Summary
Att öka upptäckten av omogna tephritidfruktflugor i fältet kan utlösa snabba ansträngningar för att eliminera populationer av dessa destruktiva skadedjur. Att upptäcka sena instarlarver är snabbare och mer exakt när man mosar värdfrukt i en påse och passerar massan genom en serie siktar än handskärning och visuell inspektion.
Abstract
Fruktflugor av familjen Tephritidae är bland de mest destruktiva och invasiva jordbruksskadegörarna i världen. Många länder genomför dyra utrotningsprogram för att eliminera begynnande populationer. Under utrotningsprogram görs en samlad insats för att upptäcka larver, eftersom detta starkt indikerar en häckande population och hjälper till att fastställa den rumsliga omfattningen av angreppet. Upptäckten av omogna livsstadier utlöser ytterligare kontroll- och regleringsåtgärder för att begränsa och förhindra ytterligare spridning av skadegöraren. Traditionellt uppnås larvdetektering genom att skära enskilda värdfrukter och undersöka dem visuellt. Denna metod är arbetsintensiv, eftersom endast ett begränsat antal frukter kan bearbetas, och sannolikheten för att sakna en larva är hög. En extraktionsteknik som kombinerar i) mushing värdfrukt i en plastpåse, ii) silning av massa genom en serie siktar, iii) placering av kvarhållen massa i en brunsockervattenlösning och iv) insamling av larver som flyter till ytan testades. Metoden utvärderades i Florida med fältinsamlad guava naturligt infekterad av Anastrepha suspensa. För att efterlikna låga populationer som är mer representativa för ett utrotningsprogram för fruktflugor infekterades mango och papaya på Hawaii med ett känt, lågt antal Bactrocera dorsalis larver. Metodens användbarhet testades i fält på guava som är naturligt infekterad av B. dorsalis för att utvärdera metoden under förhållanden som upplevs av arbetare under ett akut fruktflugeprogram. I både fält- och laboratorieförsök var mushing och siktning av massan effektivare (krävde mindre tid) och känsligare (fler larver hittades) än att skära frukt. Flytande massan i brunt sockervattenlösning hjälpte till att upptäcka tidigare instar larver. Mushing och siktning av fruktmassa av viktiga tephritidvärdar kan öka sannolikheten för att upptäcka larver under nödprogram.
Introduction
Tephritid-fruktflugor är bland de mest destruktiva jordbruksskadegörarna, med släktena Anastrepha, Bactrocera och Ceratitis som utgör den största risken1. Många områden löper hög risk för etablering av exotiska bananflugor, baserat på 1) historiska intrång och tillhörande avgränsnings- och utrotningsprogram, 2) den höga ankomsten av fruktflugvärdmaterial vid införselhamnar och 3) klimatförhållanden som är gynnsamma för etablering av reproducerande populationer. Delstaten Kalifornien upplever flera intrång och upptäckter av tephritider årligen2. Det har förekommit mer än 200 intrång och utrotningsprogram mot tephritider globalt under det senaste århundradet, och detta har accelererat avsevärt under de senaste decennierna3. Även om de allra flesta av dessa program är framgångsrika i att utrota den invaderande bananflugan3,4, är den ekonomiska och miljömässiga bördan av dessa invasioner fortfarande hög, och möjligheten till etablering är alltid närvarande; ett nyligen katastrofalt exempel är infektionen av Bactrocera dorsalis på den afrikanska kontinenten5.
Under akuta fruktflugeprogram görs en samlad insats för att upptäcka och kontrollera häckande populationer av de invaderande arterna. Till exempel svarar delstaten Florida på tephritid-intrång genom att applicera jorddränkar (under dropplinjen av fruktbärande värdväxter) och ta bort värdfrukt i en radie av 200 m runt platser där parade honor och / eller larver finns6. Dessa åtgärder och taktik tjänar till att döda larver och puppor i jorden och ta bort ägg och larver från frukt inom området. I vissa utrotningsprogram avlägsnas en betydande mängd värdfrukt. År 2015 förstördes över 100 000 kg frukt under utrotningsprogrammet B. dorsalis i Florida6. De ekonomiska förlusterna för odlare och tillhörande industrier enbart i karantänområdet uppskattades till över 10,7 miljoner dollar7.
