Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

अशुद्ध पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65572
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

Summary

पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएएवी) का व्यापक रूप से नैदानिक और प्रीक्लिनिकल जीन वितरण के लिए उपयोग किया जाता है। आरएएवी के लिए एक कम सराहना वाला उपयोग शुद्धिकरण की आवश्यकता के बिना सुसंस्कृत कोशिकाओं का मजबूत पारगमन है। आरएएवी के लिए नए शोधकर्ताओं के लिए, हम ट्रांसजीन कैसेट क्लोनिंग, क्रूड वेक्टर उत्पादन और सेल कल्चर ट्रांसडक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

पुनः संयोजक एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर (आरएएवी) ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में एकीकरण के बिना शक्तिशाली और टिकाऊ ट्रांसजेन अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं, जिससे उन्हें पशु मॉडल और नैदानिक सेटिंग्स में जीन वितरण के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बना दिया जाता है। चिकित्सीय अनुप्रयोगों के अलावा, आरएएवी सुसंस्कृत कोशिकाओं में शोधकर्ता की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और वैज्ञानिक लक्ष्यों के अनुरूप ट्रांसजेन देने के लिए एक उपयोगी प्रयोगशाला उपकरण हैं। कुछ उदाहरणों में बहिर्जात रिपोर्टर जीन, ओवरएक्प्रेशन कैसेट, आरएनए हस्तक्षेप और सीआरआईएसपीआर-आधारित उपकरण शामिल हैं, जिनमें जीनोम-वाइड स्क्रीन शामिल हैं। आरएएवी ट्रांसडक्शन इलेक्ट्रोपोरेशन या रासायनिक अभिकर्मक की तुलना में कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक होते हैं और उत्पादन के लिए किसी विशेष उपकरण या महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है। कच्चे लाइसेट या आरएएवी युक्त वातानुकूलित मीडिया को कई सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने के लिए आगे शुद्धिकरण के बिना सीधे सुसंस्कृत कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है- आरएएवी की एक कम सराहना की गई विशेषता। यहां, हम बुनियादी ट्रांसजेन कैसेट क्लोनिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए क्रूड आरएएवी तैयारी का उत्पादन और लागू कैसे किया जाए। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम तीन सेल प्रकारों के पारगमन का प्रदर्शन करते हैं जो अभी तक आरएएवी अनुप्रयोगों में रिपोर्ट नहीं किए गए हैं: प्लेसेंटल कोशिकाएं, मायोब्लास्ट्स और छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स। हम कच्चे आरएएवी तैयारी के लिए उपयुक्त उपयोग, जीन वितरण के लिए आरएएवी की सीमाओं और कैप्सिड पसंद के लिए विचारों पर चर्चा करते हैं। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए श्रमसाध्य अनुमापन और शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता के बिना आरएएवी का उपयोग करके सेल संस्कृति में उत्पादक डीएनए वितरण प्राप्त करने के लिए एक सरल, कम लागत वाली और प्रभावी विधि को रेखांकित करता है।

Introduction

सेलुलर कार्यों के आणविक आधारों को स्पष्ट करने के लिए अक्सर सेल संस्कृति में ट्रांसजेनिक डीएनए की अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। व्यक्त होने के लिए, ट्रांसजेन को एक कोशिका की चयनात्मक झिल्ली के माध्यम से प्रवेश करना चाहिए और नाभिक 1,2 तक पहुंचना चाहिए। इसलिए, सेल की भौतिक बाधाओं को प्रभावी ढंग से बायपास करने और इसकी केंद्रीय प्रक्रियाओं में हेरफेर करने की क्षमता नई जैविक घटनाओं को उजागर करने के लिए ट्रांसजेनेसिस को लागू करने के लिए एक आवश्यकता है। एक दृष्टिकोण विदेशी डीएनए 3,4 को वितरित करने और व्यक्त करने के लिए वायरस की आंतरिक क्षमता को भुनाता है।

एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) सबसे छोटे स्तनधारी वायरस में से एक है: इसके 4.7 किलोबेस (केबी), एकल-फंसे हुए डीएनए जीनोम में दो जीन होते हैं, प्रतिनिधि (प्रतिकृति के लिए) और कैप (कैप्सिड के लिए), 25 एनएम मापने वाले 60-मेर इकोसाहेड्रल कैप्सिड के अंदर पैक किया जाता है। कैप जीन में कई प्रमोटर, रीडिंग फ्रेम और स्प्लिस उत्पाद होते हैं जो वायरल प्रतिकृति, उत्पादन और पैकेजिंग 5,6 के लिए आवश्यक कम से कम नौ अद्वितीय प्रोटीन को एन्कोड करते हैं। इसके अतिरिक्त, जीनोम के दोनों सिरों में द्वितीयक संरचनाएं होती हैं जिन्हें इनवर्टेड टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) कहा जाता है जो डीएनए प्रतिकृति, जीनोम पैकेजिंग और ट्रांसडक्शन 7,8,9,10 के दौरान डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग के लिए आवश्यक हैं। आईटीआर एकमात्र डीएनए तत्व हैं जो कैप्सिड में जीनोम की पैकेजिंग के लिए आवश्यक हैं, और इसलिए एएवी को वायरल प्रतिनिधि / कैप जीन को नियामक तत्वों और /या रुचि के जीन की पसंद के साथ बदलकर ट्रांसजेन वितरण उद्देश्यों के लिए क्लोन किया जा सकता है। परिणामी पुनः संयोजक एएवी (आरएएवी), एक इंजीनियर वेक्टर जीनोम (वीजी) के साथ, व्यापक रूप से मानव जीन थेरेपी के लिए क्लिनिक में उपयोग किया जाता है और11 सफलताएं हासिल की हैं। वेक्टर का एक कम सराहनीय उपयोग प्रयोगशाला में है; आरएएवी एक शोधकर्ता कीप्रयोगात्मक जरूरतों को पूरा करने के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को कुशलतापूर्वक प्राप्त कर सकते हैं।

आरएएवी के उत्पादन के लिए सबसे आम तरीका एचईके 293 या 293 टी कोशिकाओं में ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक द्वारा है (चित्रा 1)। पहला प्लास्मिड, जिसे आमतौर पर सीआईएस प्लास्मिड कहा जाता है, में आईटीआर (पीएएवी) के साथ वांछित ट्रांसजीन होता है। आवेदन के आधार पर, सामान्य तत्वों के साथ सीआईएस प्लास्मिड, जैसे कि मजबूत प्रमोटर या सीआरआईएसपीआर-आधारित उपकरण, खरीद के लिए उपलब्ध हैं। कैप प्लास्मिड जिसमें वाइल्ड-टाइप एएवी प्रतिनिधि और कैप जीन शामिल होते हैं जो इन-ट्रांस में प्रदान किए जाते हैं - यानी, एक अलग, गैर-आईटीआर युक्त प्लास्मिड पर जो नियामक और संरचनात्मक तत्वों को व्यक्त करता है जो तब सीआईएस प्लास्मिड के साथ बातचीत करते हैं - और इस प्रकार इसे ट्रांस प्लास्मिड कहा जाता है। वीजी को शारीरिक रूप से संलग्न करने के अलावा, कैप्सिड सेलुलर ट्रोपिज्म12,13 को प्रभावित करता है। सीरोटाइप-विशिष्ट कैप जीन इन-ट्रांस प्रदान करके, शोधकर्ता आसानी से अपने दिए गए लक्ष्य सेल के लिए एक अनुकूलित कैप्सिड सीरोटाइप चुनकर पारगमन दक्षता को अधिकतम करने में सक्षम हैं। अंत में, एक डिपेंडोपार्वोवायरस के रूप में, एएवी को अपने वायरल प्रमोटरों से प्रतिनिधि / कैप अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए एक सहायक वायरस की आवश्यकता होती है, जो एडेनोवायरल हेल्पर जीन द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो तीसरे प्लास्मिड जैसे कि पीएडीएक्सएफ 614,15 पर प्रदान किया जाता है। ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक के 72 घंटे के बाद, वेक्टर को निर्माता कोशिकाओं से संस्कृति मीडिया में बार-बार फ्रीज / पिघलने चक्र द्वारा जारी किया जा सकता है। पूरी प्लेट सामग्री तब एकत्र की जाती है, और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बड़े सेलुलर मलबे को हटा दिया जाता है; परिणामी मीडिया सुपरनैटेंट डाउनस्ट्रीम ट्रांसडक्शन के लिए तैयार एक क्रूड आरएएवी तैयारी है।

