Summary
تقدم هذه المقالة تلاعبا لعلاج الضغط المزمن لعقدة الجذر الظهرية في الفئران باستخدام علاج Tuina ، إلى جانب طريقة لتقييم فعاليتها بناء على سلوك الألم والنتائج النسيجية.
Abstract
ألم الأعصاب هو حالة سائدة تؤثر على 6.9٪ -10٪ من السكان وتنتج عن تلف الأعصاب بسبب مسببات مختلفة ، مثل فتق القرص القطني وتضيق القناة الشوكية وتضيق الثقبة الفقرية. على الرغم من أن Tuina ، وهو علاج يدوي صيني تقليدي ، أظهر تأثيرات مسكنة في الممارسة السريرية لعلاج آلام الأعصاب ، إلا أن آلياته البيولوجية العصبية الأساسية لا تزال غير واضحة. النماذج الحيوانية ضرورية لتوضيح المبادئ الأساسية لتوينا. في هذه الدراسة ، نقترح بروتوكول Tuina موحدا للفئران ذات ضغط العقدة الجذرية الظهرية (DRG) ، والذي يتضمن تحفيز ضغط DRG عن طريق إدخال قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ في الثقبة الفقرية ، وإجراء معالجة Tuina بمعلمات محددة للموقع والشدة والتردد في بيئة خاضعة للرقابة ، وتقييم النتائج السلوكية والنسيجية المرضية لعلاج Tuina. تناقش هذه المقالة أيضا الآثار السريرية المحتملة والقيود المفروضة على الدراسة وتقترح اتجاهات للبحث المستقبلي على Tuina.
Introduction
في البيئات السريرية ، من الشائع ملاحظة الألم المرضي العصبي الناجم عن ضغط جذر العصب لأسباب مختلفة. الشكل الأكثر شيوعا لهذا الألم العصبي هو فتق القرص القطني (LDH) ، والذي غالبا ما يكون مستمرا ومتكررا ويصعب علاجه. يتأثر ما يقرب من 9٪ من سكان العالم ب LDH ، مما يؤدي إلى أعباء اجتماعية واقتصادية كبيرة1. يتزايد حدوث هذا النوع من آلام الأعصاب سنويا ، مع اتجاه نحو المرضى الأصغر سنا ، بسبب التغيرات في الإنتاج البشري ونمط الحياة2. على الرغم من استخدام مسكنات الألم غير الستيرويدية ، لا يمكن تخفيف أعراض المرضى تماما. نتيجة لذلك ، اكتسبت العلاجات البديلة ، مثل Tuina ، لعلاج الألم الناجم عن LDH اهتماما متزايدا.
يوصى على نطاق واسع بالعلاج Tuina ، وهو شكل من أشكال العلاج المحافظ ل LDH ، في العديد من إرشادات الممارسة السريرية في جميع أنحاء العالم لمنع وعلاج آلام أسفل الظهر 3,4. أظهرت الأبحاث أن Tuina يمكن أن يقلل بشكل كبير من العوامل الالتهابية مثل مصل IL-6 ومستويات عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) في مرضى LDH مع تحسين آلام المرضى وضعف الوظيفة القطنية5. ومع ذلك ، فإن الآلية المحددة وراء تأثيرات علاج Tuina لتخفيف الألم لا تزال غير واضحة.
النماذج الحيوانية هي أداة قيمة لدراسة آلام الأعصاب الناجمة عن LDH6. أنها تسمح للقياسات السلوكية لتقييم فعالية العلاج Tuina وتقديم عينات من علم وظائف الأعضاء المرضية من LDH. على سبيل المثال ، يمكن أخذ عينات من العقد الجذرية الظهرية في الفخذ للتحقق من التغيرات في خلايا العقدة الجذرية الظهرية. يستخدم الضغط المزمن لنموذج عقدة الجذر الظهرية (CCD) بشكل شائع لتقييم الفسيولوجيا المرضية ل LDH ، لأنه يتسبب في تلف مورفولوجيا خلايا العقدة الجذرية الظهرية التي تتوافق مع التغيرات المرضية التي تظهر في الحالات السريرية لضغط الأعصاب الناجم عن فتق القرص7.
أجرى العديد من العلماء العديد من التجارب على على تسكين العلاج بالابر8،9،10. ومع ذلك ، عند تنفيذ عمليات العلاج بالابر على النماذج الحيوانية ، فإنها غالبا ما تقلد العلاج بالابر البشري. يتأثر التأثير العلاجي للعلاج بالابر بعوامل مثل الحجم والتردد واتجاه القوة المطبقة11،12،13. إذا كانت التجربة تفتقر إلى معيار موحد للعلاج بالابر ، مثل قوة العملية وتكرارها ومدتها ، فقد يتسبب ذلك في بعض الانحراف في النتائج التجريبية. تقدم هذه المقالة مجموعة من خطط العلاج بالابر بناء على خصائص فئران CCD ، وتشجع على تطوير عمليات العلاج بالابر الموحدة في النماذج الحيوانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ هذا العمل في مختبر الألم التابع لمعهد البيولوجيا العصبية في جامعة فودان. تمت الموافقة على التجارب والالتزام الصارم بالمبادئ التوجيهية لحماية المختبر التي وضعتها الجمعية الدولية لدراسة الألم (LASP) لجميع العمليات الجراحية والتعامل مع. تم استخدام فئران Sprague-Dawley (SD) من الدرجة النظيفة ، والتي تتكون من 32 ذكرا تتراوح أعمارهم بين 40-50 يوما ، بمتوسط وزن 220 ± 1.38 جم ، في الدراسة الحالية. تم الحصول على هذه الفئران من مركز التجارب التابع لأكاديمية شنغهاي لعلوم الحياة ، الأكاديمية الصينية للعلوم. تم الاعتناء بالحيوانات بشكل صحيح وإيوائها في غرفة مخصصة ذات تهوية مستقلة ودرجة حرارة منظمة (22 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة (40٪ -50٪). كان لدى الفئران إمكانية الوصول إلى ما يكفي من الطعام والماء في أقفاصها. اتبعت غرفة المختبر دورة 12 ساعة من الضوء والظلام للحفاظ على انتظام إيقاعات الساعة البيولوجية للفئران ، واستبدل الموظفون المعينون الحشو بانتظام. تم إجراء الأشعة السينية في قسم الأشعة في مستشفى Yueyang للطب الصيني التقليدي والغربي المتكامل ، التابع لجامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي.