För att hitta tephritidlarver i karantänområdena samlar ett litet team av entomologer värdfrukter i en radie på 200 m runt ett kvinnligt flugdetekteringsområde och skär och visuellt inspekterar varje frukt för larver6. Med begränsade personalresurser och hundratals möjliga värdar blir uppgiften svår, särskilt i de områden där växtmångfalden i både kommersiella produktionsområden och bostadsgårdar är hög. Dessutom kan larver saknas vid skärning av värdfrukter. I en studie som utvärderade fruktskärning vid införselhamnarna visade sig skärning av frukt inte vara lika effektiv för att upptäcka A. suspensa jämfört med att hålla de angripna frukterna i flera veckor och räkna larverna och pupporna som finns i valpsubstratet8.
Det finns alternativ till fruktskärning för att upptäcka ett angrepp 9,10,11,12,13. Till exempel är en flytning med brunt socker och en varmvattenmetod båda accepterade förfaranden som används för att upptäcka västerländska körsbärsfruktflugor i skördade körsbär 9,10. Brunt sockermetoden innebär att man placerar krossad frukt i sockervattenlösning och samlar larver som flyter till toppen. Flytmetoden för farinsocker utvecklades specifikt för att uppfylla lagstadgade regler för exporterade körsbär, som kräver att förpackningshus övervakar karantänskadegörare för fruktflugor. Det finns också ett godkänt US-Canada blåbärscertifieringsprogram som inkluderar brunt sockervattenflottning, saltvattenflottning eller kokning för att stödja fytosanitation14. När man testade noggrannheten hos socker och varmvattenflottning använde forskare siktningsmetoden för att bestämma hur många larver som saknas 9,10,11,12,13. En studie visade att blandning av krossade blåbär i en saltlösning och filtrering av lösningen genom ett återanvändbart kaffefilter var fyra gånger bättre för att upptäcka Drosophila suzukii-larver än att visuellt inspektera ytan av salt- och sockerlösningar14. Dessutom användes gaskromatografi för detektion av A. suspensa larver i citrus15. Dessa metoder har inte testats för tillämplighet i fältundersökningar.
Vårt mål var att utveckla och testa en metod för att hitta tephritidlarver i fält med hjälp av siktning och sockervattenflottning. Denna metod möjliggör effektivare upptäckt av omogna bananflugor än den traditionella fruktskärningsmetoden, vilket stöder snabb kontroll av avelspopulationer under utrotningsprogram för bananflugor.
Protocol
1. Val av frukt
- Bestäm vilken frukt som finns tillgänglig i det område som ska undersökas.
- Välj värdfrukt baserat på listan över kända värdar för måltephritid-arten.
- Välj mjuk kött, mogen frukt, som mango, papaya och guava. Omogen eller hård köttad frukt, såsom tropiska mandlar, bör inspekteras med en annan metod, såsom fruktskärning.
- Välj fallen, övermogen frukt eller mogen frukt på träd som har tecken på skador, ägglossningsärr och mjuka fläckar.
- Bearbeta cirka 2 liter frukt på en gång (t.ex. 5 guava eller 5 medelstora mango utgör lämpliga prover för denna metod). Antalet frukter som kan bearbetas på en gång beror på fruktens storlek (figur 1A).
2. Mushing
- Skär frukten i stora bitar och lägg den i en förvaringspåse med dragkedja på 4 L (figur 1B).
- Tillsätt vatten i påsen tills vattnet täcker den hackade frukten med 25-50 mm (figur 1C).
- Pressa frukten försiktigt för hand tills allt fruktkött har lossnat från skalet och har en jämn konsistens (dvs. inga stora bitar) (figur 1D).
3. Siktning för sen instar-samling
- Stapla siktarna. Använd stora siktar (457 mm diameter) för bearbetning av stora mängder frukt (~ 5 frukter samtidigt) och mindre siktar (305 mm diameter) för enskilda frukter eller mindre prover (< 5 frukter).
- Stapla sikten med en stor mask (nr 8; 2,36 mm) sikt ovanpå en sikt med små maskor (nr 20; 0,85 mm). För detektion av tidiga stjärnor, placera en tredje sikt (nr 45; 0,35 mm) på botten av stapeln (figur 1E).
- Häll massan i den övre sikten (figur 1F).
- Tvätta massan noggrant genom siktstapeln med vatten från en kran, slang eller flaska tills den fina massan har passerat genom siktarna (figur 1G).
