Summary
Het verhogen van de detectie van onrijpe tephritid fruitvliegen in het veld kan leiden tot tijdige inspanningen om populaties van deze destructieve plagen te elimineren. Het detecteren van late instarlarven is sneller en nauwkeuriger wanneer gastheerfruit in een zak wordt gemoest en de pulp door een reeks zeven wordt geleid dan met de hand snijden en visuele inspectie.
Abstract
Fruitvliegen van de Tephritidae-familie behoren tot de meest destructieve en invasieve landbouwplagen ter wereld. Veel landen ondernemen dure uitroeiingsprogramma's om beginnende populaties te elimineren. Tijdens uitroeiingsprogramma's wordt een gezamenlijke inspanning geleverd om larven te detecteren, omdat dit sterk wijst op een broedpopulatie en helpt bij het vaststellen van de ruimtelijke omvang van de plaag. De detectie van onvolgroeide levensfasen leidt tot extra controle- en regulerende maatregelen om verdere verspreiding van het plaagorganisme in te dammen en te voorkomen. Traditioneel wordt larvale detectie bereikt door individuele gastheervruchten te snijden en deze visueel te onderzoeken. Deze methode is arbeidsintensief, omdat slechts een beperkt aantal vruchten kan worden verwerkt en de kans op het missen van een larve groot is. Een extractietechniek die i) het mushing van gastheerfruit in een plastic zak combineert, ii) pulp door een reeks zeven zeeft, iii) het plaatsen van vastgehouden pulp in een bruine suikerwateroplossing en iv) het verzamelen van larven die naar de oppervlakte drijven, werd getest. De methode werd geëvalueerd in Florida met in het veld verzamelde guave die van nature besmet was met Anastrepha suspensa. Om lage populaties na te bootsen die meer representatief zijn voor een uitroeiingsprogramma van fruitvliegen, werden mango's en papaja op Hawaï besmet met een bekend, laag aantal Bactrocera dorsalis-larven . De toepasbaarheid van de methode werd in het veld getest op guave die van nature besmet is met B. dorsalis om de methode te evalueren onder omstandigheden die werknemers ervaren tijdens een noodfruitvliegprogramma. In zowel veld- als laboratoriumproeven was het mushing en zeven van de pulp efficiënter (kostte minder tijd) en gevoeliger (meer larven gevonden) dan het snijden van fruit. Het drijven van de pulp in bruine suikerwateroplossing hielp bij het detecteren van eerdere instarlarven. Het verzamelen en zeven van vruchtpulp van belangrijke tephritid-gastheren kan de kans op het detecteren van larven tijdens noodprogramma's vergroten.
Introduction
Tephritid fruitvliegen behoren tot de meest destructieve landbouwplagen, waarbij de geslachten Anastrepha, Bactrocera en Ceratitis het grootste risico vormen1. Veel gebieden lopen een hoog risico op de vestiging van exotische fruitvliegen, gebaseerd op 1) historische invallen en bijbehorende afbakenings- en uitroeiingsprogramma's, 2) het hoge aankomstpercentage van fruitvlieggastheermateriaal in havens van binnenkomst en 3) klimatologische omstandigheden die gunstig zijn voor de vestiging van reproducerende populaties. De staat Californië ervaart jaarlijks meerdere invallen en detecties van tefritiden2. Er zijn de afgelopen eeuw wereldwijd meer dan 200 invallen en uitroeiingsprogramma's tegen tefritiden geweest, en dit is de afgelopen decennia aanzienlijk versneld3. Hoewel de overgrote meerderheid van deze programma's succesvol zijn in het uitroeien van de binnenvallende fruitvlieg3,4, blijft de economische en ecologische last van deze invasies nog steeds hoog en is de mogelijkheid van vestiging altijd aanwezig; een recent catastrofaal voorbeeld is de infectie van Bactrocera dorsalis op het Afrikaanse continent5.
Tijdens noodfruitvliegprogramma's wordt een gezamenlijke inspanning geleverd om broedpopulaties van de binnenvallende soorten te detecteren en te beheersen. De staat Florida reageert bijvoorbeeld op tephritid-invallen door gronddruppels toe te passen (onder de druppellijn van vruchtdragende waardplanten) en gastheerfruit te verwijderen in een straal van 200 m rond locaties waar gepaarde vrouwtjes en / of larven worden gevonden6. Deze acties en tactieken dienen om larven en poppen in de grond te doden en eieren en larven uit fruit in het gebied te verwijderen. In sommige uitroeiingsprogramma's wordt een aanzienlijke hoeveelheid gastheerfruit verwijderd. In 2015 werd meer dan 100.000 kg fruit vernietigd tijdens het B. dorsalis-uitroeiingsprogramma in Florida6. De economische verliezen voor telers en aanverwante industrieën in het quarantainegebied alleen al werden geschat op meer dan $ 10,7 miljoen7.
