。
- 遠沈管の重量を再計量し、新しい質量を記録し、ペレットの質量を計算します。
- ペレットを液体窒素中で瞬間凍結し、-80°Cで保存します。
- 24時間培養物のOD600 を測定して記録します。成長は3-4のOD600 で十分です。
- 4日目
- ペレットを氷上で解凍します。
- ペレット1 gあたり、1.2 mLのS30Aバッファー(使用前にDTTを追加)、275 μLのプロテアーゼ阻害剤(8 mMストック)、および25 μLのリゾチーム(10 mg/mLストック)を加えます。
- ペレットが完全に可溶化され、塊がなくなるまで激しく渦を流し、可能な限り氷上に保ちます。
- 50 mL遠沈管では、超音波処理の5分間のために120 W、20 kHz、30%振幅、および20 s/40秒オン/オフパルスで細胞懸濁液を超音波処理します。
- 4,000 x g で4°Cで1時間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。
- 上清を新鮮な50 mL遠沈管に移します。
- チューブを37°C、220 rpmで80分間インキュベートします。
- 1 mL/L の 1 M DTT を S30B バッファーに添加して透析材料を調製します。900 mLを混合し、1 Lの滅菌ビーカーに加えます。マグネチックスターラーを追加し、4°Cに保ちます。
- 流出反応に続いて、ステップ2.4.7の細胞抽出物を2 mLマイクロ遠心チューブに移し、20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- ペレットフリーの上清を氷上で50 mLの遠沈管に固めます。
- 生成された細胞抽出液の総量を決定し、必要な数の10K MWCO透析カセットをS30Bに2分間浸して水和します。
- 最大3 mLの抽出物を含むシリンジ を介して カセットをロードします。1 Lビーカーあたり最大3つのカセットを透析し、4°Cで3時間攪拌します。
- 透析が完了して抽出物が清澄化されたら、抽出物を2 mLのマイクロ遠心チューブに移します。20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 清澄化した抽出物を氷の上で新鮮な遠沈管に固め、短時間ボルテックスして混合します。
- 蛍光光度計を使用して抽出物のタンパク質濃度を測定します。
- 予め冷却したddH2Oを用いて抽出物を44.5 mg/mLの濃度に希釈する。
- 200 μLのアリコートに分注し、液体窒素中で瞬間凍結し、-80°Cで保存します。
3.凍結乾燥ヒドロゲルの調製(方法A)
- アガロース0.75 gの重量を量り、ddH2Oを100 mLの容量に加え、高温で30秒間のバーストで電子レンジで加熱し、溶融アガロースストックを作成します。
- ピペットを使用して、50 μLの溶融アガロースを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、ゲルを20〜30分間重合させます(ゲルを冷蔵庫に移すと重合が速くなります)。
- 重合ゲルを含む微量遠心チューブを液体窒素で瞬間凍結します。
- 遠沈管の蓋を外し、遠沈管の開口部をワックスフィルムで覆い、針またはピペットチップでフィルムを数回突き刺します。
- 重合ゲルを含む微量遠心チューブを-80°Cで1〜2時間保管します。
- -80°Cの貯蔵庫から遠沈管を回収し、凍結乾燥機に入れて、管が完全に乾いていることを確認します。
- 次の設定で凍結乾燥機を作動させます:温度:-20°C、圧力:0.1ミリバール。
- ゲルを一晩凍結乾燥させます。
- 凍結乾燥機からゲルを回収し、必要になるまで-80°Cの貯蔵庫に入れます。
注:ゲルは凍結乾燥で最大1年間保存できます。
4. 14倍エネルギー溶液原料の調製
- 氷上で15 mLの遠沈管ですべての反応成分(表1)を混ぜ合わせて、14倍のエネルギー溶液を生成します。
- 14倍のエネルギー溶液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、-80°Cで保存します(少量のアリコートを使用できます)。
注:14xエネルギー溶液は、チューブの凍結融解の繰り返しを回避すれば、-80°Cで数ヶ月間保存できます。
5. 4xアミノ酸ストックの調製
- RTSアミノ酸サンプラーキットの20アミノ酸成分すべてを氷上で解凍します。アミノ酸を完全に溶解させるために渦巻します。
- 50 mLの遠沈管で、20個のアミノ酸をすべて混ぜ合わせ、12 mLの滅菌ddH2Oを加えます。 溶液が透明になるまでボルテックスし、わずかに白い着色のもやがある。