- Skanna visuellt de övre siktarna efter sena instarlarver som kan ha behållits med skalet eller några stora fruktbitar (figur 1H).
- Kontrollera försiktigt den andra sikten för sena instar larver. Med stora mängder fin massa kan ytterligare sköljning vara nödvändig.
- Samla larver från siktarna med larvpincett och placera dem i flaskor med 70% EtOH.
4. Sockerflytning för tidig instar-insamling
- Förblanda sockerlösningen genom att lösa upp 453 g (1 låda) mörkt brunt socker i 2 liter kranvatten, vilket ger en Brix-avläsning på 19°10.
- Tvätta massan från de finmaskigare siktarna (t.ex. nr 20 och nr 45) till siktens kant med kranvatten och flytta sedan materialet till en plastpanna (11 L).
- Tillsätt farinsockerlösningen tills den täcker massan med 25-50 mm och tillsätt 2 droppar skumdämpare. Låt massan sitta i farinsockerlösningen i ca 5 min.
- Samla larver som flyter till ytan av lösningen med larvpincett i ampuller med 70% EtOH.
5. Larvens kurering
- Märk en injektionsflaska med uppsamlingsplats, datum, typ av frukt och uppsamlare för senare undersökning och identifiering.
Representative Results
Tidig och sen instar Anastrepha suspensa extraktion från fält samlade frukt
I detta experiment har vi jämfört fruktskärning och mushing, siktning och flytande (MSF) metoder med avseende på andelen larver som upptäckts och den genomsnittliga tiden som krävs för att upptäcka dem. Guava, mycket infekterad med larverna av Anastrepha suspensa, samlades in från en växt belägen vid University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Tropical Research and Education Center, Homestead, FL. Frukten sorterades slumpmässigt i grupper om 5 och tilldelades 1 av 2 larvextraktionsmetoder: 1) handskärning eller 2) MSF-metoden. Tiden för att samla alla larver synliga för blotta ögat med hjälp av varje extraktionsmetod registrerades.
Handskärningsmetoden följde den metod som för närvarande används i ett utrotningsprogram. Var och en av de 5 arbetarna (n = 5) tilldelades 5 frukter för att söka efter alla stadier av larver genom att skära frukterna i mindre bitar och visuellt inspektera massan. För att avgöra om larver missades i den visuella inspektionen inspekterades de handskurna fruktbitarna med hjälp av ett dissekeringsmikroskop (10x).
För Läkare Utan Gränsers metod skars 5 frukter i stora bitar (50-80 cm), placerades i blixtlåspåsar och pressades försiktigt för hand tills all massa lossnade från skalet och fruktköttet hade en jämn konsistens (dvs. inga stora bitar). Den mosade frukten silades genom en serie stora (45,7 cm) mässingssiktar. Det största nätet (nr 8) staplades på toppen, följt av ett nummer nr 20 och en sikt nr 45. Personalen som tilldelades denna behandling tvättade massan genom nätet med vatten från en slang ansluten till en diskbänk. De sena instarlarverna syntes i siktarna. De mindre instjärnorna blandades med massa, vilket gjorde dem svåra att se och ta bort. Därför lades massa/larvblandningen från siktarna i hinkar med 1 liter farinsockervattenlösning. Larverna flöt omedelbart till ytan. Lösningen omrördes försiktigt, och efter 5 minuter avlägsnades larver från hinkarna och räknades. Tiden att bearbeta frukten var en kombination av mushing, siktning och avlägsnande av larverna från sockervattenlösningen. Data för antalet larver som hittades genom handskärning eller siktning och flytningsmetoder analyserades med hjälp av Kruskal-Wallis icke-parametriska test (p = 0,05)16.
Läkare Utan Gränsers metod gav fler larver (Figur 2A) och fler larver per minut (Figur 2B) än handskärning. Även om detektion av de olika instjärnorna inte kvantifierades i denna studie, observerade vi att alla instars (första, andra och tredje) hittades med siktar, medan endast senare instars (andra och tredje) sågs med handskärning. När de tidigare skurna och visuellt inspekterade proverna inspekterades igen med ett dissekerande mikroskopskop missades 40% av de sena instarlarverna som infekterade frukterna. Tidigare stjärnor hittades dock främst med ominspektionen.