Om tephritid-larven in de quarantainegebieden te vinden, verzamelt een klein team van entomologen gastheervruchten in een straal van 200 m rond een vrouwelijke vliegendetectiegebied en snijdt en inspecteert elke vrucht visueel op larven6. Met beperkte personele middelen en honderden mogelijke gastheren wordt de taak moeilijk, vooral in de gebieden waar de plantendiversiteit in zowel commerciële productiegebieden als woonerven hoog is. Bovendien kunnen larven worden gemist bij het snijden van gastheervruchten. In een studie die het snijden van fruit in de havens van binnenkomst evalueerde, bleek het snijden van fruit niet zo effectief te zijn in het detecteren van A. suspensa in vergelijking met het vasthouden van de besmette vruchten gedurende enkele weken en het tellen van de larven en poppen in het verpoppingssubstraat8.
Er zijn alternatieven voor fruitsnijden voor het detecteren van een besmetting 9,10,11,12,13. Een bruine suiker drijf en een heet water methode zijn bijvoorbeeld beide geaccepteerde procedures die worden gebruikt om westerse kersenfruitvliegen in geoogste kersente detecteren 9,10. De bruine suikermethode omvat het plaatsen van gemalen fruit in een suikerwateroplossing en het verzamelen van larven die naar de top drijven. De drijfmethode voor bruine suiker is speciaal ontwikkeld om te voldoen aan de wettelijke voorschriften voor geëxporteerde kersen, die vereisen dat verpakkingshuizen controleren op quarantaine fruitvliegplagen. Er is ook een goedgekeurd Amerikaans-Canadees bosbessencertificeringsprogramma dat bruine suikerwaterdrijven, zoutwaterdrijven of koken omvat om fytosanitaire voorzieningen te ondersteunen14. Bij het testen van de nauwkeurigheid van suiker en warm water drijven, gebruikten onderzoekers de zeefmethode om te bepalen hoeveel larven worden gemist 9,10,11,12,13. Een studie toonde aan dat het mengen van gemalen bosbessen in een zoutoplossing en het filteren van de oplossing door een herbruikbaar koffiefilter vier keer beter was in het detecteren van Drosophila suzukii-larven dan het visueel inspecteren van het oppervlak van zout- en suikeroplossingen14. Daarnaast werd gaschromatografie gebruikt voor de detectie van A. suspensa-larven in citrus15. Deze benaderingen zijn niet getest op toepasbaarheid in veldonderzoeken.
Ons doel was om een methode te ontwikkelen en te testen om tephritid-larven in het veld te vinden met behulp van zeven en suikerwaterdrijven. Deze methode maakt de efficiëntere detectie van onrijpe fruitvliegen mogelijk dan de traditionele fruitsnijmethode, waardoor de tijdige controle van fokpopulaties tijdens fruitvlieguitroeiingsprogramma's wordt ondersteund.
Protocol
1. Fruit selectie
- Bepaal welk fruit beschikbaar is in het te onderzoeken gebied.
- Selecteer gastheerfruit op basis van de lijst met bekende gastheren voor de doeltefritidesoorten.
- Kies zacht vlezig, rijp fruit, zoals mango's, papaja en guave. Onrijp of hardvlezig fruit, zoals tropische amandelen, moet worden geïnspecteerd met een andere methode, zoals het snijden van fruit.
- Selecteer gevallen, overrijp fruit of rijp fruit op bomen met tekenen van schade, ovipositielittekens en zachte plekken.
- Verwerk ongeveer 2 liter fruit tegelijk (bijvoorbeeld 5 guaves of 5 middelgrote mango's vormen voldoende monsters voor deze methode). Het aantal vruchten dat in één keer kan worden verwerkt, is afhankelijk van de grootte van de vruchten (figuur 1A).
2. Mushing
- Snijd het fruit in grote stukken en plaats het in een opbergzak met ritssluiting van 4 L (figuur 1B).
- Voeg water toe aan de zak totdat het water de gehakte vrucht 25-50 mm bedekt (figuur 1C).
- Knijp de vrucht voorzichtig met de hand uit totdat alle pulp van de schil is losgekomen en een gladde consistentie heeft (d.w.z. geen grote brokken) (figuur 1D).
3. Zeven voor late instar collectie
- Stapel de zeven op elkaar. Gebruik grote zeven (457 mm diameter) voor het verwerken van grote hoeveelheden fruit (~ 5 vruchten tegelijk) en kleinere zeven (305 mm diameter) voor individuele vruchten of kleinere monsters (< 5 vruchten).
- Stapel de zeef met een grote maas (nr. 8; 2,36 mm) zeef bovenop een kleine maas (nr. 20; 0,85 mm) zeef. Voor de detectie van vroege instars plaatst u een derde zeef (nr. 45; 0,35 mm) op de bodem van de stapel (figuur 1E).