Figure 1
चित्रा 1: कच्चे आरएएवी वेक्टर उत्पादन का अवलोकन। क्रूड आरएएवी उत्पादन और पारगमन 5 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आरएएवी अन्य अभिकर्मक विधियों की तुलना में ट्रांसजेन डिलीवरी के लिए अधिक अनुकूल हो सकता है, जो आमतौर पर सेलुलर विषाक्तता, कम दक्षता और महंगे अभिकर्मकों और उपकरणों से जुड़े होते हैं, जैसे कि इलेक्ट्रोपोरेशन या रासायनिक / लिपिड-आधारित अभिकर्मक16,17। आरएएवी इन बाधाओं को दरकिनार करता है और अक्सर न्यूनतम विषाक्तता और न्यूनतम हाथों से समय के साथ शक्तिशाली ट्रांसजेन अभिव्यक्ति प्रदान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, आरएएवी का उत्पादन करना और इसे सेल संस्कृति में लागू करना सरल है और शायद ही कभी संस्कृति मीडिया (चित्रा 1) से वेक्टर के शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, आरएएवी लेंटिवायरल ट्रांसजेन डिलीवरी के विपरीत, मेजबान जीनोम में अपने वीजी को एकीकृत नहीं करता है, और इस प्रकार सम्मिलन म्यूटेनेसिस18 के जोखिम को कम करता है। ट्रांसजीन डिलीवरी के लिए आरएएवी का उपयोग करने के संभावित लाभों के बावजूद, सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, आईटीआर सहित ट्रांसजेन का आकार कैप्सिड की भौतिक बाधाओं के कारण 4.9 केबी से अधिक नहीं होना चाहिए, जिससे बड़े नियामक तत्वों और ट्रांसजेन को प्रभावी ढंग से वितरित करने की शोधकर्ता की क्षमता सीमित हो जाती है। इसके अलावा, चूंकि आरएएवी एक गैर-एकीकृत वायरस है, इसलिए पारगमन के परिणामस्वरूप कोशिकाओं को विभाजित करने में क्षणिक ट्रांसजेन अभिव्यक्ति होती है और स्थिर अभिव्यक्ति के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकती है। हालांकि, दोहरे आरएएवी-वितरित कैस 9 और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) टेम्प्लेट का उपयोग करने वाले तरीकों का उपयोग विशिष्ट जीनोमिक लोकी पर अनुक्रमों को स्थिर रूप से सम्मिलित करने के लिए किया जा सकता है यदि कोई शोधकर्ता19 चाहता है।

Protocol

1. प्लास्मिड अधिग्रहण

नोट: यह प्रोटोकॉल साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर और एसवी 40 पॉली-एडेनाइलेशन अनुक्रम (पीएएवी.सीएमवी.ल्यूक.आईआरईएस.ईजीएफपी.एसवी 40) के साथ आईटीआर युक्त प्लास्मिड में एक जीन ऑफ इंटरेस्ट (जीओआई) को क्लोन करेगा। हालांकि, इस प्लास्मिड का उपयोग आरएएवी का उत्पादन करने के लिए आगे क्लोनिंग के बिना किया जा सकता है, एक सुविधाजनक दोहरी ईजीएफपी और ल्यूसिफेरस रिपोर्टर की पैकेजिंग की जा सकती है। विभिन्न नियामक तत्वों के साथ प्लास्मिड या विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए, जैसे कि सीआरआईएसपीआर-आधारित प्रयोगों के लिए, ऑनलाइन उपलब्ध हैं और नीचे दिए गए समान क्लोनिंग चरणों का पालन करेंगे (अतिरिक्त क्लोनिंग चरणों के लिए चर्चा देखें)। इसके अतिरिक्त, विभिन्न सीरोटाइप के लिए प्रतिनिधि / कैप, या ट्रांस, प्लास्मिड का उपयोग किया जा सकता है- यह प्रोटोकॉल एएवी सीरोटाइप 2 के लिए प्रतिनिधि / कैप का उपयोग करेगा।

  1. एक आईटीआर युक्त सीआईएस प्लास्मिड, एक एडेनोवायरस हेल्पर प्लास्मिड, एक रेप / कैप प्लास्मिड और एक जीओआई युक्त प्लास्मिड युक्त बैक्टीरियल स्टैब खरीदें। प्रत्येक प्लास्मिड के प्रतिरोध के लिए विशिष्ट एंटीबायोटिकदवाओं वाले अलग-अलग आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया को लकीर करें। बैक्टीरिया को बढ़ने के लिए रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि भारत सरकार के साथ एक प्लास्मिड खरीद के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है, तो सिंथेटिक डीएनए टुकड़ा ( सामग्री तालिका देखें) ऑनलाइन खरीदा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यदि वांछित हो तो पूरी पीसीआर प्रक्रिया को छोड़ने के लिए एक सिंथेटिक डीएनए टुकड़े का उपयोग किया जा सकता है।
  2. प्रत्येक प्लेट से एक कॉलोनी चुनें और 3 एमएल लूरिया बर्टानी (एलबी) बफर में विकसित करें, जो रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर संबंधित एंटीबायोटिक के साथ पूरक है, 180 आरपीएम पर हिलाता है। बैक्टीरिया के 1 एमएल को एक बाँझ 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 50 एमएल एलबी बफर होता है जो संबंधित एंटीबायोटिक के साथ पूरक होता है। रात भर 30 डिग्री सेल्सियस, 180 आरपीएम पर हिलाएं।
  3. बैक्टीरिया को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3,000 x ग्राम, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एंडोटॉक्सिन-लो या -फ्री मिडीप्रेप किट का उपयोग करके प्लास्मिड को अलग करें।
    नोट: आईटीआर अस्थिर संरचनाएं हैं। आईटीआर विलोपन या उत्परिवर्तन को रोकने के लिए, सेलुलर विभाजन को धीमा करने और प्रतिकृति में त्रुटियों को कम करने के लिए बैक्टीरिया कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाना चाहिए। प्लास्मिड उपज और शुद्धता बढ़ाने के लिए, एक मिडीप्रेप या मैक्सिप्रेप किट आदर्श है। कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम एंडोटॉक्सिन संदूषण को कम करने के लिए एंडोटॉक्सिन-कम या -मुक्त किट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। एक लामिनर प्रवाह हुड के अंदर प्लास्मिड अलगाव करना आवश्यक नहीं है, क्योंकि यदि एक मानक बेंच पर प्रदर्शन किया जाता है तो प्लास्मिड तैयारी के संदूषण की संभावना नहीं होती है।