1. المشاركون في الدراسة والتجميع
- قم بتعيين 32 فأرا لأربع مجموعات: ساذجة (تحكم) ، وهمية (عملية وهمية) ، CCD (ضغط العقدة الجذرية الظهرية المزمنة) ، و CCD + Tuina (8 فئران / مجموعة). كان للفئران حرية الوصول إلى الطعام والماء في مرافق.
ملاحظة: لم يكن لدى الفئران الساذجة أي تدخل ، بينما خضعت المجموعة الوهمية لنفس الإجراء الجراحي مثل فئران مجموعة CCD ، ولكن دون ترك قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل "L" في الثقبة الفقرية L4 و L5. خضعت الفئران في مجموعة CCD لجراحة نموذج ضغط العقدة الجذرية الظهرية المزمنة الكاملة. تلقت الفئران في مجموعة CCD + Tuina علاج tuina بدءا من اليوم الرابع بعد جراحة CCD.
2. إنشاء نموذج حيواني
- تطبيق الأيزوفلوران لتخدير الفئران. بمجرد أن تفقد الفئران وعيها (لا يوجد منعكس نفض الغبار عن الذيل أو منعكس ثني الساق) ، احلق الشعر في منطقة الجراحة باستخدام ماكينة حلاقة.
ملاحظة: تم تطبيق الأدوية المسكنة قبل 15 دقيقة من الجراحة وتم حقن الفئران تحت الجلد بالترامادول 20 مجم / كجم. - ثبت الجرذ على لوح رغوي (انظر جدول المواد) واستخدم الأربطة المطاطية لتأمين أطرافه وقواطعه. امسح المنطقة المحضرة بتحضير معقم من الكحول واليود بالتناوب لمدة لا تقل عن 3 دورات.
- أدخل المسبار على شكل حرف "L" (انظر جدول المواد).
- استخدم المقص لعمل شق 2-3 سم عبر الجلد واللفافة السطحية واللفافة العميقة طبقة تلو الأخرى. أولا ، حدد موقع العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي ، والذي يتوافق مع العمود الفقري القطني الخامس. ثم ، حدد بالتتابع العمليات الشائكة الثالثة والرابعة.
- قم بتثبيت العملية الشائكة بالملقط المسنن وارفعه للسماح للمقص بأن يكون قريبا من الجانب الأيمن من العملية الشائكة وقطع العضلات المرتبطة بالجانب الأيمن من العملية الشائكة.
- ثم ، تشريح بصراحة العضلات المرتبطة بالسطح الخارجي للوحة الفقرية حتى تكون هناك مقاومة للجانب الأيمن. النتوء هو المفصل الزيجابوفيزي. وبالمثل ، تشريح العضلات واللفافة بصراحة على المفصل zygapophysial.
ملاحظة: سيتم لمس العملية المستعرضة التي تشير إلى اتجاه رأس الجرذ أولا في الجزء الأمامي الخارجي السفلي من المفصل zygapophysial. أسفل العملية المستعرضة توجد الثقبة الفقرية ، المليئة بجذور الأعصاب والأنسجة الرخوة المحيطة بها وليس من السهل العثور عليها عادة. - أولا ، استخدم مسبارا على شكل حرف "L" لتحديد موضع الثقبة الفقرية ، ثم استخدم قضيبا من الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل "L" (يجب أن يكون قطره 0.4 مم وطوله 4 مم) لإدخاله في الثقبة الفقرية.
- إذا تم ضغط العقدة الجذرية الظهرية بنجاح ، فسيظهر الجرذ نقرة الذيل ومنعكس ثني الساق. أدخل قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ في الثقبة الفقرية القطنية الرابعة والخامسة. ثم ، خياطة (3-0 ، انظر جدول المواد) العضلات واللفافة والجلد طبقة تلو الأخرى.
- ضع الجرذ في صندوق ثرموستاتي حتى يستيقظ. بعد الاستيقاظ ، لاحظ ما إذا كانت وظيفة الطرف الخلفي الأيمن للفأر طبيعية. إذا كان هناك سحب ، فهذا يعني أن العملية قد أصابت الأعصاب الحركية ، ويجب التخلص من الفئران. إذا كانت وظيفة الطرف الخلفي الأيمن طبيعية ، يمكن استخدام الفئران ووضعها في قفص للتغذية.