- Giet de pulp in de bovenste zeef (figuur 1F).
- Was de pulp grondig door de stapel zeven met water uit een kraan, slang of fles totdat de fijne pulp door de zeven is gegaan (figuur 1G).
- Scan de bovenste zeven visueel op late instarlarven die mogelijk zijn vastgehouden met de schil of grote stukken fruit (figuur 1H).
- Inspecteer de tweede zeef zorgvuldig op late instarlarven. Bij grote hoeveelheden fijne pulp kan extra spoelen nodig zijn.
- Verzamel larven van de zeven met een larvale tang en plaats ze in injectieflacons met 70% EtOH.
4. Suiker floatation voor vroege instar collectie
- Meng de suikeroplossing vooraf door 453 g (1 doos) donkerbruine suiker op te lossen in 2 L leidingwater, wat een Brix-waarde van 19°10 oplevert.
- Was de pulp van de fijnmazige zeven (bijv. nr. 20 en nr. 45) tot de rand van de zeef met leidingwater en verplaats het materiaal vervolgens naar een plastic pan (11 L).
- Voeg de bruine suikeroplossing toe totdat deze de pulp 25-50 mm bedekt en voeg 2 druppels antischuimer toe. Laat het vruchtvlees ongeveer 5 minuten in de bruine suikeroplossing zitten.
- Verzamel larven die met een larvale tang naar het oppervlak van de oplossing drijven in injectieflacons met 70% EtOH.
5. Larvale curatie
- Label een injectieflacon met de verzamellocatie, datum, soort fruit en verzamelaar voor later onderzoek en identificatie.
Representative Results
Vroege en late instar Anastrepha suspensa extractie uit veld verzameld fruit
In dit experiment hebben we de fruitstek en de mushing, zeven en floating (MSF) methoden vergeleken met betrekking tot het aandeel gedetecteerde larven en de gemiddelde tijd die nodig is om ze te detecteren. Guave, sterk besmet met de larven van Anastrepha suspensa, werden verzameld uit een plant aan de Universiteit van Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Tropical Research and Education Center, Homestead, FL. De vruchten werden willekeurig gesorteerd in groepen van 5 en toegewezen aan 1 van de 2 larvale extractiemethoden: 1) met de hand snijden of 2) de MSF-methode. De tijd om alle larven te verzamelen die met het blote oog zichtbaar zijn met behulp van elke extractiemethode werd geregistreerd.
De handsnijmethode volgde de methode die momenteel wordt gebruikt in een uitroeiingsprogramma. Elk van de 5 werksters (n = 5) kreeg 5 vruchten toegewezen om naar alle stadia van larven te zoeken door de vruchten in kleinere stukjes te snijden en de pulp visueel te inspecteren. Om te bepalen of larven werden gemist bij de visuele inspectie, werden de handgesneden stukjes fruit opnieuw geïnspecteerd met behulp van een ontleedmicroscoop (10x).
Voor de MSF-methode werden 5 vruchten in grote stukken gesneden (50-80 cm), in zakken met ritssluiting geplaatst en voorzichtig met de hand geperst totdat alle pulp van de schil was losgemaakt en de pulp een gladde consistentie had (d.w.z. geen grote brokken). De gestampte vrucht werd door een reeks grote (45,7 cm) messing zeven gezeefd. Het grootste gaas (nr. 8) werd aan de bovenkant gestapeld, gevolgd door een nummer nr. 20 en een zeef met nr. 45 gaas. Het personeel dat aan deze behandeling was toegewezen, waste de pulp door het gaas met water uit een slang die was aangesloten op een gootsteenkraan. De late instarlarven waren zichtbaar in de zeven. De kleinere instars werden gemengd met pulp, waardoor ze moeilijk te zien en te verwijderen waren. Daarom werd het pulp/larvenmengsel van de zeven in emmers gedaan met 1 L bruine suikerwateroplossing. De larven dreven onmiddellijk naar de oppervlakte. De oplossing werd voorzichtig geroerd en na 5 minuten werden larven uit de emmers verwijderd en geteld. De tijd om de vrucht te verwerken was een combinatie van mushing, zeven en het verwijderen van de larven uit de suikerwateroplossing. Gegevens voor het aantal larven dat werd gevonden via de handsnij- of zeef- en drijfmethoden werden geanalyseerd met behulp van de niet-parametrische test van Kruskal-Wallis (p = 0,05)16.
De MSF-methode leverde grotere aantallen larven op (figuur 2A) en meer larven per minuut (figuur 2B) dan met de hand snijden. Hoewel de detectie van de verschillende instars in deze studie niet werd gekwantificeerd, zagen we dat alle instars (eerste, tweede en derde) werden gevonden met behulp van zeven, terwijl pas later instars (tweede en derde) werden gezien met behulp van handsnijden. Toen de eerder gesneden en visueel geïnspecteerde monsters opnieuw werden geïnspecteerd met een ontleedmicroscoop, werd 40% van de late instarlarven die de vruchten besmetten gemist. Eerdere innames werden echter vooral gevonden bij de herkeuring.