- 4xアミノ酸を1.5 mLマイクロ遠心チューブ(500 μLアリコート)に分注します。
- 4xアミノ酸溶液アリコートを液体窒素中で瞬間凍結し、アリコートを-80°C保存に移します。
6. 無細胞バッファーキャリブレーション
注:ヒドロゲル反応に使用したCFPSバッファーは、Sunら35から修正されたBanksら34のプロトコルに従って、最適なDTT、Mg-グルタミン酸、およびK-グルタミン酸濃度になるように較正されました。キャリブレーション反応組成は実験計画法(DOE)法を用いて選択し、K-グルタミン酸(200 mM、400 mM、600 mM、1,000 mM、1,200 mM、1,400 mM)、Mg-グルタミン酸(0 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM)、およびDTT(0 mM、5、10 mM、15 mM、 20 mM、25 mM、30 mM)ストック。JMP Pro 15を使用して、カスタムDOE計画(表2)を作成し、分析を実施して最適な因子濃度を決定しました。
- -80°C保存から無細胞抽出液を回収し、氷上で解凍します。
- 4 x アミノ酸、14 x エネルギー溶液、40% PEG-8000、プラスミド DNA、3 M K-グルタミン酸、100 mM Mg-グルタミン酸、および 100 mM DTT ストックを氷上で解凍します。
- 12.5 μLの4xアミノ酸、3.57 μLの14xエネルギー溶液、2.5 μLの40%PEG-8000、3 μgのプラスミドDNA、および10 μLの無細胞抽出物(44.5 mg/mL)を組み合わせてキャリブレーションマスターミックスを作成し、ddH2Oとの反応ごとに最大35 μLを作ります。
- 35 μLのマスターミックスを黒色の384ウェルマイクロタイタープレートのウェルに分配します。
- DOE設計に従って、適切な量のMg-グルタミン酸、K-グルタミン酸、およびDTTをddH2Oとともに各反応に添加して、各反応を最大50 μLにします。
- マイクロタイタープレートをプレートリーダーに移し、説明されているプレートリーダー設定(mCherryの場合):励起:587 nm、発光:610 nm、波長帯域幅:12 nm、光学:トップ、温度:37 °C、蛍光測定値は5分ごとに4時間の合計読み取り時間で収集されます。60 rpmでパルス設定で振とうしながらプレートをインキュベートします。
- 結果をJMP DOE計画にアップロードし、予測プロファイルを生成して、目的の応答変数に基づいてK-グルタミン酸、Mg-グルタミン酸、およびDTTの最適な濃度レベルを決定します。この場合、最大蛍光および反応速度を応答変数とした。
- 表3に示すように試薬を組み合わせて、2X CFPSバッファーを作成します
- 分注して-80°Cで保存
7.再水和凍結乾燥ヒドロゲル中のCFPS(方法A)
注:CFPS反応に使用されたプラスミドは、 大腸菌36 用のEcoFlexモジュラーツールキットのコンポーネントを使用して作成され、Whitfieldらに記載されている11mCherryおよびeGFPは、構成的JM23100プロモーターの制御下にありました。これらのコンポーネントは Addgene から入手できます。
- -80°C保存から無細胞抽出液を回収し、氷上で約20分間解凍します。
- 2x CFPSバッファーとプラスミドDNAを採取し、氷上で解凍します。
- 凍結乾燥したヒドロゲルを収集し、ゲルをベンチに放置して15分間室温に到達させます。
- ゲルを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、必要に応じてメスでゲルをトリミングしてウェルに収まるようにします。
- 1.5 mL のマイクロ遠心チューブに、10 μL の無細胞抽出液を 25 μL の 2x CFPS バッファーおよび 4 μg のプラスミド DNA と混ぜ合わせます。ddH2Oで総容量を50 μLまで作り、CFPS溶液を作成します。
- CFPS溶液を凍結乾燥ヒドロゲルにピペットで移します。
- ゲルをCFPSシステムに室温で5〜10分間浸します。
- ゲルをスパチュラを使用して黒色の384ウェルマイクロタイタープレートに移します。
- マイクロタイタープレートをプレートリーダーに移し、ステップ6.6で説明したプレートリーダー設定を使用して蛍光を検出および分析します。代表的な結果は、以前の研究で入手可能です31、33。
8. 展開型ハイドロゲルにおける無細胞タンパク質合成(B法)
- -80°C保存から無細胞抽出液を回収し、氷上で約20分間解凍します。
- プラスミドDNAを採取し、氷上で解凍します。