Detta experiment visade att användningen av Läkare Utan Gränsers metod är mer effektiv för att hitta larver i starkt angripna frukter. Frukt som är infekterad med ett lägre antal larver påträffas dock mer sannolikt i ett utrotningsprogram, där de invaderande arterna skulle vara mycket sällsynta. Därför genomförde vi en laboratoriestudie där värdfrukten var angripen av ett känt, lågt antal larver.
Manuell angrepp av mango och papaya för att simulera låg Bactrocera dorsalis angrepp
Detta experiment jämförde fruktskärning och Läkare Utan Gränsers metoder med avseende på andelen upptäckta larver och den tid som krävdes för att upptäcka dem när angreppet var relativt lågt. Manuell angrepp användes som ett experimentellt verktyg för att utvärdera effekten av varje metod, eftersom antalet närvarande larver var känt med säkerhet.
En korkborrare (1,0 cm diameter) användes för att göra 5 hål i enskilda mango- och papayafrukter som var fria från fruktfluglarver. En enda sen andra till tidig tredje instar B. dorsalis larva placerades i vart och ett av de 5 hålen i en delmängd av frukten. Hålen täcktes med hjälp av biten uttråkad från frukten och den återstående frukten täcktes utan att sätta in larven för att visuellt simulera manuell angrepp. Frukterna hölls vid 27 ° C i 48 timmar för att möjliggöra larvutveckling. Experimentet genomfördes vid ARS-laboratoriet i Hilo, Hawaii Island (n = 5 arbetare) och APHIS-PPQ-laboratoriet på Oahu Island, Hawaii (n = 4 arbetare).
För fruktskärning fick varje arbetare 5 mango (1 infekterad med 1 larv och 4 inte infekterad) och 4 papaya (en infekterad och 3 inte infekterad). En arbetare skar varje frukt individuellt i mindre och mindre bitar och inspekterade kontinuerligt massan för eventuella omogna fruktflugor. Sökningen avbröts när massan inspekterades noggrant. Det totala antalet larver som hittades och den tid som varje arbetare spenderade för att bearbeta alla frukter genom skärning registrerades (figur 3) och (figur 4).
Varje arbetare fick en annan liknande uppsättning frukter (5 mango och 4 papaya) för mushing eller siktning (utan fruktskärning involverad), med 2 bitar angripna som tidigare beskrivits. Massa hälldes i toppsikten och tvättades genom stapeln av siktar med vatten från en kran och larver avlägsnades, enligt beskrivningen i protokollet. Experimentet genomfördes två gånger, med sockerflottning och utan sockerflytning, för att bestämma om avlägsnande av flytsteget skulle öka processens hastighet utan att förlora känsligheten (dvs alla eller de flesta larver hittades) (figur 3). Antalet larver som hittades och den tid som varje arbetare spenderade för att bearbeta frukten genom skärning, MSF eller MS-metoden registrerades.
För både mango och papaya resulterade hela MSF-metoden (floatation inkluderad) i högre antal larvdetekteringar och var snabbare än fruktskärning (tabell 1). Arbetare som använde den traditionella fruktskärningsmetoden missade 32% och 35% av larverna placerade i mango respektive papaya (tabell 1). Att bearbeta frukt i bulk med Läkare Utan Gränsers teknik krävde 30 % mindre tid än att skära enskilda mango och 35 % mindre tid än att skära enskilda papaya (figur 3). Fler larver hittades per minut med Läkare Utan Gränsers metod för papaya (Figur 3C) och mango (Figur 3D) jämfört med fruktskärningsmetoden. Alla larver som hittades var levande.
Larvalmorfologisk identifiering är endast möjlig för sena stjärnor. Vi upprepade ovanstående experiment men utelämnade flytningsproceduren för att avgöra om återhämtningen av larver förblev hög och hastigheten på fruktbearbetningen ökade. MS-metoden (med floatation utelämnad) resulterade i fler larvdetektioner för papaya (figur 4A) och mango (figur 4B) jämfört med skärning och visuell inspektion. Dessutom var tekniken snabbare än att skära och visuellt inspektera papaya (figur 4C) och mango (figur 4D). Att ta bort flytsteget från Läkare Utan Gränsers metod minskade tiden för att hitta sena instarlarver med 90 % för papaya och med 48 % för mango (tabell 2). Andelen larver som hittades var hög för båda metoderna och var genomgående högre för MS (floatation utelämnad). För papaya återfanns 80 % och 85 % av larverna från MSF- respektive MS-metoderna (tabell 1 och tabell 2). För mango återfanns 88 % och 95 % från Läkare Utan Gränsers respektive MS-metoderna (tabell 1 och tabell 2).