Dit experiment toonde aan dat het gebruik van de MSF-methode effectiever en efficiënter is voor het vinden van larven in sterk besmet fruit. Fruit besmet met lagere aantallen larven wordt echter vaker aangetroffen in een uitroeiingsprogramma, waar de binnendringende soorten zeer zeldzaam zouden zijn. Daarom voerden we een laboratoriumonderzoek uit waarbij de waardvrucht werd besmet met een bekend, laag aantal larven.
Handmatige aantasting van mango en papaja om lage Bactrocera dorsalis-besmetting te simuleren
Dit experiment vergeleek de methoden voor het snijden van fruit en AzG met betrekking tot het aandeel gedetecteerde larven en de tijd die nodig was om ze te detecteren wanneer de besmetting relatief laag was. Handmatige besmetting werd gebruikt als een experimenteel hulpmiddel om de werkzaamheid van elke methode te evalueren, omdat het aantal aanwezige larven met zekerheid bekend was.
Een kurkboorder (1,0 cm diameter) werd gebruikt om 5 gaten te maken in individuele mango- en papajavruchten die vrij waren van fruitvlieglarven. Een enkele late tweede tot vroege derde instar B. dorsalis larve werd in elk van de 5 gaten van een subset van de vrucht geplaatst. De gaten werden afgedekt met behulp van het stuk geboord uit de vrucht en de resterende vruchten werden afgedekt zonder larve in te brengen om handmatige besmetting visueel te simuleren. De vruchten werden gedurende 48 uur bij 27 °C gehouden om larvale ontwikkeling mogelijk te maken. Het experiment werd uitgevoerd in het ARS-laboratorium in Hilo, Hawaii Island (n = 5 werknemers) en het APHIS-PPQ-laboratorium op Oahu Island, Hawaii (n = 4 werknemers).
Voor het snijden van fruit kreeg elke arbeider 5 mango's (1 besmet met 1 larve en 4 niet besmet) en 4 papaja's (één besmet en 3 niet besmet). Een arbeider sneed elke vrucht afzonderlijk in steeds kleinere stukjes en inspecteerde de pulp voortdurend op onrijpe fruitvliegjes. Het zoeken werd gestaakt toen de pulp grondig werd geïnspecteerd. Het totale aantal gevonden larven en de tijd die elke werknemer besteedde aan het verwerken van alle vruchten door te snijden, werden geregistreerd (figuur 3) en (figuur 4).
Elke arbeider kreeg een andere soortgelijke set vruchten (5 mango's en 4 papaja's) voor mushing of zeven (zonder dat er fruit werd gesneden), met 2 stukken besmet zoals eerder beschreven. Pulp werd in de bovenste zeef gegoten en door de stapel zeven gewassen met water uit een kraan en larven verwijderd, zoals beschreven in het protocol. Het experiment werd tweemaal uitgevoerd, met suikerfloatatie en zonder suikerfloatatie, om te bepalen of het verwijderen van de floatatiestap de snelheid van het proces zou verhogen zonder de gevoeligheid te verliezen (d.w.z. alle of de meeste larven werden gevonden) (figuur 3). Het aantal gevonden larven en de tijd die elke werker besteedde aan het verwerken van het fruit via de snij-, MSF- of MS-methode werden geregistreerd.
Voor zowel mango's als papaja's resulteerde de volledige MSF-methode (inclusief floatatie) in hogere aantallen larvale detecties en was sneller dan het snijden van fruit (tabel 1). Werknemers die de traditionele fruitsnijmethode gebruikten, misten respectievelijk 32% en 35% van de larven in mango's en papaja (tabel 1). Het verwerken van fruit in bulk met behulp van de AZG-techniek kostte 30% minder tijd dan het snijden van individuele mango's en 35% minder tijd dan het snijden van individuele papaja's (figuur 3). Er werden meer larven per minuut gevonden met behulp van de MSF-methode voor papaja (figuur 3C) en mango (figuur 3D) in vergelijking met de fruitsnijmethode. Alle gevonden larven leefden nog.