2. एएवी आईटीआर युक्त प्लास्मिड में रुचि के क्लोनिंग जीन

  1. डीएनए देखने वाले सॉफ्टवेयर में जीओआई युक्त प्लास्मिड मानचित्र खोलें।
    नोट: आईटीआर सहित पूर्ण कैसेट, कैप्सिड की भौतिक पैकेजिंग सीमाओं के कारण 4.9 केबी से अधिक नहीं होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, द्वितीयक संरचनाओं के कारण आईटीआर के माध्यम से पीसीआर प्रवर्धन प्राप्त नहीं किया जा सकता है। जैसे, आरएएवी ट्रांसजीन क्लोनिंग के लिए गिब्सन असेंबली की सिफारिश नहीं की जाती है।
    1. प्लास्मिड के पूर्ण अनुक्रम को प्रकट करने के लिए अनुक्रम टैब पर क्लिक करें। जीओआई अनुक्रम के 5 'सबसे अधिक क्षेत्र तक स्क्रॉल करें और आगे प्राइमर बनाने के लिए जीन बॉडी की ओर अंदर की ओर खींचते हुए पहले न्यूक्लियोटाइड पर क्लिक करें। ~ 55 डिग्री सेल्सियस के पिघलने के तापमान (टीएम) तक पहुंचने के बाद छोड़ दें।
    2. फॉरवर्ड प्राइमर पर क्लिक करें. प्राइमर अनुक्रम के 5' सबसे अंत में इकोआरआई प्रतिबंध साइट (5'GAATTC 3') के लिए अनुक्रम को मैन्युअल रूप से शामिल करें। इसके अतिरिक्त, एंजाइम को डीएनए के साथ कुशलतापूर्वक बातचीत करने की अनुमति देने के लिए इस प्रतिबंध साइट के 5 'अंत में छह अतिरिक्त यादृच्छिक आधार जोड़ें। प्राइमर जोड़ें पर क्लिक करें. एक प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्र 2 देखें।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए प्राइमर की जांच करें कि यह हेयरपिन या प्राइमर डिमर नहीं बना सकता है (प्रतिबंध साइट को छोड़कर जो पैलिंड्रोमिक है)। यदि हेयरपिन बनते हैं, तो छह अतिरिक्त आधारों के यादृच्छिक अनुक्रम को बदलें। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि प्राइमर प्लास्मिड पर कहीं और नहीं बंधता है।
    4. जीन शरीर के अंदर जीओआई के 3 'सबसे अधिक क्षेत्र में रिवर्स प्राइमर बनाने के चरणों को दोहराएं। रिवर्स प्राइमर पर क्लिक करें और एक नोटी प्रतिबंध साइट (5 'जीसीजीजीसीसीजीसी 3') शामिल करें।
      नोट: भारत सरकार में ईकोआरआई या नोटी प्रतिबंध साइटें शामिल नहीं हो सकती हैं - यदि हां, तो विभिन्न प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करने की आवश्यकता होगी।
  2. 50 μL पीसीआर प्रतिक्रिया में जीओआई को बढ़ाएं। तालिका 1 से आवश्यक व्यक्तिगत घटकों का उपयोग करें।
    1. एक थर्मोसाइकलर में प्रतिक्रिया रखें और प्रोग्रामिंग के लिए तालिका 2 से चक्र मापदंडों का पालन करें। यदि प्राइमरों में अलग-अलग टी एम हैं, तो प्रोग्राम के लिए निचले टीएम का उपयोग करें।
    2. पीसीआर प्रतिक्रिया के 5 μL में जेल लोडिंग डाई (6x) के 1 μL जोड़कर सही पीसीआर टुकड़े के प्रवर्धन की पुष्टि करें। एथिडियम ब्रोमाइड युक्त 0.8% एगरोज जेल पर एक डीएनए सीढ़ी और पीसीआर मिश्रण चलाएं और यूवी प्रकाश के साथ कल्पना करें।
      सावधानी: एथिडियम ब्रोमाइड एक ज्ञात उत्परिवर्तन है।
    3. यदि जेल पर एक एकल, विशिष्ट बैंड दिखाई देता है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम-आधारित पीसीआर क्लीनअप किट का उपयोग करके पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब में शेष पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें। यदि कई बैंड दिखाई देते हैं (गैर-विशिष्ट प्रवर्धन के कारण), वांछित बैंड को उत्पाद ति करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
  3. शुद्ध पीसीआर उत्पाद और pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 बैकबोन प्लास्मिड को 50 μL प्रतिक्रिया में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए तालिका 3 से आवश्यक व्यक्तिगत घटकों के साथ पचाएं। जेल निष्कर्षण के बाद अपेक्षित अक्षम वसूली के कारण पीएएवी प्लास्मिड डीएनए की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है।
    नोट: उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइम उच्च निष्ठा (एचएफ) संस्करण हैं। नियमित नोटआई का उपयोग कटस्मार्ट बफर के साथ नहीं किया जा सकता है। यदि विभिन्न एंजाइमों का उपयोग किया जा रहा है, तो एक अलग इनक्यूबेशन तापमान और बफर की आवश्यकता हो सकती है।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम-आधारित पीसीआर क्लीनअप किट के साथ पचे हुए पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें।
    2. पाचन प्रतिक्रिया के 50 μL में 10 μL जेल लोडिंग डाई (6x) जोड़कर जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए पचने वाले pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 बैकबोन प्लास्मिड तैयार करें। एक डीएनए सीढ़ी, पाचन प्रतिक्रिया, और 250 एनजी अनडाइजेस्टेड प्लास्मिड (नकारात्मक नियंत्रण) को 0.8% एगरोज जेल पर लोड करें जिसमें चौड़े दांतों के कुओं के साथ एथिडियम ब्रोमाइड होता है। यूवी प्रकाश के साथ कल्पना करें, वांछित टुकड़े (~ 4.5 केबी) का उत्पादन करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें।
  4. तालिका 4 से आवश्यक व्यक्तिगत घटकों के साथ 20 μL बंधाव प्रतिक्रिया में पचने वाले पीसीआर उत्पाद और पचने वाले पीएएवी बैकबोन प्लास्मिड को मिलाएं। आवश्यक पीसीआर उत्पादों की मात्रा की गणना करने के लिए, फॉर्मूला 1 का उपयोग करें। आमतौर पर, 50 एनजी बैकबोन के द्रव्यमान के साथ पीसीआर उत्पाद (सम्मिलित) से बैकबोन (पीएएवी) के 3: 1 दाढ़ अनुपात का उपयोग करें।
    Equation 1फ़ॉर्मूला 1
  5. पीसीआर उत्पाद को पानी से बदलकर नकारात्मक नियंत्रण करें। रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर, या 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बंधाव प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. सक्षम, पुनर्संयोजन की कमी वाली जीवाणु कोशिकाओं (जैसे कि एसटीबीएल 3 कोशिकाओं) की एक शीशी को बर्फ पर पिघलाएं और 50 μL को 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। कोशिकाओं पर सीधे लिगेशन प्रतिक्रिया के 3 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: आईटीआर अस्थिर संरचनाएं हैं और इसलिए आईटीआर विलोपन और पुनर्संयोजन घटनाओं को सीमित करने के लिए पुनर्संयोजन-कमी वाले जीवाणु उपभेदों की आवश्यकता होती है। डीएच 5 ए कोशिकाओं का उपयोग प्रसार (एक या दो बार) के लिए रुक-रुक कर किया जा सकता है, लेकिन दीर्घकालिक उपयोग के लिए अनुशंसित नहीं हैं। आईटीआर की सत्यनिष्ठा की नियमित रूप से जांच की जानी चाहिए।
    1. 30 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बैक्टीरिया को गर्मी-झटका दें और फिर तुरंत 2 मिनट के लिए बर्फ में स्थानांतरित हो जाएं। एलबी बफर के 200 μL जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस, 180 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए हिलाएं।
    2. मिश्रण के 125 μL को संबंधित एंटीबायोटिक के साथ एक आगर प्लेट पर फैलाएं और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (~ 18 घंटे) इनक्यूबेट करें। कई क्लोन चुनें और प्रत्येक को 3 एमएल एलबी के साथ एक बाँझ प्लास्टिक कल्चर ट्यूब में रखें जिसमें संबंधित एंटीबायोटिक हो। 30 डिग्री सेल्सियस, 180 आरपीएम पर रात भर हिलने के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: आईटीआर विलोपन या उत्परिवर्तन को रोकने के लिए, सेलुलर विभाजन को धीमा करने और प्रतिकृति में त्रुटियों को कम करने के लिए बैक्टीरिया कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, छोटी कॉलोनियों को चुना जाना चाहिए क्योंकि जिनके पास आईटीआर नहीं है, उन्हें दूसरों की तुलना में वृद्धि का लाभ हो सकता है।
    3. प्रत्येक कल्चर के 1.8 एमएल को 2 एमएल ट्यूब में डालें और 3 मिनट, कमरे के तापमान के लिए 6,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। मिनीप्रेप किट का उपयोग करके डीएनए को अलग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष 1.2 एमएल संस्कृति स्टोर करें। डीएनए अनुक्रमण या नैदानिक प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट द्वारा सही क्लोन सत्यापित करें।
      नोट: सम्मिलित के सेंगर अनुक्रमण की सिफारिश की जाती है, लेकिन आईटीआर के माध्यम से प्रक्रिया मानक तरीकों से प्राप्त नहीं की जा सकती है। आईटीआर को प्रतिबंध पाचन द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए जैसा कि नीचे वर्णित है।
    4. एक बाँझ 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में संबंधित एंटीबायोटिक युक्त एलबी बफर के 50 एमएल जोड़ें। फ्लास्क में शेष संस्कृति के 500 μL जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस, 180 आरपीएम पर हिलाएं जब तक कि 0.2-0.5 का OD600 (~ 18 घंटे) तक न पहुंच जाए। बैक्टीरिया को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3,000 x g, 4 °C पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। एंडोटॉक्सिन-लो या -फ्री मिडीप्रेप किट का उपयोग करके डीएनए को अलग करें।
    5. एक्सएमएआई (या एसएमएआई) का उपयोग करके नैदानिक प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट के 20 μL के साथ आईटीआर अखंडता की जांच करें। 500 एनजी प्लास्मिड, 0.5 μL एंजाइम और 1x बफर युक्त प्रतिक्रिया तैयार करें; 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया को 0.8% एगारोस-जेल पर चलाएं। यदि आईटीआर बरकरार है, तो पाचन एक बैंड ~ 2.9 केबी और दूसरा बैंड कैसेट के आकार का देगा। यदि यह विशिष्ट बैंड नहीं देखा जाता है, तो आईटीआर बरकरार नहीं हो सकता है, और क्लोनिंग को फिर से तैयार करने की आवश्यकता होगी।
      नोट: XmaI (या SMAI) प्रतिबंध साइटों वाले प्लास्मिड (ITR में उन लोगों के अलावा) जेल पर अतिरिक्त बैंड दिखाई देंगे।

Figure 2
चित्रा 2: प्राइमर डिजाइन के लिए प्रतिनिधि उदाहरण। एमस्कारलेट ट्रांसजीन के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर डिज़ाइन (प्रतिनिधि उदाहरण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

राशि घटक
X μL टेम्पलेट डीएनए (25 एनजी)
1 μL एफ प्राइमर (10 μM)
1 μL आर प्राइमर (10 μM)
1 μL dNTP (10 mM)
10 μL फ्यूसियन बफर (5x)
1 μL फ्यूसियन पोलीमरेज़
X μL पानी
50 μL अंतिम खंड

तालिका 1: पीसीआर प्रवर्धन अभिकर्मक। एक सफल पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक घटक।

क़दम तापमान समय
प्रारंभिक विकृतीकरण। 98 °C 1 मिनट
30 चक्र 98 °C 10 s
प्राइमर का टीएम 30 s
72 °C 30 s प्रति kb
अंतिम विस्तार 72 °C 10 मिनट
पकड 4 °C अनिश्चित काल

तालिका 2: पीसीआर प्रवर्धन प्रोग्रामिंग। एक सफल पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक साइकिल िंग पैरामीटर।

राशि घटक
X μL पीसीआर उत्पाद (1μg) या pAAV प्लास्मिड (3μg)
5 μL बफर (10x)
1 μL इकोआरआई-एचएफ
1 μL नोटी-एचएफ
X μL पानी
50 μL अंतिम खंड

तालिका 3: पाचन अभिकर्मक। एक सफल पाचन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक घटक।

राशि घटक
X μL सम्मिलित करें (X ng)
X μL रीढ़ की हड्डी (50 एनजी)
2 μL टी 4 डीएनए लिगेज बफर (10x)
1 μL टी 4 डीएनए लिगेस।
X μL पानी
20 μL अंतिम खंड

तालिका 4: बंधाव अभिकर्मक। एक सफल बंधाव प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक घटक।

3. ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक के साथ वेक्टर उत्पादन

नोट: निम्नलिखित मान 6-वेल प्लेट के एकल कुएं के लिए अनुकूलित हैं जो 2 एमएल की अंतिम क्रूड तैयारी मात्रा उत्पन्न करता है। सभी मानों को 15 सेमी प्लेट के लिए 10x तक बढ़ाया जा सकता है जो 20 एमएल की अंतिम मात्रा उत्पन्न करता है या 500 μL की अंतिम मात्रा के साथ 24-वेल प्लेट के लिए 4x से कम हो जाता है।

  1. 100 मिलीलीटर आसुत जल में 100 मिलीग्राम पीईआई मैक्स को घोलकर पॉलीथाइलनिमाइन हाइड्रोक्लोराइड (पीईआई) मैक्स का 1 μg / μL स्टॉक बनाएं। NaOH के साथ pH को 7.1 पर समायोजित करें। 0.22 μm फ़िल्टर के साथ मिश्रण को फ़िल्टर करें और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 mL एलिकोट फ्रीज करें। एक बार पिघलने के बाद, अभिकर्मक को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए स्टोर करें।
  2. बीज 3 x 10 5 एचईके 293 या HEK293T कोशिकाओं को पूर्व-गर्म डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम,4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट) के साथ 6-वेल प्लेट में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 (चित्रा 3) पर सेट किए गए इनक्यूबेटर में ~ 75% -90% कंफ्लुएंसी तक बढ़ें।
    स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ संवर्धित कोशिकाओं को वेक्टर उत्पादन उपज को कम करने के लिए देखा गया है। उचित बाँझ तकनीक का उपयोग करने से पी / एस का उपयोग करने की आवश्यकता को दरकिनार कर दिया जाता है, और इस प्रकार एंटीबायोटिक20 के साथ एचईके 293 कोशिकाओं को कल्चर नहीं करने की सिफारिश की जाती है। यदि डाउनस्ट्रीम ट्रांसडक्शन में पी / एस की आवश्यकता होती है, तो कटाई के बाद कच्चे तेल की तैयारी में पी / एस जोड़ने की सिफारिश की जाती है।
  3. एक 2 एमएल ट्यूब में, 1.3 μg pAAV2/2 (Rep/cap, सेरोटाइप 2), 1.3 μg pAAV.GoI, 2.6 μg pAdUΆ6, और सीरम मुक्त (SF) DMEM (4.5 g/L ग्लूकोज, 110 mg/L सोडियम पाइरूवेट) वाला मिश्रण 100 μL की कुल मात्रा में तैयार करें (सुविधाजनक गणना के लिए पूरक तालिका 1 देखें)।
  4. किसी भी असंबंधित प्लास्मिड के साथ pRep / Cap को बदलकर एक अलग ट्यूब में एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें। कच्चे तेल की तैयारी में मौजूद अनपैकेज्ड पीएएवी.जीओआई प्लास्मिड के लिए नकारात्मक नियंत्रण खाता है जो संभवतः पारगमन के दौरान कोशिकाओं को स्थानांतरित कर सकता है, हालांकि दुर्लभ है।
    नोट: एंडोटॉक्सिन-लो या -फ्री मैक्सिप्रेप या मिडिप्रेप प्लास्मिड ट्रिपल-अभिकर्मक के लिए आदर्श है और आम तौर पर मिनीप्रेप डीएनए की तुलना में उच्च टिटर वेक्टर का उत्पादन करता है, हालांकि मिनीप्रेप डीएनए का उपयोग त्वरित और गंदे प्रारंभिक परीक्षण के लिए किया जा सकता है।
  5. प्लास्मिड मिश्रण में पीईआई मैक्स के 5.2 μL जोड़ें; यह 1: 1 के अनुपात के साथ एक प्लास्मिड: पीईआई मिश्रण है। भंवर मिक्सर पर 10-15 बार पल्प करके अच्छी तरह मिलाएं। यदि कई वेक्टर तैयारी का उत्पादन किया जाता है, तो प्रत्येक प्लास्मिड मिश्रण में पीईआई को 1 मिनट के क्रमबद्ध समय अंतराल पर जोड़ें (यानी, टी = 0 मिनट पर तैयारी 1, टी = 1 मिनट पर तैयारी 2, आदि) ताकि कुओं को एस्पिरेट करने और निम्नलिखित चरणों में प्रतिक्रिया को पतला करने के लिए पर्याप्त समय मिल सके।
    नोट: प्लास्मिड: पीईआई का 1: 1 अनुपात इष्टतम देखा गया है। हालांकि, व्यक्तिगत उपयोगकर्ता अधिकतम दक्षता के लिए इस अनुपात को अनुकूलित कर सकते हैं। पीईआई अनुकूलन करने के तरीके के लिए चर्चा देखें ( पूरक तालिका 2 भी देखें)।
  6. प्रत्येक ट्यूब को ठीक 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर 2 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए 1.9 एमएल एसएफ डीएमईएम (4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट) के साथ प्रतिक्रिया को पतला करें। मिश्रण करने के लिए धीरे से 2x पिपेट करें। ओवरमिक्सिंग प्लास्मिड / पीईआई कॉम्प्लेक्स को बाधित करेगा और इसके परिणामस्वरूप कम अभिकर्मक दक्षता होगी।
  7. अच्छी तरह से एस्पिरेट मीडिया और सेलुलर डिटेचमेंट को रोकने के लिए अच्छी तरह से प्लास्मिड: पीईआई मिश्रण को अच्छी तरह से जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 72 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान सेल लाइसिस और अलगाव आरएएवी उत्पादन की एक सामान्य प्रक्रिया है (चित्रा 4)।

Figure 3
चित्रा 3: एचईके 293 कोशिकाएं अभिकर्मक के लिए तैयार हैं। ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक के लिए आवश्यक एचईके 293 कोशिकाओं का आदर्श संयोजन (75% -90%) है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: अभिकर्मक के बाद एचईके 293 कोशिकाएं। 1, 2, या 3 दिनों के बाद एचईके 293 कोशिकाओं की उपस्थिति पीएएवी.सीएमवी.ल्यूक.आईआरईएस.ईजीएफपी.एसवी 40, पीएएवी 2/2, पीएडी2/2, पीएडीयूएफ 6, और प्लास्मिड: पीईआई के 1: 1 अनुपात के साथ अभिकर्मक के बाद। स्केल सलाखों: 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. कच्चे वेक्टर की तैयारी की कटाई

  1. -80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए संक्रमित कोशिकाओं की पूरी प्लेट को फ्रीज करें, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पिघलाव करें। कुल तीन फ्रीज / पिघलाव चक्रों के लिए दोहराएं। ढक्कन को न हटाएं-प्लेट को अंदर बाँझ रहना चाहिए। प्लेटें -80 डिग्री सेल्सियस पर रह सकती हैं जब तक कि अगले चरणों में आगे बढ़ने के लिए तैयार न हों।
    नोट: एक गैर-ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर पिघलने के लिए सबसे अच्छा काम करता है, जो प्लेटों के बाहर संघनन को कम करता है जिससे आकस्मिक संदूषण हो सकता है।
  2. सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके एक लामिनर प्रवाह हुड में निम्नलिखित दो चरणों का पालन करें। कोशिकाओं के अधिकतम व्यवधान को सुनिश्चित करने के लिए पाइपिंग द्वारा प्रत्येक को अच्छी तरह से मिलाएं। सेल मलबे को हटाने के लिए 15,000 x g, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए लाइसेट को 2 एमएल ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करें।
  3. सुपरनैटेंट को एक नई 2 एमएल ट्यूब में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। इस कच्चे तैयारी का उपयोग अनुमापन या शुद्धिकरण के बिना तुरंत किया जा सकता है। वेक्टर को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या वर्षों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो टिटर्स की गणना मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा डीनेस प्रतिरोधी कणों के अंदर वेक्टर जीनोम (वीजी) की संख्या को निर्धारित करके की जा सकती है। जैसे, टिटर्स वीजी / एमएल की इकाइयों में दिए जाते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों तक संग्रहीत वेक्टर को उपयोग से पहले फिर से टाइट किया जाना चाहिए क्योंकि वेक्टर ट्यूब की दीवारों को एकत्र और / या बांध सकता है, जिससे तैयारी का टिटर कम हो जाता है।