3. علاج توينا
- إنشاء بيئة مريحة: قبل البدء في علاج Tuina ، تأقلم الفئران في المقيد لمدة 30 دقيقة للسماح لها بالتكيف (الشكل 1). يمكن لهذا الجهاز كشف فخذ الجرذ بالكامل وشل حركته ، مما يسهل مناورات Tuina (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يجب الحفاظ على درجة الحرارة في غرفة العلاج بين 22-26 درجة مئوية ، ويجب أن تكون الرطوبة بين 40٪ -50٪. - توحيد Tuina: تأكد من أن المعالجين يرتدون أكمام أصابع لاسلكية يمكنها مراقبة ضغط وتواتر Tuina وتوفير بيانات التغذية الراجعة في الوقت الفعلي. أولا ، تدرب على Tuina مع بيانات التغذية المرتدة لأكمام الأصابع ، واضبط القوة على 5 N والتردد إلى 2 هرتز. بعد ذلك ، قم بإجراء نفس المناورات على الفئران ، مع الحفاظ على قوة وتردد ثابتين طوال الإجراء (الشكل 2).
ملاحظة: بناء على عملنا السابق ، فإن قوة الضغط المثلى المحسوبة هي 5 N (انظر قسم المناقشة للحصول على التفاصيل). - تحديد نقطة الإبر: حدد عضلة الساق في الطرف الخلفي الأيمن كمنطقة توينا للفأر ، عند تقاطع رأسي عضلة الساق ، تقريبا في موقع BL5714.
- أداء Tuina: تأكد من أن المعالج يواجه الجانب الخلفي من فخذ الجرذ ويحمل الطرف الخلفي الأيمن للفأر مع طرفه العلوي الأيمن. ضع الإبهام عموديا على نقطة الوخز BL57 ، وتأكد من أن الساعد والأصابع يمارسان القوة لأداء حركة دورانية إيقاعية صغيرة المدى أثناء تطبيق ضغط 5 N (الشكل 3).
- أثناء العلاج ، تأكد من أن قوة ردود الفعل المعالجة وتكرارها تتوافق مع القيم المحددة مسبقا. ابدأ التدخل من اليوم الرابع بعد الجراحة ، مع إجراء Tuina مرة واحدة يوميا لمدة 15 دقيقة ، بشكل مستمر لمدة 18 يوما.
4. الاختبار السلوكي للألم
ملاحظة: تم إجراء الاختبارات السلوكية قبل النمذجة ، وبعد النمذجة ، في يوم التدخل 1 ، ويوم التدخل 3 ، ويوم التدخل 7 ، ويوم التدخل 14 ، ويوم التدخل 17 ، ويوم التدخل 21.
- قم بإجراء عتبة استجابة التحفيز الميكانيكي (عتبة سحب Paw ، PWT) باتباع الخطوات أدناه (الشكل 4).
- استخدم طريقة فون فراي لاختبار عتبة الاستجابة للتحفيز الميكانيكي في أقدام الفئران. ضع الفئران في حجرة زجاجية شفافة بقياس 20 سم × 10 سم × 20 سم ، والتي تم وضعها على حامل شبكة سلكية معدنية بفتحات 10 مم × 10 مم على ارتفاع 40 سم. حافظ على درجة حرارة الغرفة عند 23 ± 2 درجة مئوية ، والبيئة المحيطة هادئة.
- قم بقياس عتبة السحب الميكانيكية باستخدام ألياف Von Frey الإلكترونية (انظر جدول المواد). تحفيز مركز قدم الجرذ حتى يتحرك بشكل ملحوظ ، مثل رفع الساق أو تجنبها. تسجل الماكينة قيمة الضغط القصوى (N) تلقائيا.
- انتظر لمدة 15 ثانية أو أكثر قبل تحفيز نفس الجرذ مرة أخرى. حافظ على كل تحفيز أقل من 5 ثوان لمنع التحسس اللمسي في مخالب الفئران. كرر الاختبار خمس مرات حتى تختلف القياسات الثلاثة المتتالية بأقل من 10 نيوتن.
- أداء كمون سحب مخلب (PWL) استجابة للتحفيز الحراري (الشكل 5).
- قم بتقييم PWL باستخدام طريقة Hargreaves15,16. ضع الفئران في غرفة صغيرة مصنوعة من الزجاج المقسى الشفاف ، بقياس 20 سم × 10 سم × 20 سم ، مع غطاء زجاجي شفاف مع فتحة تهوية. سخني المنطقة المركزية للغطاء الزجاجي إلى 45 درجة مئوية باستخدام لوحة تسخين حتى تصل إلى درجة حرارة ثابتة.
- خلال مرحلة الاختبار السلوكي ، تأقلم الفئران مع المختبر السلوكي لمدة 2 ساعة على الأقل كل يوم لتقليل تأثير العوامل البيئية على نتائج الاختبار.
- قبل الاختبار الرسمي ، ضع الفئران في المختبر السلوكي لمدة 30 دقيقة للسماح لها بالتكيف مع البيئة وتقليل التداخل.
- سخني لوح التسخين إلى 45 درجة مئوية ، وضع الأطراف الخلفية للفأر على لوح التسخين.