Larvale morfologische identificatie is alleen mogelijk voor late instars. We herhaalden het bovenstaande experiment, maar lieten de drijfprocedure achterwege om te bepalen of het herstel van larven hoog bleef en de snelheid van fruitverwerking toenam. De MS-methode (met weggelaten floatatie) resulteerde in meer larvale detecties voor papaja (figuur 4A) en mango (figuur 4B) in vergelijking met snijden en visuele inspectie. Bovendien was de techniek sneller dan het snijden en visueel inspecteren van papaja (figuur 4C) en mango (figuur 4D). Het verwijderen van de drijfstap uit de AZG-methode verkortte de tijd om late instarlarven te vinden met 90% voor papaja en met 48% voor mango's (tabel 2). Het percentage gevonden larven was hoog voor beide methoden en was consistent hoger voor MS (floatatie weggelaten). Voor papaja werden respectievelijk 80% en 85% van de larven teruggevonden met de methoden van Artsen zonder Grenzen en MS (tabel 1 en tabel 2). Voor mango werd respectievelijk 88% en 95% teruggewonnen uit de methoden MSF en MS (tabel 1 en tabel 2).
Veldvergelijking van de methoden voor het snijden van fruit en AzG
Het doel van dit experiment was om de methoden voor het snijden van fruit en Artsen zonder Grenzen onder veldomstandigheden te vergelijken, waarbij een noodprogramma voor fruitvliegen werd nagebootst. Fruitverwerking werd uitgevoerd zonder het gemak en de infrastructuur van het laboratorium om de veldgereedheid van de twee larvale extractiemethoden te testen. Het werk werd uitgevoerd in een guaveboomgaard in de USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit Germplasm in de buurt van Hilo. In totaal werden 40 guaves met tekenen van besmetting verzameld en verdeeld in 2 groepen. In totaal werden 20 guaves onderworpen aan snij-/visuele inspectie, gevolgd door MSF (inclusief floatatie), waardoor de gevoeligheid van de snijmethode in vergelijking met de MSF-methode kon worden beoordeeld. De dissectie verliep zoals hierboven beschreven. Bij detectie werden larven verwijderd en geteld. Vier arbeiders ontleedden elk 5 guaves en de tijd die nodig was voor het snijden en inspecteren werd voor elke werknemer geregistreerd. Het nasnijden van MSF werd uitgevoerd zoals hierboven, behalve dat een derde zeef met kleinere mazen (nr. 40, 0,420 mm) werd gebruikt naast de zeven nr. 8 en nr. 20 om kleinere larven te verzamelen. De tweede set van 20 guaves werd in 2 zakken met ritssluiting (10 vruchten per zak) geplaatst en werd alleen onderworpen aan Artsen zonder Grenzen (d.w.z. geen snijden), waardoor een vergelijking mogelijk was van de tijd die nodig was voor het snijden van fruit versus Artsen zonder Grenzen. Zoals hierboven vermeld, werden bij deze procedure drie zeven gebruikt. Het aantal gevonden larven en de totale tijd om fruit te verwerken (mushing en het fruit 5 minuten in de zak houden / zeven / drijven in suikeroplossing) werden geregistreerd.
Zoals in het laboratorium werd gevonden, onderschatte het snijden van fruit de fruitplaag en was zeer variabel, waarbij 25% -83% minder larven werden gedetecteerd dan wat kon worden teruggewonnen met behulp van MSF-methoden (tabel 3). Bovendien heeft Artsen zonder Grenzen in het monster met lage aantallen larven 500% meer larven teruggevonden, wat een hogere testgevoeligheid en een grotere kans biedt om het besmette organisme te identificeren. Fruit werd veel sneller verwerkt met behulp van de MSF-methode in vergelijking met snijden; het snijden en inspecteren van 5 vruchten vergde ongeveer evenveel tijd als het verwerken van 10 vruchten via Artsen zonder Grenzen.
Figuur 1: Stappen van het extractieprotocol voor fruitvlieglarven. (A) Verwerk ongeveer 2 L per volume fruit tegelijk (bijvoorbeeld 5 guaves of 5 middelgrote mango's vormen adequate monsters voor deze methode). (B) Snijd het fruit in grote stukken en plaats het in een opbergzak met ritssluiting van 4 L. (C) Voeg water toe aan de zak totdat het water de gehakte vrucht met 25-50 mm bedekt. (D) Knijp de vrucht voorzichtig met de hand uit totdat alle pulp van de schil is losgeraakt en een gladde consistentie heeft (d.w.z. geen grote brokken). (E) Stapel de zeef met de zeef met grote mazen (nr. 8; 2,36 mm) erop, gevolgd door de zeef met kleine mazen (nr. 20; 0,85 mm). Voor vroege instars, plaats een derde zeef (nr. 45; 0,35 mm) op de bodem van de stapel. (F) Giet de pulp in de bovenste zeef. (G) Was de pulp grondig door de stapel zeven met water uit een kraan, slang of fles totdat de fijne pulp door de eerste zeef is gegaan. (H) Scan de bovenste