5. पारगमन

  1. पारगमन की अवधि के आधार पर 50% -75% के लक्ष्य प्रवाह पर 96-वेल प्लेट में वांछित सेल प्रकार (जैसे, हुह 7) को प्लेट करें। अधिक सामंजस्य के परिणामस्वरूप एएवी पारगमन दक्षता कम हो सकती है।
  2. उन अनुप्रयोगों के लिए कच्चे तैयारी के टिटर को जाने बिना कोशिकाओं में वेक्टर (जैसे, सीएमवी.एमस्कारलेट) जोड़ें जहां खुराक प्रासंगिक नहीं है, जैसे कि एक नए सेल प्रकार में पारगमन के लिए कैप्सिड के पैनल का परीक्षण करना। आवेदन के लिए आवश्यक वेक्टर की इष्टतम मात्रा प्राप्त करने के लिए सीरम-मुक्त (एसएफ) मीडिया में क्रूड तैयारी की 1: 3 कमजोर पड़ने की श्रृंखला करें। 96-वेल प्लेट से एस्पिरेट मीडिया और कुओं में 50-100 μL पतला क्रूड तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेटकरें।
    नोट: सीरम में एंटीबॉडी हो सकते हैं जो एएवी वेक्टर को बेअसर कर सकते हैं और पारगमन दक्षता को कम कर सकते हैं। हालांकि, संवेदनशील सेल प्रकारों के लिए पारगमन के दौरान सीरम का उपयोग किया जा सकता है।
  3. 48 घंटे के पोस्ट-ट्रांसडक्शन (एचपीटी) के बाद वेक्टर को हटा दें और प्री-वार्म्ड फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। संवेदनशील सेल प्रकारों के लिए 2 एचपीटी होते ही वैक्टर को हटा दिया जा सकता है और सीरम युक्त मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। कई अनुप्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए रात भर इनक्यूबेशन करें और सुबह में ताजा सीरम युक्त मीडिया के साथ कुओं को बदलें। मजबूत सेल प्रकार, जैसे कि Huh7 और U2-OS, को मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता नहीं होती है।
  4. 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में कोशिकाओं को ठीक करके पारगमन को समाप्त करें। आवेदन के आधार पर विभिन्न समाप्ति विधियों का भी उपयोग किया जा सकता है (जैसे, लाइसिस)। अधिकांश सेल प्रकारों के लिए, पीक अभिव्यक्ति 48 एचपीटी द्वारा होती है और इस प्रकार यह एक सामान्य प्रयोगात्मक समापन बिंदु है।

6. सेल प्रकार द्वारा पारगमन विधि पर भिन्नताएं

नोट: विभिन्न सेल प्रकारों को विभिन्न संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता होती है। इसलिए, पारगमन के लिए वेक्टर के अतिरिक्त सेल प्रकार की जरूरतों के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। नीचे प्रतिनिधि परिणामों में शामिल सेल प्रकारों के लिए बहुत विशिष्ट पारगमन प्रोटोकॉल हैं, जो पारगमन प्रोटोकॉल के कुछ रूपों को दर्शाते हैं जो एक शोधकर्ता अपनी आवश्यकताओं के लिए प्रयास करना चाह सकता है।

  1. माउस छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स।
    1. C57BL/6J चूहों से एक छोटी आंतों के क्रिप्ट प्रेप से माउस छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स (एमएसआईओ) प्राप्त करें। 90% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और कल्चर में ऑर्गेनोइड्स को 24-वेल प्लेटों में एम्बेड करें जिसमें या तो ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडियम (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) या प्री-ट्रांसडक्शन मीडियम (50% डब्ल्यूएनटी 3 ए-वातानुकूलित माध्यम [ऑर्गनॉइड ग्रोथ मीडियम में एल डब्ल्यूएनटी -3 ए कोशिकाओं का उपयोग करके इन-हाउस उत्पादित], 10 एमएम निकोटिनामाइड, 10 μM रॉक इनहिबिटर, और 2.5 μM CHIR99021) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर पारगमन से पहले एक मार्ग (5-7 दिन) के लिए।
    2. पारगमन से पहले, डी-पीबीएस के साथ ऑर्गेनोइड्स को कुल्ला करें, पाइपिंग द्वारा बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों को बाधित करें, और ऑर्गेनोइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पृथक्करण माध्यम में इंजेक्ट करके छोटे सेल क्लस्टर में अलग करें।
    3. 15 mM HEPES के साथ DMEM / F-12 में 5% FBS जोड़कर सेल पृथक्करण प्रक्रिया को रोकें, सेल क्लस्टर को सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 1000 x g, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल क्लस्टर एकत्र करें।
    4. ट्रांसडक्शन माध्यम (पूर्व-पारगमन माध्यम जिसमें 10 μg / mL पॉलीब्रेन या ऑर्गेनॉइड विकास माध्यम जिसमें 10 μg / mL पॉलीब्रेन होता है) में सेल समूहों को पुन: निलंबित करें और 48-वेल प्लेटों में स्थानांतरित करें, इसके बाद पारगमन के लिए AAV क्रूड तैयारी पैकेजिंग CMV.mScarlet को जोड़ा जाए।
    5. 600 x g और 37 °C पर 1 घंटे के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करके ऑर्गेनोइड्स का पारगमन करें और फिर अतिरिक्त 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ट्रांसड्यूस ्ड ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें, 1000 x g, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और बर्फ पर डालें।
    6. सतह पर तैरने वाले को हटाने के बाद, पूर्व-पारगमन माध्यम या ऑर्गेनॉइड विकास माध्यम में 90% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में ट्रांसड्यूस्ड ऑर्गेनोइड्स और 20 μL की बीज बूंदों को पूर्व-गर्म चैंबर कवर ग्लास के एक कुएं में पुन: निलंबित करें।
    7. इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेशन के बाद, बूंद को प्री-ट्रांसडक्शन माध्यम या ऑर्गेनॉइड विकास माध्यम के 350 μL में एम्बेड करें और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ट्रांसड्यूस्ड ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग करके पारगमन के 2-5 दिन बाद पारगमन दक्षता निर्धारित करें और प्रति ऑर्गेनॉइड लाल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान लगाएं।
  2. BeWo कोशिकाएँ
    1. पारगमन से 24 घंटे पहले, प्लेट मानव प्लेसेंटल कोरियोकार्सिनोमा बीवो कोशिकाओं को 10,000 कोशिकाओं पर 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं पर रखें। सीरम-मुक्त एफ 12-के बीवो माध्यम में सीएमवी.एमस्कारलेट को 1: 1 तक पतला क्रूड एएवी तैयारी पैकेजिंग प्रति कुएं 50 μL की कुल मात्रा तक। अच्छी तरह से एस्पिरेट माध्यम और प्रति कुएं 50 μL पतला AAV के साथ बदलें।
    2. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस (~ 18 घंटे) पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और फिर कुल मात्रा को 150 μL तक लाने के लिए 10% FBS युक्त F12-K BeWo माध्यम के 100 μL जोड़ें। कुल 24 घंटे पोस्ट-ट्रांसडक्शन (hpt) के लिए अतिरिक्त 6 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. इमेजिंग के लिए, एफ 12-के माध्यम में 30 मिनट के लिए होचस्ट डाई के साथ जीवित कोशिकाओं को दाग दें, फिर फिनोल-मुक्त डीएमईएम के लिए माध्यम का आदान-प्रदान करें जिसमें 10% एफबीएस, 1 एक्स ग्लूटामैक्स पूरक और इमेजिंग के लिए 1 एक्स सोडियम पाइरूवेट पूरक शामिल हैं। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 के साथ डीएपीआई (होचस्ट इमेजिंग के लिए) और एमचेरी (एमस्कारलेट इमेजिंग के लिए) फिल्टर सेट का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लाइव-सेल इमेजिंग का संचालन करें।
  3. हेपा 1-6 और हुह 7 कोशिकाएं।
    1. डीएमईएम में प्लेट मुराइन हेपा 1-6 यकृत कोशिकाएं और मानव हुह 7 यकृत कोशिकाएं (4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट, 10% एफबीएस) पारगमन से 24 घंटे पहले 96-वेल प्लेट के 5,000 कोशिकाओं प्रति कुएं पर।
    2. सीएमवी.एमस्कारलेट को सीधे कोशिकाओं में 50 μL कच्चे एएवी तैयारी पैकेजिंग जोड़ें और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस में एक बार कोशिकाओं को धोएं, 4% पीएफए में ठीक करें, और 10 मिनट के लिए होचस्ट डाई के साथ दाग दें। DAPI (Hoechst इमेजिंग के लिए) और mCherry (mScarlet इमेजिंग के लिए) फिल्टर सेट का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग का संचालन करें।
  4. C2C12 और HSkMC कोशिकाएँ
    1. प्लेट अविभाजित मुराइन सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स और अविभाजित मानव प्राथमिक कंकाल मांसपेशी कोशिका (एचएसकेएमसी) मायोब्लास्ट्स 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 5,000 कोशिकाओं पर, पारगमन से 72 घंटे पहले।
    2. एचएसकेएमसी मायोब्लास्ट्स के लिए सी 2 सी 12 मायोब्लास्ट्स या कंकाल की मांसपेशी वृद्धि मीडिया के लिए डीएमईएम (4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, पेन / स्ट्रेप, 20% एफबीएस) में सीएमवी.एमस्कारलेट को 1: 1 तक पतला क्रूड एएवी तैयारी पैकेजिंग। मीडिया को भेदभाव मीडिया में बदलकर एचएसकेएमसी मायोब्लास्ट्स को मायोट्यूब में अंतर करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए पतला एएवी तैयारी में मायोब्लास्ट्स और मायोट्यूब्स को इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए होचस्ट डाई के साथ जीवित कोशिकाओं को दागें और डीएपीआई (होचस्ट इमेजिंग के लिए) और एमचेरी (एमस्कारलेट इमेजिंग के लिए) फिल्टर सेट का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि बनाएं।