- 氷上での1.5 mLマイクロ遠心チューブで、10 μLの無細胞抽出物を3 μgのプラスミドDNAおよび25 μLの2x CFPSバッファーと組み合わせ、総容量37.5 μLにします。
- 3gのアガロースを測定し、100mLのddH2O緩衝液に加えて、3%アガロースを生成する。
- 3%のアガロースを30秒で高出力でマイクロ波で加熱します。
- CFPSミックスを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに12.5 μLの溶融アガロースをピペットで入れ、総容量50 μLにします。
- 溶融したアガロースを冷却しますが、重合はせず、アガロースを50°Cに設定されたヒートブロックに入れます。
- 溶融アガロースをCFPS溶液と組み合わせます。ピペッティングとチップとの攪拌 で 混合し、CFPS溶液を混合する前にゲル重合を避けるために素早く動くようにしてください。
- ゲルを室温で冷却し、約2分間重合させます。
- 重合したアガロースをスパチュラ付きの1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、液体窒素中で瞬間凍結します。
- 瞬間凍結したヒドロゲルを-80°Cの貯蔵庫に1時間入れます。
- ストレージからゲルを回収します。マイクロ遠心チューブの蓋を外し、チューブをワックスフィルムで覆い、フィルムに穴を開けて水分を乾燥させます。
- 次の設定で凍結乾燥機を使用します:温度:-20°C、圧力:0.1mbar、18時間(一晩)凍結乾燥。
- 凍結乾燥したCFPSデバイスは、使用するまで-80°Cの保管場所に保管してください。
- 凍結乾燥CFPSデバイスは、およそ50μLの湿潤容積を有し、過剰な液体なしで50μLのddH2Oで再水和することができる。水分補給には約30分かかります。
- ゲルをスパチュラを使用して黒色の384ウェルマイクロタイタープレートに移します。
- マイクロタイタープレートをプレートリーダーに移し、ステップ6.6で説明したプレートリーダー設定を使用して蛍光を検出および分析します。代表的な結果は、以前の出版物31、33で入手可能です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルでは、CFPS反応をヒドロゲルマトリックスに組み込むための2つの方法について詳しく説明しており、 図1 は2つのアプローチの概略的な概要を示しています。どちらの方法も凍結乾燥と長期保存に適しています。方法Aは、2つの理由から最も利用されている方法です。第1に、ある範囲のヒドロゲル材料11を扱うための最も適用可能な方法であることが示された。第二に、方法Aは遺伝子構築物の並行試験を可能にする。方法Bは、最適化されたシステムの製造と現場展開に適しています。どちらのプロトコルでも、実験の再現性を高めるために、一度に多くのサンプルを調製できます。この機能は、凍結乾燥装置を乾燥状態で出荷し、必要に応じて現場で再構成できるため、技術の長期的な開発にも役立ちます。
プロトコルおよび 図1 で概説されているアプローチは、単一遺伝子構築物の発現または複数の遺伝子の共発現に使用することができる。 図2 に示すデータは、0.75%アガロースゲルにおけるeGFPとmCherryの両方の発現を示しています。共焦点顕微鏡を使用して、タンパク質発現が内部平面内を含むヒドロゲル全体で均一であることを確認しました。具体的には、タンパク質合成はヒドロゲルの外縁に限定されず、内部蛍光はタンパク質拡散の結果ではありませんでした。これを確認するために、eGFP発現ヒドロゲルをmCherry発現ヒドロゲルと物理的に接触させることによって、あるヒドロゲルから別のヒドロゲルへのタンパク質拡散を見ることができた。両者の間の拡散速度は、材料内の赤色または緑色の蛍光の広範な局在を説明するには不十分でした。この実験はまた、ヒドロゲルに無細胞デバイスを展開することの重要な利点を示しています-デバイスの機能は、液体無細胞反応では不可能な方法で空間的に編成できます。さらに、遺伝子ネットワークの作成には、複数の遺伝子産物の同時合成が必要です。 図2 に示す結果(下段)は、アガロースにおけるmCherryとeGFPの両方の共発現を確認した。この研究では、両方のタンパク質が発現され、タンパク質間の空間的競合はなかった。ここでも、赤と緑の波長範囲のオーバーレイは、ヒドロゲル内の両方のタンパク質の均一な空間分布を示しています。