zeven visueel op late instarlarven die mogelijk met de schil of grote stukken fruit zijn achtergebleven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vroege en late instar Anastrepha suspensa extractie uit veld verzameld fruit. Het gemiddelde aantal (± standaardfout van het gemiddelde [SE]) van Anastrepha suspensa-larven van vijf guavevruchten die zijn verzameld door het snijden en visueel inspecteren (snijden: 70,4 ± 11,9) of het wassen van de pulp door een reeks van drie zeven gevolgd door het weken van de pulp in een suikerwateroplossing (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Het gemiddelde aantal larven (±SE) dat per minuut wordt verzameld uit 5 guaves die worden verwerkt door stekken (1,21 ± 0,16) en door AzG (3,71 ± 0,50) (B). Elke methode werd 5 keer herhaald en sterretjes boven de balken geven significante verschillen aan voor het aantal larven (χ 2 = 6,81, p < 0,01) en de tijd tot verwerking (χ2 = 6,80, p < 0,01) op basis van een Kruskal-Wallis-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Validatie van de volledige mushing-sieving-floatation methode met behulp van handmatige aantasting van mango en papaja om lage Bactrocera dorsalis-besmetting te simuleren. Het gemiddelde aantal Bactrocera dorsalislarven (±SE) in papaja (stek: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) en mango (snijden: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) vruchten en het gemiddelde aantal larven (±SE) verzameld per minuut van papaja (stek: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) en mango (snijden: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Vruchten die werden verwerkt met behulp van de stek of de MSF-methoden (inclusief floatatie, n = 5) handmatig besmet met 5 derde instarlarven. Sterretjes boven de staven geven significante verschillen aan voor het aantal larven in papaja (χ 2 = 5,39, p = 0,02) en mango (χ2 = 3,94, p = 0,05) in vergelijking met fruitsnijden op basis van Kruskal-Wallis-tests. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Validatie van de mushing-zeefmethode (floatatie verwijderd) met behulp van handmatige aantasting van mango en papaja om lage Bactrocera dorsalis-besmetting te simuleren. Het gemiddelde aantal larven (±SE) in papaja (stek: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) en mango (snijden: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) vruchten en het gemiddelde aantal larven verzameld per minuut (±SE) in papaja (stek: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) en mango (snijden: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Vruchten werden handmatig besmet met 5 derde instar Bactrocera dorsalis larven en verwerkt door snijden en visueel inspecteren (snijden) of in een zak gestampt en door zeven gewassen (alleen mushing en zeven, zonder drijven, n = 4). Sterretjes boven de staven geven significante verschillen aan voor het aantal larven in papaja (χ 2 = 5,46, p = 0,02) en mango (χ 2 = 5,25, p = 0,02) en de tijd om papaja (χ 2 = 5,39, p = 0,02) en mango (χ 2 = 5,39, p = 0,02) te verwerken in vergelijking met fruitsnijden, gebaseerd op Kruskal-Wallis-tests. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Vrucht | # Fruit verwerkt | #Larvae toegevoegd | Verwerkingsmethode | #Larvae gevonden | Verwerkingstijd (min)* | % Herstel |
| Mango | 25 | 25 | Stek | 17 | 158 | 68% |
| Mango | 25 | 25 | AZG | 22 | 113 | 88% |
| Papaja | 16 | 20 | Stek | 13 | 62 | 65% |
| Papaja | 16 | 20 | AZG | 16 | 40 | 80% |
| *Totale tijd opgeteld over 5 werknemers. | ||||||
Tabel 1: Het aantal teruggevonden larven en de tijd om fruit te verwerken door het snijden en visueel inspecteren (snijden) of de volledige mushing, zeven en drijven (MSF) methode. De testvrucht werd handmatig besmet met 5 derde instarlarven gemengd met verveeld en afgedekt alleen fruit (1 van de 5 mango's, 1 van de 4 papaja's).
| Vrucht | # Fruit verwerkt | #Larvae toegevoegd | Verwerkingsmethode | #Larvae gevonden | Verwerkingstijd (min)* | % Herstel |
| Mango | 20 | 20 | Stek | 10 | 66 | 50% |
| Mango | 20 | 20 | MEVROUW | 19 | 44 | 95% |
| Papaja | 16 | 20 | Stek | 5 | 38 | 25% |
| Papaja | 16 | 20 | MEVROUW | 17 | 25 | 85% |
| *Totale tijd opgeteld over 4 werknemers. | ||||||
Tabel 2: Het aantal teruggevonden larven en de tijd om fruit te verwerken door alleen te snijden of te mushen en te zeven, floatatie weggelaten (MS). De testvruchten werden handmatig besmet met vijf derde instarlarven gemengd met verveeld en afgedekt alleen fruit (1 op de 5 mango's, 1 op de 4 papaja).