Fältjämförelse av fruktskärning och Läkare Utan Gränsers metoder
Målet med detta experiment var att jämföra fruktskärning och Läkare Utan Gränsers metoder under fältförhållanden, vilket efterliknar ett akut fruktflugeprogram. Fruktbearbetning utfördes utan laboratoriets bekvämlighet och infrastruktur för att testa fältberedskapen för de två larvextraktionsmetoderna. Arbetet utfördes i en guavaodling belägen vid USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit Germplasm nära Hilo. Totalt 40 guavor som visade tecken på angrepp samlades in och delades in i 2 grupper. Totalt 20 guava utsattes för skärning/visuell inspektion följt av Läkare Utan Gränser (inklusive flytning), vilket möjliggjorde bedömning av skärmetodens känslighet jämfört med Läkare Utan Gränsers metod. Dissektionen fortsatte enligt beskrivningen ovan. När de upptäcktes avlägsnades larver och räknades. Fyra arbetare dissekerade 5 guavor vardera, och den tid som krävdes för skärning och inspektion registrerades för varje arbetare. Efterskärning av Läkare Utan Gränser genomfördes enligt ovan, förutom att en tredje sikt med mindre maskor (nr 40, 0,420 mm) användes utöver siktarna nr 8 och nr 20 för att samla in mindre larver. Den andra uppsättningen med 20 guava placerades i 2 zip-lock-påsar (10 frukter per påse) och utsattes endast för Läkare Utan Gränser (dvs. ingen skärning), vilket möjliggjorde en jämförelse av den tid som behövdes för fruktskärning jämfört med Läkare Utan Gränser. Som ovan användes tre siktar i denna procedur. Antalet larver som hittades och den totala tiden för att bearbeta frukt (mushing och hålla frukten i 5 minuter i påsen/siktning/flytande i sockerlösning) registrerades.
Som hittades i laboratoriet underskattade fruktskärning fruktangrepp och var mycket varierande och detekterade 25% -83% färre larver än vad som kunde återvinnas med MSF-metoder (tabell 3). I provet med lågt antal larver återfanns dessutom 500 % fler larver, vilket gav högre analyskänslighet och större chans att identifiera den angripande organismen. Frukt bearbetades mycket snabbare med Läkare Utan Gränsers metod jämfört med skärning; Att skära och inspektera 5 frukter krävde ungefär lika lång tid som att bearbeta 10 frukter via Läkare Utan Gränser.
Figur 1: Steg i extraktionsprotokollet för bananfluglarver . a) Bearbeta ungefär 2 volymprocent frukt på en gång (t.ex. utgör 5 guava eller 5 medelstora mango lämpliga prover för denna metod). (B) Skär frukten i stora bitar och lägg den i en 4 L förvaringspåse med dragkedja. (C) Tillsätt vatten i påsen tills vattnet täcker den hackade frukten med 25-50 mm. (D) Pressa frukten försiktigt för hand tills allt fruktkött har lossnat från skalet och har en jämn konsistens (dvs. inga stora bitar). E) Stapla sikten med den stora masksikten (nr 8; 2,36 mm) ovanpå, följd av den finmaskiga sikten (nr 20; 0,85 mm). För tidiga stjärnor, placera en tredje sikt (nr 45; 0,35 mm) på botten av stapeln. (F) Häll fruktköttet i den övre sikten. (G) Tvätta massan noggrant genom stapeln med siktar med vatten från en kran, slang eller en flaska tills den fina massan har passerat genom den första sikten. (H) Skanna visuellt de övre siktarna efter sena instarlarver som kan ha behållits med skalet eller några stora fruktbitar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tidig och sen instar Anastrepha suspensa extraktion från fält insamlade frukter. Det genomsnittliga antalet (± standardavvikelse för medelvärdet [SE]) av Anastrepha suspensa-larver från fem guavafrukter som samlats in genom skärning och visuell inspektion (skärning: 70,4 ± 11,9) eller tvättning av fruktköttet genom en serie av tre siktar följt av blötläggning av fruktköttet i en sockervattenlösning (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Det genomsnittliga antalet larver (±SE) som samlats in per minut från 5 guava som bearbetats genom skärning (1,21 ± 0,16) och av Läkare Utan Gränser (3,71 ± 0,50) (B). Varje metod replikerades 5 gånger, och asterisker ovanför staplarna indikerar signifikanta skillnader för antalet larver (χ 2 = 6,81, p < 0,01) och tiden att bearbeta (χ2 = 6,80, p < 0,01) baserat på ett Kruskal-Wallis-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Validering av hela mushing-siktning-floatationsmetoden med manuell angrepp av mango och papaya för att simulera lågt angrepp av Bactrocera dorsalis. Det genomsnittliga antalet Bactrocera dorsalis larver (±SE) som finns i papaya (skärning: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) och mango (skärning: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) frukter och det genomsnittliga antalet larver (±SE) som samlats in per minut från papaya (skärning: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) och mango (skärning: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Frukter som bearbetades med skärnings- eller MSF-metoderna (floatation ingår, n = 5) manuellt angripna med 5 tredje instarlarver. Asterisker ovanför staplarna indikerar signifikanta skillnader för antalet larver som finns i papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) och mango (χ2 = 3,94, p = 0,05) jämfört med fruktskärning baserat på Kruskal-Wallis-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Validering av mushing-siktningsmetoden (flytning borttagen) med manuell angrepp av mango och papaya för att simulera lågt angrepp av Bactrocera dorsalis. Det genomsnittliga antalet larver (±SE) som påträffats i papaya (skärning: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) och mango (skärning: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) frukter och det genomsnittliga antalet larver som samlats in per minut (±SE) i papaya (skärning: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) och mango (styckning: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Frukter infekterades manuellt med 5 tredje instar Bactrocera dorsalis larver och bearbetades genom skärning och visuell inspektion (skärning) eller mosades i en påse och tvättades genom siktar (endast mushing och siktning, utan flytning, n = 4). Asterisker ovanför staplarna indikerar signifikanta skillnader för antalet larver som finns i papaya (χ 2 = 5,46, p = 0,02) och mango (χ 2 = 5,25, p = 0,02) och tiden för att bearbeta papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) och mango (χ 2 = 5,39, p = 0,02) jämfört med fruktskärning, baserat på Kruskal-Wallis-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Frukt | # Bearbetad frukt | #Larvae tillagd | Bearbetningsmetod | #Larvae hittade | Behandlingstid (min)* | % återvinning |
| Mango | 25 | 25 | Stickling | 17 | 158 | 68% |
| Mango | 25 | 25 | MSF | 22 | 113 | 88% |
| Papaya | 16 | 20 | Stickling | 13 | 62 | 65% |
| Papaya | 16 | 20 | MSF | 16 | 40 | 80% |
| *Total tid summerad över 5 arbetare. | ||||||
Tabell 1: Antal larver som återvunnits och den tid det tar att bearbeta frukt genom skärning och visuell inspektion (skärning) eller fullständig mushing, siktning och flytande (MSF) -metoden. Testfrukten var manuellt infekterad med 5 tredje instar larver blandade med uttråkad och begränsad endast frukt (1 av de 5 mango, 1 av de 4 papaya).
| Frukt | # Bearbetad frukt | #Larvae tillagd | Bearbetningsmetod | #Larvae hittade | Behandlingstid (min)* | % återvinning |
| Mango | 20 | 20 | Stickling | 10 | 66 | 50% |
| Mango | 20 | 20 | MS | 19 | 44 | 95% |
| Papaya | 16 | 20 | Stickling | 5 | 38 | 25% |
| Papaya | 16 | 20 | MS | 17 | 25 | 85% |
| *Total tid summerad över 4 arbetare. | ||||||
Tabell 2: Antal larver som återhämtats och den tid det tar att bearbeta frukt genom skärning eller mushing och siktning, flytning utelämnad (MS). Testfrukterna var manuellt angripna med fem tredje instar larver blandade med uttråkad och täckt endast frukt (1 av 5 mango, 1 av 4 papaya).