表1:14倍のエネルギーソリューション株。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:無細胞タンパク質合成反応におけるDTT、Mg-グルタミン酸、およびK-グルタミン酸の最適化のための実験アレイの設計。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 3: 2x CFPS バッファ コンポーネント。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図1:2つのプロトコルの概略図。最初の方法(方法A、この論文で実証)では、ヒドロゲル材料が最初に調製され、次に無細胞成分なしで凍結乾燥されます(ステップ1)。これらの乾燥ヒドロゲルは、タンパク質産生のためのインキュベーションの前に正しい量の無細胞反応(ステップ3)で、必要に応じて(ステップ2)保存および再構成することができる変異法、方法Bは、最初のヒドロゲル製造において無細胞反応成分の全部または一部を組み込む。凍結乾燥(ステップ1)に続いて、ヒドロゲルは、次いで、水単独で、または目的の分析物を含む緩衝液中で再構成され得る(ステップ2)。タンパク質生産(ステップ3)は以前と同様に継続されます。凍結乾燥無細胞成分をヒドロゲルポリマーで再構成する第3の方法は、Whitfieldら11に記載されているが、今日まで限られた数のヒドロゲルでの使用しか見出されていない。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 大腸菌 細胞溶解物を用いたヒドロゲル中でのeGFPおよびmCherryの無細胞タンパク質合成。 アガロースゲル(0.75%)は、4 μgのeGFPまたはmCherryテンプレート(中央)または4 μgのeGFPおよびmCherryテンプレート(下)を使用して、DNAテンプレートなしで調製しました。ヒドロゲルを4時間インキュベートした後、共焦点顕微鏡を赤および緑のチャネルで観察した。2つのチャネルのオーバーレイも示されており、オーバーレイには微分干渉コントラスト(DIC)画像が含まれています。eGFPまたはmCherryテンプレートのいずれかを含むヒドロゲルを別々に調製したが、互いに物理的に接触させてインキュベートした。ゲルの直径は6mmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、 大腸菌 細胞ライセートベースのCFPS反応をアガロースヒドロゲルに組み込むための2つのプロトコルについて概説します。これらの方法は、材料全体で同時に遺伝子発現を可能にします。このプロトコルは、他のCFPSシステムにも適用でき、ここで詳しく説明する実験室で調製された細胞ライセートに加えて、市販のCFPSキットを使用して成功裏に実施されています。重要なことに、このプロトコルは、外部液相の非存在下での遺伝子発現を可能にする。これは、システムが自己完結型であり、無細胞反応浴を必要としないことを意味します。ヒドロゲル内でCFPS反応が起こる以前の方法とは異なり、この方法では外部バッファーと反応容器の必要性が取り除かれます。これらの方法により、研究者は無細胞合成生物学デバイスのシャーシとしてのヒドロゲル材料の使用を探求し、最終的にはそのようなデバイスを実験室から移動するためのルートを提供することが期待されています。
両方のアプローチの成功に不可欠なのは、高品質の細胞溶解物の使用です。高品質の細胞ライセートは、タンパク質濃度が高く(>40 mg/mL)、調製期間中は冷たく保たれ、凍結融解サイクルを繰り返してはなりません。さらに、DNAテンプレートが高純度であることが重要です。そのためには、CFPS環境内で転写反応を進行させるための高純度・高収率プラスミド調製キットを用いて細胞からプラスミドを抽出する必要があります。これらの重要な段階は、すべての CFPS アプリケーションに共通であり、この方法に固有のものではありません。それにもかかわらず、プロトコルの有効性に最も大きな影響を与えるのはCFPSコンポーネントの準備です。材料に関しては、ヒドロゲルの効果的で迅速な凍結乾燥を達成する必要があります。凍結乾燥機が十分に低温(-45°C未満)に達しない場合、ゲルは凍結乾燥ではなく乾燥され、ヒドロゲルマトリックスの内部構造が損なわれ、組み込みCFPSシステムの劣化を引き起こす可能性があります。 方法B にも固有の懸念があります。具体的には、CFPSミックスを溶融アガロースに添加してゲルを形成する場合、CFPS反応の熱劣化を防ぐために、CFPS混合物を添加する前に溶融アガロースを十分に冷却する必要があります。ただし、アガロースを冷却しすぎると、ゲルが重合し、CFPSシステムの添加が妨げられます。最後に、ヒドロゲルはある程度の自家蛍光を有し、CFPS反応中に生成される蛍光シグナルと競合する可能性があります。したがって、材料と同じ蛍光特性を持たない適切なネガティブコントロールと遺伝子レポーターを含めることが重要です。