Representative Results

रुचि की सुसंस्कृत कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए इष्टतम कैप्सिड खोजना।
विभिन्न कैप्सिड सीरोटाइप (चित्रा 5) के ट्रोपिज्म को निर्धारित करने के लिए विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस किया गया था। प्राकृतिक सीरोटाइप एएवी 2 14, एएवी 4 21, एएवी 5 22, एएवी 8 23, एएवी 924, और इंजीनियर कैप्सिड वेरिएंट एएनसी 80 25, डीजे 26, एलके 03 27, और केपी 1 28 को एक वेक्टर जीनोम के साथ पैक किया गया था, जो सीएमवी प्रमोटर के तहत एमस्कारलेट को व्यक्त करता है, इस प्रोटोकॉल में प्रदान की गई विधियों का उपयोग करके क्लोन किया गया था। उपयुक्त कल्चर मीडिया में अनटाइटेटेड क्रूड वेक्टर की तैयारी को पतला किया गया था और कोशिकाओं को 24+ घंटे के लिए ट्रांसड्यूस किया गया था और छवि बनाई गई थी (चित्रा 5 बी)। ट्रांसडक्शन दक्षता की गणना कुल कोशिकाओं के अनुपात से की गई थी जो एमस्कारलेट + थे, या एकल जेड-प्लेन में कोशिकाओं का अनुपात जो एमस्कारलेट + थे (माउस छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स के लिए; चित्रा 5 सी)। ट्रांसडक्शन क्षमता (एमस्कारलेट + कोशिकाएं) विभेदित सी 2 सी 12 और एचएसकेएमसी मायोट्यूब के लिए प्रदान नहीं की जाती हैं, बल्कि अविभाजित सी 2 सी 12 और एचएसकेएमसी मायोब्लास्ट्स (चित्रा 5 ए) के लिए प्रदान की जाती हैं।

एएवी 2 और केपी 1 परीक्षण किए गए सेल लाइनों में सबसे शक्तिशाली सीरोटाइप थे (चित्रा 5 ए)। यह भी देखा गया कि विभिन्न प्रजातियों से उत्पन्न होने वाले समान सेल प्रकार अलग-अलग क्षमता पर ट्रांसड्यूस किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, हेपा 1-6 (एक मुराइन-व्युत्पन्न यकृत कोशिका रेखा) एएवी 2 (चित्रा 5 बी) का उपयोग करते समय हुह 7 (एक मानव-व्युत्पन्न यकृत कोशिका रेखा) की तुलना में पारगमन में उल्लेखनीय कमी प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, विभिन्न मीडिया स्थितियां पारगमन के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। पूर्व-पारगमन मीडिया में संवर्धित माउस छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स (एमएसआईओ) ऑर्गेनॉइड विकास मीडिया (चित्रा 5 सी) में सुसंस्कृत लोगों की तुलना में कम प्रभावी ढंग से ट्रांसड्यूस किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, एएवी 2 कुशलतापूर्वक उदासीन एचएसकेएमसी मायोब्लास्ट्स और विभेदित एचएसकेएमसी मायोट्यूब्स (चित्रा 5 बी) को ट्रांसड्यूस करता है, हालांकि मायोट्यूब का मात्रात्मक विश्लेषण मुश्किल है और इसलिए प्रदान नहीं किया जाता है।

चित्रा 5 में विभिन्न सेल प्रकारों के लिए देखी गई उच्च पारगमन क्षमता से पता चलता है कि कच्चे वेक्टर की तैयारी का उपयोग शुद्धिकरण और अनुमापन जैसे आगे के चरणों के बिना विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने के लिए प्रभावी ढंग से किया जा सकता है। हालांकि, ट्रांसजीन डिलीवरी को अधिकतम करने के लिए कैप्सिड चुनते समय सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। कई अन्य सेल लाइनों और कैप्सिड ्स का पहले परीक्षण किया गया है और प्रकाशित किया गया है, हालांकि शुद्ध वेक्टर तैयारी12 के साथ।

मीडिया स्थितियों का एक वेक्टर कण स्वतंत्र प्रभाव पारगमन की दक्षता को प्रभावित कर सकता है। हालांकि, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि ट्रोपिज्म (यानी, सेल-प्रकार विशिष्ट उत्थान और वेक्टर की अभिव्यक्ति) एक गुण है जो कैप्सिडविशिष्ट 29 है। सेलुलर ट्रोपिज्म को प्रभावित करने के लिए खुराक-मिलान कच्चे और शुद्ध तैयारी के बीच तुलना अभी तक नहीं देखी गई है। इसलिए, क्रूड वेक्टर तैयारी का उपयोग सेल कल्चर में शुद्ध वैक्टर के समान तरीके से किया जा सकता है।

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न सेल प्रकारों का क्रूड वेक्टर ट्रांसडक्शन । (ए) एमस्कारलेट ट्रांसजीन युक्त विभिन्न एएवी वैक्टर को जोड़ने के बाद एमस्कारलेट + का प्रतिशत। (बी) एएवी सीरोटाइप 2 से वितरित एमस्कारलेट को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं। स्केल बार: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12, और HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO)। संक्षेप: एचपीटी = पारगमन के बाद के घंटे। (सी) माउस छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स (एमएसआईओ) को या तो पूर्व-पारगमन मीडिया या ऑर्गेनॉइड ग्रोथ मीडिया में आरएएवी का इलाज किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: ट्रिपल प्लास्मिड अभिकर्मक वर्कशीट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: पीईआई अनुकूलन कार्यपत्रक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

क्लोनिंग
क्लोनिंग प्रोटोकॉल ऊपर उपयोग किए गए pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 प्लास्मिड तक सीमित नहीं है और शोधकर्ता की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर आसानी से बदला जा सकता है। कई आईटीआर युक्त प्लास्मिड खरीद के लिए आसानी से ऑनलाइन उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, कैस 9 और एक एसजीआरएनए क्लोनिंग साइट दोनों युक्त प्लास्मिड उपलब्ध हैं, लेकिन कुछ अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है जैसे कि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड एनीलिंग और पीएनके उपचार30। इसके अतिरिक्त, प्लास्मिड जिसमें केवल आईटीआर के साथ एक मल्टीपल क्लोनिंग साइट (एमसीएस) होती है और कोई आंतरिक नियामक तत्वनहीं पाया जा सकता है। यदि विभिन्न प्लास्मिड का उपयोग किया जाना है, तो पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइम (आरई) आमतौर पर एकमात्र तत्व होते हैं जिन्हें इस प्रोटोकॉल में बदलने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, आरएएवी की एक सीमा इसकी सीमित कार्गो क्षमता है। कैप्सिड की भौतिक सीमाओं के कारण, वेक्टर जीनोम आईटीआर सहित 4.9 केबी से अधिक नहीं होना चाहिए।

बैक्टीरिया से प्लास्मिड को अलग करते समय, ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक या पारगमन के दौरान कोशिकाओं को नुकसान को कम करने के लिए एंडोटॉक्सिन-लो या -फ्री मिडीप्रेप या मैक्सिप्रेप किट का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। मिनीप्रेप किट से प्लास्मिड में अक्सर उच्च अशुद्धियां, कम सांद्रता और कम सुपरकॉइलडीएनए होते हैं, जिनमें से सभी आरएएवी के डाउनस्ट्रीम उत्पादन को प्रभावित कर सकते हैं और इस प्रकार अनुशंसित नहीं हैं।

क्लोनिंग के दौरान आईटीआर की संरचना और गुणों को समझना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, आईटीआर के माध्यम से पीसीआर का उपयोग करना बेहद मुश्किल है। क्लोनिंग डिजाइन जिन्हें आईटीआर के माध्यम से पीसीआर प्रवर्धन की आवश्यकता होती है, उनसे बचा जाना चाहिए, और इसके अलावा गिब्सन असेंबली क्लोनिंग तकनीक के उपयोग को सीमित करना चाहिए। जैसे, प्रतिबंध एंजाइम क्लोनिंग आईटीआर युक्त प्लास्मिड में क्लोनिंग के लिए पसंदीदा तरीका है। इसके अलावा, सेंगर अनुक्रमण के लिए कुछ प्राइमर संगत नहीं हो सकते हैं यदि अनुक्रमित क्षेत्र में आईटीआर होता है। इसके बजाय, अधिक सटीक अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए आईटीआर से दूर और वेक्टर जीनोम बॉडी में अनुक्रम ति प्राइमरों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। दूसरा, प्लास्मिड प्रवर्धन32,33 के लिए बैक्टीरिया में परिवर्तित होने पर आईटीआर विलोपन, पुनर्व्यवस्था और उत्परिवर्तन से ग्रस्त हैं। इन घटनाओं को कम करने के लिए, पुनर्संयोजन-कमी वाले सक्षम जीवाणु उपभेदों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि एसटीबीएल 3, और सेलुलर डिवीजनों को धीमा करने के लिए उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना। अंत में, यह देखा गया है कि छोटी कॉलोनियां पुनर्व्यवस्था या विलोपन के बिना क्लोन के अनुरूप हो सकती हैं, क्योंकि आईटीआर के बिना वे विकास लाभ प्रदान कर सकते हैं और बड़े हो सकते हैं। इसलिए, उन कॉलोनियों को चुनने की सिफारिश की जाती है जो छोटी हैं।