| Werknemer/methode | #Fruit verwerkt | Tijd om te verwerken (min) | #Larvae gevonden snijden | #Larvae vond Artsen zonder Grenzen* | % van het totale aantal larven gevonden via het snijden |
| Arbeider 1: snijden | 5 | 18 | 33 | 14 | 70% |
| Arbeider 2: snijden | 5 | 18 | 1 | 5 | 17% |
| Arbeider 3: snijden | 5 | 26 | 9 | 11** | 75% |
| Arbeider 4: snijden | 5 | 20 | 24 | ||
| Werknemer 5: Artsen zonder Grenzen | 10 | 22 | Nv | 22 | Nv |
| Werknemer 6: Artsen zonder Grenzen | 10 | 18 | Nv | 37 | Nv |
| * Pulp van het snijden en visuele inspectie opnieuw verwerkt met behulp van deMSF-methode om het aantal gemiste late 2-3 rd-instarlarven te bepalen | |||||
| ** Pulp van de werknemers 2 en 3 fruit gepoold voorafgaand aan de verwerking met behulp van de MSF-methode | |||||
Tabel 3: Het aantal larven dat in het veld verzamelde guave wordt aangetroffen door de vrucht te snijden en visueel te inspecteren (snijden) of door de vrucht te vermurwen, zeven en drijven (AZG).
Discussion
Ons doel was om een efficiënte en effectieve manier te ontwikkelen om tephritid-larven in het veld te vinden. De motivatie om een uitroeiingsprogramma te starten of een quarantainegebied in te stellen is de detectie van gepaarde vrouwtjes(en) of larven6, wat duidt op een broedpopulatie. De huidige methode om fruit te snijden en visueel te zoeken is inefficiënt bij het vinden van larven, omdat er meestal veel meer gastheervruchten aanwezig zijn dan individueel kunnen worden geïnspecteerd. Bovendien zijn de populaties van de tefritiden waarschijnlijk laag in een gebied van nieuwe invasie, waardoor de kans op het vinden van larven in een grote hoeveelheid fruit ongelooflijk moeilijk is. In het 2015 Bactrocera dorsalis-uitroeiingsprogramma in Florida werden bijvoorbeeld 54 verschillende gastheersoorten geïdentificeerd en werden meer dan 4.000 vruchten gesneden. In dit uitroeiingsprogramma werden slechts enkele larven in mango gevonden en geen andere gastheren bleken besmet te zijn6. We ontdekten dat de MSF/MS-methode zowel gevoeliger als sneller was in het detecteren van A. suspensa - en B. dorsalis-larven bij het verwerken van fruit met een grote hoeveelheid pulp (mango's, guave en papaja) in bulk in vergelijking met het snijden van fruit. De grotere hoeveelheid waardvruchten die het mogelijk is om te inspecteren met behulp van de mushing- en zeefmethode, gecombineerd met de toename van de detectie van een zeldzame larve, zou de kans kunnen vergroten dat een plaag vroeg zou worden gevonden. De vroege detectie van een broedpopulatie zou de kans op uitroeiing kunnen vergroten en de kosten van het programma kunnen verlagen.
Onze experimenten toonden aan dat het aantal larven dat werd gedetecteerd door werknemers die fruit snijden en visueel inspecteren, aanzienlijk varieerde. Arbeiders die fruit sneden, misten 50% en 75% van de B. dorsalis-larven in respectievelijk mango's en papaja. Daarentegen werd slechts 5% en 15% van de larven gemist met behulp van de MS-methode voor het verwerken van respectievelijk mango- en papajavruchten. Evenzo bleek uit een studie die het snijden van fruit in de havens van binnenkomst evalueerde, dat er een aanzienlijke variatie was in het aantal besmette vruchten en larven dat door de inspecteurs werd aangetroffen8. De studie toonde aan dat ervaren haveninspecteurs 64% -99% van de A. suspensa-larven en 16% -82% van het besmette fruit misten wanneer fruit werd gesneden en visueel werd geïnspecteerd8. Onze resultaten suggereren dat de mushing- en zeefmethode de kans zou kunnen verkleinen dat een werknemer een besmet fruit zou missen.
Suiker en warm water drijven zijn geaccepteerde protocollen in een systeembenaderingsmethode om ervoor te zorgen dat kersen en bosbessen vrij zijn van fruitvliegen14. Een deel van een zending wordt in de oplossing geplet, waarna een inspecteur het oppervlak van de suikeroplossing visueel screent op de aanwezigheid van eieren en larven. Hoewel een groter aantal vruchten kan worden verwerkt in vergelijking met het snijden van individuele vruchten, wordt de kans op het vinden van larven met behulp van deze technieken nog steeds beïnvloed door het vermogen van de inspecteur, het stadium en het aantal aanwezige larven en het type fruit8. We ontdekten dat, net als andere tephritiden, B. dorsalis en A. suspensa losraken van de vruchtpulp en naar de oppervlakte drijven. Interessant is dat we ontdekten dat met grotere late instar-larven, die het doelwit zijn in nood- en uitroeiingsprogramma's omdat ze morfologisch kunnen worden geïdentificeerd, inclusief suikerfloatatie, de nauwkeurigheid van de methode niet verhoogde. In feite verhoogde het toevoegen van de drijfmethode de verwerkingstijd met 90% voor papaja en met 48% voor mango. Verhoogde verwerkingstijd plus de extra materialen (d.w.z. water, bakken, suiker, enz.) ondersteunen het operationeel niet om deze stap toe te voegen bij het zoeken naar grote instars in het veld. De suikerdrijfmethode kan geschikt zijn wanneer het doel is om alle stadia te detecteren, met inbegrip van vroege instars, zoals in havens van binnenkomst en pakhuizen. Het filteren van de suikeroplossing met een fijnmazige zeef zou hoogstwaarschijnlijk de meest nauwkeurige detectie van eieren en vroege larven opleveren 11,12.