- تم تعريف كمون سحب المخلب (PWL) على أنه الوقت من بداية التسخين إلى ظهور منعكس سحب المخلب استجابة للتحفيز الحراري. في كل اختبار ، اختبر نفس الطرف الخلفي ثلاث مرات متتالية ، ومتوسط القيمة للحصول على زمن استجابة هذا الطرف الخلفي. بعد الاختبار ، أعد الفئران إلى أقفاصها للتغذية.
5. التروية
- التحضير: تحضير محلول ملحي 0.9 ٪ ومحلول بارافورمالدهيد 4 ٪ مقدما. ضع المحلول الملحي في فرن مضبوط على درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية ، وقم بتخزين محلول بارافورمالدهيد في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.
- أداء التخدير وإنشاء الوصول.
- ابدأ بحقن 25٪ يوريتان (0.6 مل / 100 جم ، انظر جدول المواد) في تجويف بطن الفئران للحث على التخدير العميق. انتظر حتى لا يلاحظ أي إصبع قدم أو قرنية أو منعكس تحول. إصلاح الفئران على لوحة رغوة.
- قطع عظم الصدر بالمقص وفتح الجلد واللفافة طبقة تلو الأخرى. قطع الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع على كلا الجانبين لفضح القلب بالكامل. افصل بعناية التامور. افصل الرئتين عن القلب.
- استخدم الملقط لسحب الشريان الأورطي وكشفه عن طريق سحب القلب نحو نفسه. قم بمحاذاة الإبرة والبطين الأيسر والشريان الأورطي في خط مستقيم وعلى نفس المستوى الأفقي. ثم أدخل الإبرة من البطين الأيسر في الشريان الأورطي حتى تصبح الإبرة مرئية داخل الشريان الأورطي.
- استخدم ملقط لتثبيت الشريان الأورطي والإبرة داخل الشريان الأورطي ، ثم اقطع الأذين الأيسر بالمقص. في هذا الوقت ، سوف تندفع كمية كبيرة من الدم من الأذين الأيسر. افتح صمام المحلول الملحي وقم بتوصيل الحقن الملحي بمحلول ملحي غزير 37 درجة مئوية ، ليصبح المجموع حوالي 150-200 مل.
- بعد اكتمال التروية الملحية ، قم بالتبديل إلى محلول بارافورمالدهيد 4٪ وقم بتعطيره بمحلول بارافورمالدهايد 4٪ ليصبح المجموع حوالي 400 مل عند 4 درجات مئوية. عند بدء نضح بارافورمالدهايد ، أمسك الأسنان الأمامية للفأر بزوج واحد من الملقط واسحبها للأمام ، مع إمساك الذيل بيد واحدة وسحبه للخلف ، وهو أمر مفيد لتمديد العمود الفقري بالكامل وزيادة الثقبة الفقرية لتسهيل أخذ عينات DRG.
- أثناء التروية ، يتحول كبد الفئران والمساريق والثرب الأكبر تدريجيا إلى لون باهت حتى يصبح الكبد متصلبا. بعد ذلك ، قم بإبطاء معدل التدفق وتعديله إلى حوالي 2 قطرات في الثانية حتى يتم ترشيح كل بارافورمالدهيد.
6. جمع العقدة الجذرية الظهرية
ملاحظة: بعد التروية ، قم بقطع الجزء القطني من العمود الفقري للفئران بسرعة. حدد موقع الثقبة الفقرية L5 و L4 عن طريق توصيل أعلى نقاط القمة الحرقفية على كلا الجانبين بعملية L5 القطنية الشوكية باستخدام طريقة تحديد المواقع هذه ، وإزالة العقدة الجذرية الظهرية من الثقبة الفقرية. طريقة التجميع المحددة هي كما يلي:
- من مدخل القناة الشوكية (القناة الشوكية الصدرية) ، أدخل المقص في القناة الشوكية وقطع الصفيحة على كلا الجانبين حتى يمكن إزالة جميع الصفيحات بالكامل ، مما يعرض القناة الشوكية بأكملها.
ملاحظة: احرص على عدم إتلاف الحبل الشوكي وجذور الأعصاب خارج القناة الشوكية عند قطع الصفيحة. - قم بإزالة الحبل الشوكي والرباط الطولي الخلفي بعناية. افصل الأم الجافية المتصلة بالثقب الداخلي للثقبة الفقرية.
- استخدم ملقط العيون لتثبيت وسحب عقدة الجذر الظهرية ، والتي تتشكل مثل اللؤلؤ وصفراء قليلا.
ملاحظة: نظرا لهشاشة الأنسجة العصبية وضعف صلابتها ، من الضروري فهم القوة وسحب الاتجاه عند سحب عقدة الجذر الظهرية وعدم استخدام القوة الغاشمة. - عند سحب عقدة الجذر الظهرية ، تأكد من تنظيف الأنسجة الرخوة المحيطة ، بما في ذلك الأم الجافية والعنكبوتية ، مقدما لتسهيل السحب السلس لعقدة الجذر الظهري.
- ضع عقدة الجذر الظهري على ورق ماص ، واقطع المحور بشفرة ، ونظف الأوعية الدموية على سطح عقدة الجذر الظهري.
- بعد التشذيب ، قم بوزن عقدة الجذر الظهري واغمرها في محلول بارافورمالدهايد 4٪ بتركيز 4٪ ودرجة حرارة 4 درجات مئوية لفترة كافية ، عادة حوالي 2-4 ساعات ، ثم انقل عقدة الجذر الظهري إلى 10٪ و 20٪ و 30٪ محلول سكروز PB (4 درجات مئوية) محضر مسبقا للجفاف التدريجي.