वेक्टर उत्पादन
आरएएवी वेक्टर का सफल उत्पादन कई तत्वों से प्रभावित हो सकता है। एक महत्वपूर्ण कारक अभिकर्मक के लिए उपयोग की जाने वाली एचईके 293 या 293 टी कोशिकाओं का स्वास्थ्य है। आम तौर पर, कम मार्ग संख्या आदर्श होती है, क्योंकि अत्यधिक पारित कोशिकाएं जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक विचरण प्रदर्शित कर सकती हैं जो आरएएवी टिटर्स को कम कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, प्रभावी उत्पादन के लिए बीज कोशिकाओं का घनत्व 75% -90% होना चाहिए। विरल कोशिकाएं कम वेक्टर पैदावार उत्पन्न करती हैं क्योंकि वैक्टर का उत्पादन करने के लिए कम कोशिकाएं उपलब्ध होती हैं, जबकि अतिविकसित कोशिकाओं को कुशलता से स्थानांतरित नहीं किया जाएगा।

अभिकर्मक लॉट, सेल स्टॉक और सामान्य लैब-टू-लैब परिवर्तनशीलता के बीच भिन्नताएं अभिकर्मक क्षमता और उत्पादन टिटर में अंतर में योगदान करती हैं। एक इष्टतम कारक जो टिटर सुधार का कारण बन सकता है, वह अभिकर्मक प्रतिक्रियाओं में प्लास्मिड: पीईआई अनुपात है। ताजा (<1 महीने पुराना) पीईआई मैक्स का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यह अनुशंसा की जाती है कि 1: 1 के प्लास्मिड: पीईआई अनुपात को शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग किया जाए, और यदि अभिकर्मक या पारगमन दक्षता खराब दिखाई देती है, तो कई अलग-अलग अनुपातों का परीक्षण करें। टिटर ऑप्टिमाइज़ेशन सबसे आसान है यदि एक दृश्य रीडआउट के साथ ट्रांसजीन का उपयोग करना आसान है, जैसे कि CMV.Luc.IRES.EGFP रिपोर्टर ट्रांजीन यहां क्लोनिंग के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में उपयोग किया जाता है। अनुकूलन करने के लिए, 12-वेल प्लेट का उपयोग करके प्रोटोकॉल चरण 3 का पालन करें और प्लास्मिड द्रव्यमान और अभिकर्मक मात्रा को दो से कम करें (अंतिम प्लास्मिड द्रव्यमान 2.6 μg है)। 0.25 की बढ़ती वृद्धि के साथ 1: 0.75 से 1: 3 तक के अनुपात के अनुरूप पीईआई वॉल्यूम को तदनुसार समायोजित करें (चित्रा 6)। 15 मिनट के बाद एसएफ मीडिया के 950 μL के साथ प्रत्येक प्रतिक्रिया को पतला करें। सुविधा के लिए, ट्रिपल प्लास्मिड युक्त एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है और पीईआई को जोड़ने से पहले व्यक्तिगत रूप से 1.5 एमएल ट्यूबों में पाइप किया जा सकता है-पूरक फ़ाइल 2 देखें। वेक्टर की कटाई करें, रुचि की कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें, और छवि। उच्चतम पारगमन दक्षता (जीएफपी + कोशिकाओं का अनुपात) वाला कुआं उच्चतम टिटर और पीईआई: डीएनए के सबसे इष्टतम अनुपात से मेल खाता है।

Figure 6
चित्रा 6: पीईआई अनुकूलन वर्कफ़्लो। पीईआई अनुकूलन के लिए आवश्यक चरणों का योजनाबद्ध। प्लास्मिड के कई अनुपात: इष्टतम अनुपात निर्धारित करने के लिए पीईआई का परीक्षण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फसल और टिटर विचार।
आरएएवी वेक्टर की कटाई के लिए उपयोग की जाने वाली फ्रीज / पिघलने तकनीक प्रभावी रूप से एचईके 293 कोशिकाओं को सुसंस्कृत कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए स्पष्ट लाइसेट के प्रत्यक्ष उपयोग के साथ संगत तरीके से लाइसेस करती है। कुछ आरएएवी सीरोटाइप, जैसे कि एएवी 1, एएवी 8, और एएवी 9 वेक्टर उत्पादन के दौरान कोशिकाओं से जारी किए जाते हैं और फ्रीज / पिघलने चक्र34 के बिना सुसंस्कृत सेल माध्यम से काटा जा सकता है। यहां वर्णित विधि आम तौर पर एएवी 2 कैप्सिड ्स का उपयोग करते समय 1 x 1010 वीजी / एमएल के क्रम पर टिटर्स उत्पन्न करती है, और एएवी 8 के लिए 1 x 1011 वीजी / एमएल। जबकि उच्च टिटर्स को डिटर्जेंट या अन्य रासायनिक-आधारित लाइसिस द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, ये डाउनस्ट्रीम उपयोग में कोशिकाओं के लिए हानिकारक हैं और आरएएवी को लाइसेट से और शुद्ध करने की आवश्यकता होती है। लोअर टिटर एक व्यापार है जो एक शोधकर्ता को यह निर्धारित करते समय विचार करना चाहिए कि क्या कच्चे तेल की तैयारी उनकी शोध आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त है, हालांकि, यहां वर्णित विधियों द्वारा उत्पादित मामूली कम टिटर्स कई सेल प्रकारों को बहुत अच्छी तरह से ट्रांसड्यूस कर सकते हैं (प्रतिनिधि परिणाम देखें)। अभिकर्मक दक्षता और सेल स्वास्थ्य के अलावा, वेक्टर टिटर्स आरएएवी उत्पादन के दौरान उपयोग किए जाने वाले कैप्सिड और वीजी35 के भीतर ट्रांसजेन के आकार और अनुक्रम के आधार पर भिन्न होते हैं।

कच्चे वेक्टर की तैयारी करते समय, प्लास्मिड डीएनए जो ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक के दौरान उपयोग किया जाता था, मौजूद हो सकता है और, हालांकि दुर्लभ, पारगमन के दौरान डाउनस्ट्रीम अभिकर्मक का परिणाम होता है। इसके अलावा, अनपैकेज्ड वीजी कैप्सिड के बाहरी हिस्से से जुड़ सकते हैं और नग्न और विदेशी एकल-फंसे डीएनए36,37 के लिए एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आह्वान कर सकते हैं। इसलिए, संवेदनशील सेल प्रकारों को अनपैकेज्ड वीजी और प्लास्मिड को हटाने के लिए डीनेस को पचाने और शुद्ध करने के लिए वेक्टर तैयारी की आवश्यकता हो सकती है।

यदि कोई कच्चे तेल की तैयारी के टिटर की गणना करना चाहता है, तो क्यूपीसीआर को डीनेस प्रतिरोधी कणों (डीआरपी) के अंदर पैक किए गए वीजी की संख्या निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, प्लास्मिड डीएनए को हटाने, न्यूक्लिक एसिड को दूषित करने, या आंशिक रूप से पैक किए गए वीजी को हटाने के लिए कच्चे तेल की तैयारी की एक छोटी मात्रा को डीनेस-डाइजेस्ट किया जाता है। नमूना तब क्यूपीसीआर के अधीन होता है और डीआरपी के अंदर संरक्षित वीजी की मात्रा निर्धारित की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप क्रूड तैयारीके प्रति एमएल वेक्टर जीनोम की इकाइयों के साथ एक टिटर होता है। एलिसा-आधारित परख का उपयोग करके वेक्टर अनुमापन करने की सिफारिश नहीं की जाती है जो कैप्सिड टिटर्स की मात्रा निर्धारित करता है। वाइल्ड-टाइप एएवी वायरस की तुलना में, आरएएवी खाली और आंशिक रूप से पैक किए गए कैप्सिड्स 39 के अनुपात से ग्रस्त है। एलिसा उनकी जीनोम सामग्री की परवाह किए बिना सभी कैप्सिड ्स की मात्रा निर्धारित करेगा और एक तैयारी में मौजूद ट्रांसड्यूसेबल इकाइयों को अधिक महत्व देगा, जिसके लिए पैक किए गए वीजी की आवश्यकता होती है।

पारगमन विचार।
कई कारक आरएएवी पारगमन को प्रभावित करते हैं और किसी भी नए प्रयोग के लिए उचित विचार किया जाना चाहिए। ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को चलाने वाले प्रमोटर के आधार पर, अभिव्यक्ति की शुरुआत 4 घंटे पोस्ट-ट्रांसडक्शन (एचपीटी) के रूप में हो सकती है, और पीक अभिव्यक्ति आमतौर पर 48 एचपीटी द्वारा प्राप्त की जाती है। कोशिकाओं के प्रारंभिक बीजारोपण से प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक समय की अवधि को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। यह कोशिकाओं के शुरुआती संयोजन का अनुमान लगाने और यह सुनिश्चित करने के लिए है कि वे प्रयोग के अंत तक अतिवृद्धि न करें। यदि कोशिकाएं ओवरकॉन्फ्लुएंट हो जाती हैं, तो तनाव प्रतिक्रिया के कारण सेलुलर व्यवहार बदल सकता है और प्रयोगात्मक परिणामों को भ्रमित कर सकता है। कुछ सेल प्रकार, जैसे यू 2-ओएस, अतिवृद्धि / संपर्क अवरोध को काफी अच्छी तरह से सहन कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, वे सीरम-मुक्त वातानुकूलित माध्यम में लंबी अवधि (48 एच +) का सामना कर सकते हैं- इस उत्पादन प्रोटोकॉल का उत्पाद। हालांकि, संवेदनशील सेल प्रकारों को पारगमन के दौरान स्वास्थ्य बनाए रखने के लिए विशेष विकास माध्यम के साथ कच्चे मिश्रण की तैयारी के सीरम जोड़ या कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है। सीरम युक्त मीडिया का उपयोग करने से थोड़ी कम पारगमन दक्षता सेल स्वास्थ्य के लिए एक संभावित व्यापार है और शोधकर्ता द्वारा इस पर विचार किया जाना चाहिए।