ここで示すプロトコルは、モデルヒドロゲルとしてのアガロースの使用を中心にしています。アガロースは、広く入手可能で安価であり、優れたタンパク質生産能力を示すため、この研究の優れたモデルシステムです。以前の研究では、アガロースがCFPS反応においてクラウディングエージェントPEGの代替となり得ることも示されており、ポリマーシャーシとCFPS反応との間の相互作用がタンパク質産生を促進する可能性があることを示しています11。しかしながら、これらの方法は、様々な物理的および化学的特性を有する広範囲の代替ヒドロゲルマトリックスを用いた改変にも適している。この方法は、キサンタンガム、アルギン酸塩、アシルジェランガム、ポリアクリルアミド、ヒアルロン酸ヒドロゲル、ならびにポロクサマーゲルF−108およびF−127に適用されている9。いくつかのシナリオでは、液体コントロールまたは他のヒドロゲルと比較して、タンパク質産生の減少が観察される。それにもかかわらず、これらのシナリオでは、材料自体の機能性(例えば、その接着特性または生体適合性)がタンパク質産生の減少が受け入れられるような重要な利益をもたらす場合、トレードオフが満たされ得る。ヒドロゲルの濃度に対する変更も行うことができる。アガロースの場合、この方法は、例えば0.5%〜1.5%w/vの範囲のポリマー濃度に適しています。ゲル濃度が高いほど、通常、物質的な意味で、取り扱いに対する弾力性が高く、CFPS反応をよりよく保存する、より堅牢なデバイスになります。しかしながら、増加したゲル濃度とのトレードオフは、反応が生産速度またはタンパク質収率を低下させる可能性があることである11,37。しかしながら、ポリマー濃度とタンパク質産生との間の関係は線形ではなく、使用されるヒドロゲルに依存する11。そのため、新しいヒドロゲルポリマーについては、材料の機能性と無細胞機能性のバランスをとるためにある程度の実験が必要です。
外部バッファーを必要とせずにCFPS反応をヒドロゲル材料に組み込むことは、セルフリーデバイスの展開のための興味深いルートを表しています。無細胞デバイスには、制御された実験室環境の外に遺伝子操作された生物を放出する必要がなくなるという利点があります。さらに、ヒドロゲルに反応を埋め込むことで、再構成後の反応容器(通常はプラスチック製品)が不要になります。多くのヒドロゲルが生分解性であることを考えると、これはプラスチック廃棄物を削減するための潜在的なルートを提供します。同様に、ここで詳述されているプロトコルは、ヒドロゲルとCFPSの両方が凍結乾燥に適していることも示しています。凍結乾燥の繰り返しサイクルは推奨されず、CFPSとヒドロゲルの機能を損なう可能性がありますが、シングルユースデバイスの場合。コンポーネントを凍結乾燥して再構成する機能により、デバイスの重量が削減され、輸送中のコールドチェーンが不要になります。これらの特性は、最終的にロジスティクスを簡素化し、デバイスの輸送コストを削減します。さらに、ヒドロゲルはそれ自身の多くの有用な機能特性を有する。例えば、それらはペースト、潤滑剤、および接着剤として機能することができる。ヒドロゲルはまた、生体適合性、生分解性であり、それ自体が刺激応答を有する可能性がある。まとめると、生物学的機能と材料科学の相乗効果が達成され、新しいクラスのバイオプログラム可能な材料が生まれます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
著者らは、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会賞BB/V017551/1(S.K.、T.P.H.)およびBB/W01095X/1(A.L.、T.P.H.)、および工学物理科学研究評議会-防衛科学技術研究所賞EP/N026683/1(C.J.W.、A.M.B.、T.P.H.)の支援に大いに感謝しています。この出版物を裏付けるデータは、10.25405/data.ncl.22232452で公開されています。オープンアクセスの目的で、著者は、著者が受理した原稿のバージョンにクリエイティブコモンズ表示(CC BY)ライセンスを適用しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
References
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al.
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