| Arbetare/metod | #Fruit bearbetas | Tid att bearbeta (min) | #Larvae hittade skärning | #Larvae hittade Läkare Utan Gränser* | % av det totala antalet larver som hittats via skärning |
| Arbetare 1: skärning | 5 | 18 | 33 | 14 | 70% |
| Arbetare 2: skärning | 5 | 18 | 1 | 5 | 17% |
| Arbetare 3: skärning | 5 | 26 | 9 | 11** | 75% |
| Arbetare 4: skärning | 5 | 20 | 24 | ||
| Arbetare 5: Läkare Utan Gränser | 10 | 22 | NA | 22 | NA |
| Arbetare 6: Läkare Utan Gränser | 10 | 18 | NA | 37 | NA |
| * Massa från skärning och visuell inspektion bearbetas igen med MSF-metoden för att bestämma antalet sena 2:a-3:e instar larver missade | |||||
| ** Massa av arbetare 2 och 3 frukt som poolats före bearbetning med MSF-metoden | |||||
Tabell 3: Antalet larver som hittats i fältinsamlade guava genom skärning och visuell inspektion av frukten (skärning) eller genom mushing, siktning och flytande (MSF) frukten.
Discussion
Vårt mål var att utveckla ett effektivt sätt att hitta tephritidlarver i fält. Motivationen för att starta ett utrotningsprogram eller upprätta ett karantänområde är detektering av parade honor eller larver6, vilket indikerar en avelspopulation. Den nuvarande metoden att skära och visuellt söka frukt är ineffektiv för att hitta larver eftersom det vanligtvis finns många fler värdfrukter närvarande än vad som kan inspekteras individuellt. Dessutom är tephritidernas populationer sannolikt låga i ett område med ny invasion, vilket gör chansen att hitta larver i en stor mängd frukt oerhört svår. Till exempel, i 2015 Bactrocera dorsalis utrotningsprogram i Florida, identifierades 54 olika värdarter och mer än 4,000 frukter skars. I detta utrotningsprogram hittades endast ett fåtal larver i mango, och inga andra värdar befanns vara infekterade6. Vi fann att MSF / MS-metoden var både känsligare och snabbare för att upptäcka A. suspensa och B. dorsalis larver vid bearbetning av frukter som hade en stor mängd massa (mango, guava och papaya) i bulk jämfört med fruktskärning. Den större mängden värdfrukter som det är möjligt att inspektera med mushing- och siktningsmetoden, i kombination med ökningen av detektion av en sällsynt larva, kan öka sannolikheten för att en angrepp skulle hittas tidigt. Tidig upptäckt av en häckande population kan öka sannolikheten för utrotning och minska kostnaderna för programmet.
Våra experiment visade att antalet larver som upptäcktes av arbetare som skar och visuellt inspekterade frukter varierade avsevärt. Arbetare som skär frukt missade 50% och 75% av B. dorsalis larverna placerade i mango respektive papaya. Däremot missades endast 5% och 15% av larverna med MS-metoden för bearbetning av mango respektive papayafrukt. På liknande sätt visade en studie som utvärderade fruktskärning vid införselhamnar att det fanns betydande variationer i antalet angripna frukter och larver som inspektörerna hittade8. Studien visade att erfarna hamninspektörer missade 64–99 % av A. suspensa-larverna och 16–82 % av den angripna frukten när frukten skars ochinspekterades visuellt 8. Våra resultat tyder på att mushing- och siktningsmetoden kan minska sannolikheten för att en arbetare skulle missa att upptäcka en infekterad frukt.
Socker och varmvattenflottör är accepterade protokoll i en systemmetod för att säkerställa att körsbär och blåbär är fria från bananflugor14. En delmängd av en sändning krossas i lösningen, varefter en inspektör visuellt screenar sockerlösningens yta för förekomst av ägg och larver. Även om ett större antal frukter kan bearbetas jämfört med att skära enskilda frukter, påverkas sannolikheten för att hitta larver med hjälp av dessa tekniker fortfarande av inspektörens förmåga, scenen och antalet larver som finns och typen av frukt8. Vi fann att, liksom andra tephritider, B. dorsalis och A. suspensa lossnar från fruktmassan och flyter till ytan. Intressant nog fann vi att med större sena instarlarver, som är målet i nöd- och utrotningsprogram eftersom de kan identifieras morfologiskt, inklusive sockerflottning ökade inte metodens noggrannhet. Faktum är att tillsats av flytmetoden ökade bearbetningstiden med 90% för papaya och med 48% för mango. Ökad bearbetningstid plus ytterligare material (dvs. vatten, behållare, socker etc.) stöder inte operativt att lägga till detta steg när du söker efter stora stjärnor i fältet. Sockerflytningsmetoden kan vara lämplig när målet är att upptäcka alla stadier, inklusive tidiga instjärnor, till exempel vid införselhamnar och förpackningshus. Filtrering av sockerlösningen med en finmaskig sikt skulle sannolikt ge den mest exakta upptäckten av ägg och tidiga larvstjärnor11,12.