7. التقسيم بالتبريد
- ابدأ بوضع عقدة الجذر الظهرية في محلول 0.01 M PBS. رجيها لمدة 10 دقائق ثم اغسلي محلول السكروز. تقليم بعناية الألياف المحورية لكلا الجزأين من العقد الجذر الظهري. قم بتنظيف رأس التجميد لآلة القطع بالتبريد وأضف مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) إليه (انظر جدول المواد).
- ضع رأس التجميد على سطح غلاف معدني يحتوي على نيتروجين سائل ، وانتظر حتى يتم تجميد الأنسجة ، وقم بإزالته ، وقم بقصه بشكل مسطح. بعد ذلك ، ضع رأس التجميد على قاعدة القطاعة. يجب أن يكون سمك شرائح العقد الجذرية الظهرية 15 مم. رتبي المقاطع الرفيعة المقطعة في صندوق خشبي بالترتيب واحفظيها في ثلاجة على حرارة -20 درجة مئوية، بعيدا عن الضوء.
8. تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوسين
- ضع الأقسام لمدة 2 دقيقة في الزيلين ، وقم بتجفيفها في سلسلة من الكحوليات ، بما في ذلك 100٪ و 95٪ و 80٪ و 70٪ لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم ضع الأقسام 2 دقيقة في الماء المقطر ، 1 دقيقة في الهيماتوكسيلين ، قم بإجراء 5 دقائق من شطف ماء الصنبور ، وقم بإجراء التمايز في محلول كحول ملحي 1٪ لمدة 30 ثانية ، تليها 30 ثانية في كربونات الليثيوم المشبعة.
- بعد ذلك ، ضع الشرائح لمدة 2 دقيقة في الماء المقطر وماء الصنبور ، و 5 دقائق في محلول eosin (0.5٪) ، وشطف سريع لمدة 1 دقيقة في الماء المقطر ، وجولتين مدة كل منهما 2 دقيقة في 95٪ و 100٪ كحول ، و 30 ثانية في 100٪ زيلين مع إضافة بيكربونات الصوديوم ، وثلاث جولات مدة كل منها 3 دقائق في الزيلين ، وأخيرا ، ختم مع بلسم محايد (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن أن يساعد علاج Tuina في تقليل عتبات التحفيز الميكانيكي والحراري للفئران الناتجة عن نمذجة CCD
بعد 17 يوما من العلاج ب Tuina ، لوحظ اختلاف كبير في عتبات PWT بين فئران CCD التي تتلقى علاج Tuina ومجموعة CCD غير المعالجة (P = 0.021 ، <0.05) (الشكل 6 والجدول 1).
أظهرت الفئران في مجموعة CCD التي تتلقى علاج Tuina تحسنا في عتبة الألم من بداية العلاج ، وتم العثور على فرق كبير في عتبة الألم الحراري بين مجموعة CCD والمجموعة التي تتلقى علاج Tuina من اليوم 14 بعد النمذجة (P = 0.0047 ، 0.0056 ، 0.0049 ، < 0.01) (الشكل 7 والجدول 2).
لم يؤد تطبيق علاج Tuina إلى تحسين نخر الخلايا الناجم عن نموذج CCD
بناء على تلطيخ HE للعقد الجذرية الظهرية ، فإن مجموعة CCD من الفئران ، التي تعرضت للضغط المادي بقضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل "L" ، قد تكبدت تلفا في غشاء الخلية وموت الخلايا المبرمج (الشكل 8). في المقابل ، كان للمجموعة الضابطة من الفئران حواف محددة بدقة ، وملامح عصبية سليمة ، وأجسام خلوية كاملة (الشكل 9). في مجموعة CCD + Tuina ، كانت بعض ملامح الخلايا العصبية في العقد الجذرية الظهرية للفئران غير مكتملة (الشكل 10).