De MS- en MSF-technieken werken goed met fruit dat gemakkelijk kan worden gepureerd en een groot volume pulp heeft. Tefritidelarven hebben de neiging om zich in te graven in fruitpulp, wat visuele detectie moeilijk maakt. Een cruciaal aspect van de MS- en MSF-methoden is het scheiden van de larven van de pulp. Het zeefproces verwijdert de pulp, waardoor de larven op zeefschermen worden blootgesteld. Op dezelfde manier scheidt de suikerwatermethode de larven van de pulp door de larven te laten drijven, terwijl de pulp naar de bodem van de pan zinkt. Larven die door de MS- of MSF-methoden van de pulp worden gescheiden, worden gemakkelijk waargenomen terwijl ze op het zeefscherm of het wateroppervlak bewegen. Hoewel de mushing, zeven en optioneel drijvende methode de snelheid en nauwkeurigheid van het detecteren van tephritid-larven in belangrijke gastheervruchten aanzienlijk verbeterde, is het proces mogelijk niet geschikt voor alle vruchten. Gastheerfruit met harde pulp, zoals groene avocado's of fruit met een groot zaad / pit en een relatief kleine hoeveelheid pulp, zoals tropische amandelen, kan bijvoorbeeld gemakkelijker te verwerken zijn door met de hand te snijden en visuele inspectie.
We ontdekten dat de MS- en MSF-methoden sneller waren wanneer een relatief klein aantal vruchten (5-10) werd verwerkt. Het verschil zou waarschijnlijk groter zijn als grotere hoeveelheden fruit werden verwerkt, wat nodig en typerend kan zijn voor noodfruitvliegprogramma's. Het verwijderen van de drijfstap verhoogde de detectiesnelheid verder zonder afbreuk te doen aan de nauwkeurigheid van het vinden van grote tefritide larven (>3 mm). We toonden aan dat deze technieken naar het veld konden worden gebracht, wat de omstandigheden simuleerde die werknemers ervoeren tijdens een noodfruitvliegprogramma. Onze studies geven aan dat de MS-methoden een snellere detectie van late instarlarven en daaropvolgende uitroeiing van tefritide broedpopulaties mogelijk kunnen maken. Artsen zonder Grenzen zou kunnen worden gebruikt om eieren en vroege innames op te sporen die momenteel niet het doelwit zijn van uitroeiingsprogramma's.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
We willen Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegria en Alejandra Canon bedanken voor hun hulp bij het verwerken van de guave aan de Universiteit van Florida, Rick Kurashima, Jean Auth en Bruce Inafuku voor hulp bij het evalueren van het kunstmatig besmette fruit in Hawaï, en Michael Stulberg voor nuttige opmerkingen over eerdere versies van het manuscript. Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door USDA APHIS en University of Florida Cooperative Agreement en gedeeltelijk ondersteund door USDA-ARS (project 2040-22430-027-00D). De bevindingen en conclusies in deze voorlopige publicatie zijn niet formeel verspreid door USDA en mogen niet worden opgevat als een bepaling of beleid van een agentschap. De vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door de USDA. De USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti foamer | MicroLubrol | ML200-50-4 | MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com |
| Brown Sugar | Dominos | 1 lb Box Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar | |
| Cutting Boards | KitchenAid | KE703NOSMGA | KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12x18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards &pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg =KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP&qid=1673911 429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1 |
| Dish Pans | Sterilite | 06578012 | White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords= white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home -garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1 |
| EthOH | Fisher Scientific | BP8202500 | Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500 |
| Glass Vials | Fisher Scientific | 0333921H | Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H |
| Knives | Zyliss | 31380 | 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s= home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1 |
| No. 20 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4221 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 45 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4226 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 8 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4215 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| Soft Forceps | DR Instruments | DRENTF01 | DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q |
| Zipper Lock Storage Bags | Ziploc | 682254 | Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords= ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602& |
References
- White, I. M., Elson-Harris, M. M. Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).
- Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
- Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
- Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
- Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
- Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
- Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , FE988 (2016).
- Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
- Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
- Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
- Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
- Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
- Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
- CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , Ottawa, Canada. (2020).
- Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
- SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).