MS- och MSF-teknikerna fungerar bra med frukt som lätt kan dämpas och har en stor volym massa. Tephritid larver tenderar att gräva i fruktmassa, vilket gör visuell upptäckt svår. En kritisk aspekt av MS- och MSF-metoderna är att separera larverna från massan. Siktningsprocessen avlägsnar massan och exponerar därmed larverna på siktskärmar. På liknande sätt separerar sockervattenmetoden larverna från massan genom att få larverna att flyta, medan massan sjunker till botten av pannan. Larver separerade från massan med MS- eller MSF-metoder observeras lätt röra sig på siktskärmen eller vattenytan. Även om mushing, siktning och eventuellt flytande metod förbättrade hastigheten och noggrannheten för att detektera tephritidlarver i viktiga värdfrukter, kanske processen inte är lämplig för alla frukter. Till exempel kan värdfrukt med hård massa, såsom gröna avokado eller frukt med ett stort frö / grop och relativt liten mängd massa, såsom tropiska mandlar, vara lättare att bearbeta genom handskärning och visuell inspektion.
Vi fann att MS- och MSF-metoderna var snabbare när ett relativt litet antal frukter (5-10) bearbetades. Skillnaden skulle sannolikt vara större om större mängder frukt bearbetades, vilket kan vara nödvändigt och typiskt för akuta fruktflugeprogram. Att ta bort flytsteget ökade detekteringshastigheten ytterligare utan att kompromissa med noggrannheten att hitta stora tephritidlarver (>3 mm). Vi visade att dessa tekniker kunde tas till fältet, vilket simulerade de förhållanden som arbetarna upplevde under ett nödfruktflugeprogram. Våra studier tyder på att MS-metoderna kan möjliggöra en snabbare detektion av sena instarlarver och efterföljande utrotning av tephritid-häckande populationer. Läkare Utan Gränser skulle kunna användas för att upptäcka ägg och tidiga stjärnor som för närvarande inte är föremål för utrotningsprogram.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegria och Alejandra Canon för hjälp med att bearbeta guavaen vid University of Florida, Rick Kurashima, Jean Auth och Bruce Inafuku för hjälp med att utvärdera den artificiellt angripna frukten på Hawaii, och Michael Stulberg för hjälpsamma kommentarer om tidigare versioner av manuskriptet. Detta projekt finansierades delvis av USDA APHIS och University of Florida Cooperative Agreement och stöddes delvis av USDA-ARS (projekt 2040-22430-027-00D). Resultaten och slutsatserna i denna preliminära publikation har inte formellt spridits av USDA och bör inte tolkas som att de representerar någon myndighetsbestämning eller policy. Omnämnandet av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna publikation är enbart för att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande av USDA. USDA är en leverantör och arbetsgivare för lika möjligheter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti foamer | MicroLubrol | ML200-50-4 | MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com |
| Brown Sugar | Dominos | 1 lb Box Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar | |
| Cutting Boards | KitchenAid | KE703NOSMGA | KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12x18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards &pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg =KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP&qid=1673911 429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1 |
| Dish Pans | Sterilite | 06578012 | White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords= white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home -garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1 |
| EthOH | Fisher Scientific | BP8202500 | Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500 |
| Glass Vials | Fisher Scientific | 0333921H | Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H |
| Knives | Zyliss | 31380 | 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s= home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1 |
| No. 20 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4221 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 45 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4226 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| No. 8 Mesh sieves | Hogentogler & Co. Inc. | 4215 | U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| Soft Forceps | DR Instruments | DRENTF01 | DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q |
| Zipper Lock Storage Bags | Ziploc | 682254 | Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords= ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602& |
References
- White, I. M., Elson-Harris, M. M. Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).
- Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
- Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
- Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
- Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
- Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
- Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , FE988 (2016).
- Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
- Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
- Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
- Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
- Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
- Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
- CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , Ottawa, Canada. (2020).
- Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
- SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).