الشكل 1: القيد للفئران. إنه جهاز محلي الصنع تم تصنيعه من قبل جامعة Tongji ، والذي يمكنه شل حركة الفئران بشكل فعال وكشف أطرافها الخلفية بالكامل. يتحكم المسمار الفضي في الحاجز الذي يحمل ذيل الجرذ ويقيد الفأر. يقوم المسمار الأسود بضبط الجهاز على طول الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ارتداء أكمام إصبع قياس قوة اللمس اللاسلكية. يوفر الجهاز الذي يقيس ويعرض قوة وتواتر ضغط الإصبع ردود فعل في الوقت الفعلي حول الشدة والتردد أثناء معالجة Tuina. (أ) أجهزة استشعار الضغط ومعدات الإرسال. (ب) قياسات ضغط الإصبع. (ج) القوة المقاسة أثناء التلاعب بتوينا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: موضع الجسم وموقع نقطة الوخز للفئران توينا. يمكن لتقييد الفئران فضح موقف BL57 تماما. تمسك الأطراف ، جنبا إلى جنب مع الإبهام ، بالأطراف السفلية للفأر لتثبيتها في مكانها حتى يتمكن الجرذ من التعاون بهدوء أثناء العلاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. اختبار عتبة الانسحاب مخلب. هذا اختبار لقياس سلوك الألم في الفئران. إنه ينطوي على تحفيز أقدامهم ميكانيكيا وقياس زمن انتقال انسحاب المخلب. (أ) يوضح الجهاز، و(ب) يوضح كيف تم التلاعب به على الفأر أثناء التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اختبار كمون انسحاب Paw. يقيس هذا الإعداد عتبة ألم الفئران من خلال حساسيتها للحرارة الناتجة عن ضوء كشاف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نتائج اختبار عتبة الانسحاب Paw. يتم تمثيل القياسات باستخدام متوسط الخطأ المعياري زائد أو ناقص (
). نتائج اختبار عتبة منعكس انسحاب الأطراف الخلفية الناجم عن التحفيز الميكانيكي في مراحل مختلفة لكل مجموعة من الفئران. لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية (P < 0.05) بين مجموعات نماذج CCD + Tuina و CCD من اليوم 17 فصاعدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: نتائج اختبار كمون انسحاب المخلب. يتم تمثيل القياسات باستخدام متوسط الخطأ المعياري زائد أو ناقص (). نتائج اختبار عتبة منعكس انسحاب الساق الناجم عن التحفيز الحراري في مراحل مختلفة من الفئران في كل مجموعة. لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعة CCD + Tuina ومجموعة نماذج CCD بدءا من اليوم السابع (P < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الملاحظة المجهرية للخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية في مجموعة CCD (القسم الطولي). تم الحصول على هذه الصورة عن طريق مسح العينة الملطخة ب HE-من عقدة الجذر الظهري. يشير القطع الناقص الأحمر في الشكل إلى أن بعض الخلايا العصبية تمر بالنخر. يشير هذا إلى أن نموذج CCD قد تسبب في تلف الخلايا العصبية في عقدة الجذر الظهري. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9. الملاحظة المجهرية للخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية في المجموعة الساذجة (المقطع الطولي والمقطع العرضي). كما هو موضح في الشكل أعلاه ، (أ) مقطع طولي ، و (ب) مقطع عرضي. لا توجد ظاهرة شغور مجموعة CCD في المنطقة التي يتم فيها جمع المجموعة الفارغة من العقد الجذرية الظهرية للفئران. الخلايا العصبية مستمرة ومضغوطة ، ويتم ملء أجسام الخلايا. تقع الخلايا الدبقية الساتلية بين الخلايا العصبية. شريط المقياس: (أ) ، 50 ميكرومتر ؛ (ب) ، 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10: الملاحظة المجهرية للخلايا العصبية للعقدة الجذرية الظهرية في مجموعة CCD + Tuina (المقطع العرضي). الخلايا العصبية مستمرة ، وهناك ظاهرة انحلال الخلايا. يشير هذا إلى أنه على المدى القصير ، لم يتمكن العلاج بالتدليك من تحسين نخر الخلايا (القطع الناقص الأحمر) الناجم عن نموذج CCD. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 11: اختبار ضغط توينا. تختلف الفئران ذات الحد الأدنى من قيم ضغط منعكس الهسهسة والهروب في الحجم ، وتتراوح من 5 نيوتن إلى 25 نيوتن. يمثل الإحداثي درجة الضغط ، بينما يمثل الإحداثي عدد الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: صور الأشعة السينية لفئران CCD. التحقق من تصنيع CCD باستخدام التصوير بالأشعة السينية لنماذج الفئران. (أ) يوضح الأشعة السينية المأخوذة في المستوى الرأسي، و(ب) يوضح الأشعة السينية المأخوذة في المستوى السهمي. تسمح الأشعة السينية المقطعية المختلفة برؤية أوضح لموضع قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل حرف "L". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| N | قبل النمذجة | د1 | د3 | د7 | د14 | د17 | د٢١ | |
| ساذج | 8 | 18.1±1.4 | 16.8+1.5 | 16.8±1.5 | 18.6±1.7 | 16.8±1.5 | 15.6±1.8 | 16.8±1.5 |
| الشام | 8 | 18.0±1.7 | 18.6±1.7 | 16.0±1.3 | 17.6±1.7 | 16.8±1.5 | 18.9±1.7 | 16.8±1.5 |
| اتفاقيه مكافحه التصحر | 8 | 17.7±1.1 | 10.7±2.8# | 10.0±1.5 | 4.4±2.2 | 3.8±1.7 | 4.1±2.4 | 3.8±2.5 |
| اتفاقية مكافحة التصحر + توينا | 8 | 18.9±1.7 | 9.8±2.3# | 8.3±1.4 | 4.8±1.2 | 5.8±2.0 | 7.2±1.8* | 7.5±1.8* |
| #مقارنة قبل ونمذجة D1 ، ص < 0.05. | ||||||||
| * مقارنة بين مجموعة CCD ومجموعة CCD + Tuina ، ص < 0.05. | ||||||||
الجدول 1: عتبة سحب Paw ، PWT (، s). مقارنة قبل ونمذجة D1 ، # p < 0.05. مقارنة بين مجموعة CCD ومجموعة CCD + Tuina ، * p < 0.05.
| N | قبل النمذجة | د1 | د3 | د7 | د14 | د17 | د٢١ | |
| ساذج | 8 | 11.9±1.2 | 12.0±1.6 | 12.2±1.9 | 12.4±1.1 | 12.2±1.9 | 12.0±1.4 | 12.0±1.4 |
| الشام | 8 | 11.9±1.2 | 11.6±1.5 | 12.2±1.9 | 11.6±1.5 | 12.2±0.9 | 11.6±1.5 | 11.6±1.5 |
| اتفاقيه مكافحه التصحر | 8 | 10.8±1.1 | 8.9±0.7# | 7.9±0.8 | 7.7±0.5 | 7.8±1.0 | 7.7±0.8 | 7.7±0.8 |
| اتفاقية مكافحة التصحر + توينا | 8 | 11.3±1.5 | 9.1±0.6# | 8.0±0.7 | 8.3±0.7* | 8.9±0.6* | 9.1±0.7* | 9.2±0.9* |
| #مقارنة قبل ونمذجة D1 ، ص < 0.05. | ||||||||
| مقارنة بين مجموعة CCD ومجموعة CCD + Tuina ، * p < 0.05. | ||||||||
الجدول 2: كمون سحب مخلب ، PWL (، ق). مقارنة قبل ونمذجة D1 ، # p < 0.05. مقارنة بين مجموعة CCD ومجموعة CCD + Tuina ، * p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أجرت مجموعتنا البحثية دراسات ذات صلة حول معايير التلاعب Tuina في مرحلة مبكرة. أولا ، من المهم ضبط شدة القوة للتلاعب Tuina. في Tuina السريرية ، يقوم الممارسون بضبط شدة القوة وفقا لتجربتهم ومشاعر المرضى الذاتية ، وتحقيق أفضل تأثير Tuina من خلال التواصل. ومع ذلك ، هذا غير ممكن في التجارب على. في التجارب على ، يتم استخدام "عتبة الاستجابة" لتحديد شدة التلاعب Tuina. يحكم هؤلاء على ما إذا كانت قوة Tuina المطبقة مناسبة بناء على الاستجابة الغريزية للحيوان. استخدم راندال17 هذه الطريقة لدراسة سلوك الألم في نماذج التهاب الفئران. الفرق هو أن راندال عملت في منطقة الالتهاب المحلية ، بينما عملت هذه التجربة في منطقة غير مصابة. التلاعب الثقيل Tuina سيجعل الفئران تنتج ردود الفعل الصراخ والهروب. يحدد تحديد شدة القوة الثقيلة هذه أن شدة قوة توينا الرسمية أقل من شدة القوة الثقيلة هذه. استنادا إلى توزيع قيم الضغط القصوى لمنعكس الصراخ والهروب ل 150 فأرا بين 5-25 نيوتن ، بمتوسط وانحراف معياري 9.93 و 3.018 (الشكل 11) ، قام عملنا السابق بحساب قيمة قوة الضغط المثلى لتكون 5 نيوتن. ثانيا ، تم وصف تردد التشغيل لطريقة Tuina في علم Tuina على أنه 120-160 مرة / دقيقة18. لذلك ، تم ضبط تردد Tuina في هذه التجربة على 2 هرتز.
نموذج CCD هو نموذج جراحي يمكن أن يكون مؤلما ، لأنه يتطلب التعرض للعملية المفصلية والثقبة الفقرية. لذلك ، تحتاج الفئران إلى 1-3 أيام للتعافي بعد الجراحة. وفقا لكل من الأدبيات والبيانات التجريبية الأولية ، يميل سلوك الألم لدى الفئران إلى الاستقرار في اليوم الرابع بعد الجراحة. هذا يوفر وقتا مناسبا لمراقبة التأثير المسكن لتدخل Tuina. ومع ذلك ، قد لا تكون Tuina المطولة مفيدة للتأثير المسكن للفئران ويمكن أن تؤدي إلى تلف الأنسجة. قارنت هذه الدراسة التأثيرات المسكنة للتوينا والعجن لمدة 5 و 15 و 30 دقيقة ، واختارت في النهاية 15 دقيقة كمدة مثالية للتدخل.
هذه الطريقة لها قيود ، حيث تم استخدام جزء فقط من العمليات السريرية لاختيار التلاعب وأجزاء الجسم. يقع BL57 (Chengshan) في سورة ثلاثية الرؤوس للفئران ، وهو معصب بواسطة العقد الجذرية الظهرية ل L4 و L519. نظرا لأن عضلات العضلة ثلاثية الرؤوس سميكة ومناسبة ل Tuina ، فإن تدليك هذه المنطقة يمكن أن يكون له تأثير مباشر على العقد الجذرية الظهرية ل L4 و L5 في الفقرات القطنية للفئران التي تستخدم لأخذ العينات التجريبية.
أثناء عملية التشكيل ، يحتاج المرء إلى ضمان الإدخال الدقيق لقضيب الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل "L" في الثقبة الفقرية L4 و L5 في نموذج الألم CCD عن طريق إجراء التحقق بالأشعة السينية. قبل أخذ الأشعة السينية ، قمنا بإعطاء تخدير داخل الصفاق لمدة 25٪ (0.6 مل / 100 جم) لتخدير الفئران. أكدت الأشعة السينية الإدخال الناجح لقضيب الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل "L" في الثقبة الفقرية L4 و L5 (الشكل 12).
بشكل عام ، ركزت هذه الدراسة على مراقبة عمليات علاج Tuina وتقييم الآثار العلاجية ل Tuina على الفئران CCD. أجرى الفريق تجربة على لاستكشاف كيفية تعيين معلمات Tuina ، واختيار الأجزاء المناسبة ، وتحديد أوقات العلاج المناسبة. يوفر هذا عرضا توضيحيا موحدا وقابلا للتكرار لتدخل النموذج الحيواني للبحوث المستقبلية حول التأثير المسكن لتوينا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع بناء التخصصات السريرية الحرجة في شنغهاي (رقم المنحة: Shslczdzk04001) ؛ برنامج الإبحار التابع للجنة شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة: 22YF1444300) ؛ مشاريع ضمن ميزانيةجامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (رقم المنحة: 2021LK091).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter) | hand-made | / | For CCD models making |
| ALMEMO admeasuring apparatus | ahlborn | 2450-1 | Mechanical Withdrawal Threshold test |
| Constant temperature slicer CM-1900 | Leica | 1491950C1US | For specimen production |
| Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle | LIRCON/Shandong Lilkang | / | For disinfection |
| Disposable sterile syringe 5 mL | Shanghai Misha Wa Medical Industry | / | For injection |
| Electron microscope CX-31 | Olympus, Japan | BJ002318 | For specimen observation |
| Finger pressure recordings | Suzhou Changxian Optoelectronic Technology | CX1003w | For Tuina manipulation |
| Foam board (35 cm x 20 cm) | hand-made | / | It is our homemade apparatus for fixing rats |
| MERSILK W2512 | Johnson & Johnson | / | For tissue suture |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent | 10004160 | For specimen production |
| paraformaldehyde | China National Chemical Reagent | / | For specimen production |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | For anesthesia of rat |
| Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats | IITC Life Science | / | Paw Withdrawal Latency |
| Precision electronic scale for experiment JY3002 | Shanghai Precision Scientific Instrument | / | Weighing of rat |
| Rat hair clipper | Philips | HP6341/00 | Shaving of rat fur |
| Restrainer for rats | Tongji University (self-made) | / | It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs. |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | For specimen production |
| Uratan | China National Chemical Reagent | / | For anesthesia of rat |
| X-ray detector XR-600 | Dongguan Kaso Electronic Technology | / | Examination of CCD models |
| xylene | Shanghai Sinopharm Group | 100092 | For specimen production |
References
- Vos, T., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Amin, R. M., Andrade, N. S., Neuman, B. J.
- Stochkendahl, M. J., et al. National Clinical Guidelines for non-surgical treatment of patients with recent onset low back pain or lumbar radiculopathy. European Spine Journal. 27 (1), 60-75 (2018).
- Bostelmann, R., Steiger, H. J. Comment on "An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy". The Spine Journal. 14 (9), 2273 (2014).
- Tang, J., et al. Effect of bone-setting massage combined with acupuncture and moxibustion on simple lumbar disc herniation and its effect on pain and sensory disorder of lower limbs. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 38 (10), 244-247 (2020).
- Lin, X. -Y., Yang, J., Li, H. -M., Hu, S. -J., Xing, J. -L. Dorsal root ganglion compression as an animal model of sciatica and low back pain. Neuroscience Bulletin. 28 (5), 618-630 (2012).
- Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 36 (5), 1305-1312 (2018).
- Zhao, X. -y, et al. Effect of Tuina on the expression of TNF-α,IL-6,TGF-β1 and CTGF in the degenerative tissue of rabbits′lumbar intervertebral disc. Journal of Chengdu Medical College. 14 (6), 741-745 (2019).
- Zhang, L., Li, Z. -y, Yu, Z. -y, Yue, X. -y, Fu, R. -y Effect of GABA and GABAAR in analgesic loop of CCI rats by pressing manipulation based on "Taking Tenderness as Acupoints" theory. Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. 28 (3), 50-53 (2014).
- Long, B. -cal, et al. Analgesic effect of massage on rats with neuropathic pain and its mechanism. Guangxi Medical Journal. 44 (17), 2003-2009 (2022).
- Al-Bedah, A., Ali, G., Aboushanab, T., Qureshi, N. Tui Na (or Tuina) massage: A minireview of pertinent literature, 1970-2017. Journal of Complementary and Alternative Medical Research. 3, 1-14 (2017).
- Au, D. W. H., et al. Effects of acupressure on anxiety: a systematic review and meta-analysis. Acupuncture in Medicine: Journal of the British Medical Acupuncture Society. 33 (5), 353-359 (2015).
- Hsiung, W. -T., Chang, Y. -C., Yeh, M. -L., Chang, Y. -H. Acupressure improves the postoperative comfort of gastric cancer patients: A randomised controlled trial. Complementary Therapies in Medicine. 23 (3), 339-346 (2015).
- Wu, S., et al. Neural interconnection between acupoint "Chéngshān (BL57)" and sciatic nerve in the rat. World Journal of Acupuncture - Moxibustion. 31 (2), 129-135 (2021).
- Banik, R. K., Kabadi, R. A. A modified Hargreaves method for assessing threshold temperatures for heat nociception. Journal of neuroscience methods. 219 (1), 41-51 (2013).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of Thermal pain sensation in rats and mice using the hargreaves test. Bio-protocol. 7 (16), e2506 (2017).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales De Pharmacodynamie Et De Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
- Yan, J. -t Science of Tuina. , Traditional Chinese Medicine Publishing House. (2003).
- Himes, B. T., Tessler, A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. The Journal of Comparative Neurology. 284 (2), 215-230 (1989).