आमतौर पर, तेजी से विभाजित कोशिकाओं के लिए, लगभग 50% का प्रारंभिक संयोजन उन अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम होता है जिन्हें 48 एचपीटी समाप्त कर दिया जाएगा। हालांकि, प्रयोग की जरूरतों के आधार पर सामंजस्य को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है। ट्रांसडक्शन क्षमता में कमी के कारण 75% से अधिक मोनोलेयर-प्रकार अमर सेल लाइनों को ट्रांसड्यूस करने की सिफारिश नहीं की जाती है। अधिकांश सुसंस्कृत सेल प्रकार कच्चे आरएएवी तैयारी के साथ रात भर इनक्यूबेशन के बाद सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस और स्वस्थ होते हैं, इसके बाद सुबह में ताजा सीरम युक्त मीडिया में बदलाव होता है।

कैप्सिड सीरोटाइप एक लक्ष्य सेल को ट्रांसड्यूस करने के लिए आरएएवी का उत्पादन करते समय विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि कैप्सिड सेलुलर ट्रोपिज्म और बाद में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति13 का प्राथमिक निर्धारक है। एएवी 2 एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सीरोटाइप है क्योंकि इसकी क्षमता कई प्रकार की सुसंस्कृतकोशिकाओं को प्रभावी ढंग से ट्रांसड्यूस करने की है। एएवी 2 की इस संपत्ति को हेपरिन सल्फेट प्रोटिओग्लाइकेन्स (एचएसपीजी) के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो एएवी 2 के लिए प्राथमिक लगाव कारक के रूप में कार्य करता है और डिश40 में बढ़ने के अनुकूलन से सुसंस्कृत कोशिकाओं पर एचएसपीजी के उच्च स्तर को दर्शाता है। अन्य कैप्सिड्स, जैसे कि एएवी 9, व्यापक सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने में कम प्रभावी हैं और उन्हें उनके निर्भरता अनुलग्नक कारकों द्वारा समझाया जा सकता है जो इस सेटिंग41 में व्यक्त नहीं किए गए हैं। इसलिए, हम एएवी 2 को सुसंस्कृत कोशिकाओं में पहली पसंद के कैप्सिड के रूप में सुझाते हैं यदि वांछित लक्ष्य सेल को पहले साहित्य में आरएएवी के साथ परीक्षण नहीं किया गया है।

कृपया ध्यान दें कि कच्चे वेक्टर तैयारी की एक बड़ी सीमा यह है कि वे पशु मॉडल को ट्रांसड्यूस करने के लिए अनुचित हैं। विवो अध्ययनों में शुद्ध होने और गुणवत्ता मूल्यांकन से गुजरने की तैयारी की आवश्यकता होती है।

ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और संभावित एकीकरण विचार।
आरएएवी विश्वसनीय रूप से ट्रांसजेन की स्थायी अभिव्यक्ति में परिणाम नहीं देते हैं। समय के साथ, वीजी चुप हो सकते हैं और ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति को कईअंशों के बाद बंद किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, अधिकांश वीजी एपिसोमल रहते हैं, और आरएएवी में वायरल रेप प्रोटीन नहीं होते हैं जो मेजबान जीनोम में लगातार एकीकरण को मध्यस्थ करेंगे जैसा कि जंगली-प्रकार के वायरल लाइसोजेनिक संक्रमण में होता है या वीजी43 की प्रतिकृति को बढ़ावा देता है। नतीजतन, ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में एपिसोम अंततः विभाजन के माध्यम से बेटी कोशिकाओं के बीच पतला हो जाएगा।

बेसल-स्तरीय एकीकरण सभी वितरित ट्रांसजेनिक डीएनए सामग्री के लिए एक संभावना है। हालांकि, आईटीआर युक्त वीजी को उच्च आवृत्ति44 पर एकीकरण की संभावना है। इसलिए, कोशिकाओं के एक छोटे से उप-समूह में एक ट्रांसजीन की स्थायी अभिव्यक्ति देखी जा सकती है। उपयोगकर्ताओं को इस संभावना पर विचार करना चाहिए, विशेष रूप से जब डीएनए-काटने वाले एंजाइमों को वितरित करने के लिए आरएएवी का उपयोग किया जाता है, जैसे कि कैस 9, क्योंकि डबल-फंसे हुए ब्रेक के परिणामस्वरूप एकीकरण और स्थायी अभिव्यक्ति45 की एक बड़ी आवृत्ति हो सकती है। हालांकि यह आरएएवी को अंतर्जात टैगिंग या जीन जोड़ के लिए होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट देने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बनाता है, सीएएस 9 सम्मिलन की संभावना को19,46 माना जाना चाहिए।

Disclosures

एसीएम जैनसेन फार्मास्यूटिकल्स के लिए एक सलाहकार है और न्यूबायोलॉजी के लिए एसएबी पर कार्य करता है। अन्य सभी लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम रॉबर्ट त्जियान और जेवियर डारज़ैक को उनके समर्थन और प्रयोगशाला उपकरणों के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं। हम केपी 1 और एलके03 प्रतिनिधि / कैप प्लास्मिड के उपहार के लिए मार्क के को धन्यवाद देते हैं, और एएवी 4 प्रतिनिधि / कैप प्लास्मिड के लिए लुक वांडेनबर्ग। फंडिंग हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (34430, आरटी) और कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन ट्रेनिंग प्रोग्राम ईडीयूसी 4-12790 द्वारा प्रदान की गई थी। एनडब्ल्यू एक सिबेल पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप के माध्यम से बर्कले स्टेम सेल सेंटर से और वाल्टर बेंजामिन फैलोशिप के माध्यम से जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) से धन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Snapgene DNA viewing sofrware Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 AddGene 105533
pAAV2/2 (Rep/Cap) AddGene 104963
pAdΔF6 AddGene 112867
LB Agar Carbenicillin Sigma-Aldrich L0418
Boekel Scientific Economy Digital Incubator Boekel Scientific 133000
LB medium, powder MP Biomedicals 113002042
Carbencillin (Disodium) GoldBio C-103-5
New Brunswick I26 Shaker Eppendorf M1324-0000
50 mL Centrifuge Tubes Corning 430828
Centrifuge 5810 R Eppendorf 22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit Qiagen 12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS USA Scientific 1402-3900
Mastercycler nexus Eppendorf 6333000022
dNTP Thermo Fisher Scientific 18427013
5x Phusion Buffer NEB B0518S Provided with purchase of Phusion Polymerase
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
Gel Loading Dye, Orange (6X) NEB B7022S
DNA Clean & Concentrator-100 Zymo D4029
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo D4001
NotI-HF NEB R3189S
EcoRI-HF NEB R3101S
CutSmart Buffer (10x) NEB B6004S Provided with purchase of restriction enzyme
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500100
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E1510
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with purchase of T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) Eppendorf 22363204
Precision Microprocessor Water Bath Thermo Scientific 51221046
Sterile Plastic Culture Tubes Fisher Scientific 149566B
2.0 mL Microcentrifuge Tube Thomas Scientific 1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - Classic Zymo D4015
Xma1 NEB R0180S
Sma1 NEB R0141S
HEK 293T cells ATCC CRL-3216
Falcon 6-well Corning 353046
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate Thermo-Fisher 11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator Marshall Scientific MCO-18AIC
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) Polysciences 24765-100
Mixer Vortex Genie 2 Electron Microscopy Sciences 102091-234
Sanyo Ultra Low Freezer Sanyo 14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 with transparent window VWR 390-0384
Eppendorf Microcentrifuges Eppendorf 05-400-005
Falcon 96-well Corning 353072
C57BL/6J mice JAX strain #000664
organoid growth medium STEMCELL Technologies 6005
L Wnt-3A cells ATCC CRL-2647
nicotinamide Sigma N0636-100G
ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302
CHIR99021 STEMCELL Technologies 72052
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Fisher 356231
24-well plate Fisher 08-772-1
D-PBS Thermo Fisher Scientific 14-190-250
TrypLE Express Fisher 12604013
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES STEMCELL Technologies 36254
polybrene Millipore Sigma TR-1003-G
48-well plates Fisher 08-772-3D
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Fisher 12-565-470
BeWo cells ATCC CCL-98
F-12K Medium ATCC 30-2004
Hepa1-6 ATCC CRL-1830
Huh7 UC Berkeley BSD Cell Culture Facility HUH-7
C2C12 ATCC CRL-1772
HSkMC ATCC PCS-950-010
Skeletal Muscle Cell Growth Medium Sigma C-23060
Skeletal Muscle Differentiation Medium Sigma C-23061
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope Fisher Scientific 12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix Perkin Elmer HH14001000
PhenoPlate 96-well Perkin Elmer 6055302
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Thermo-Fisher 31053028
GlutaMAX Supplement Thermo-Fisher 35050079
Sodium Pyruvate Thermo-Fisher 11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap) Addgene 104964
pAAV2/8 (Rep/Cap) Addgene 112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) Addgene 130878
pAAV2/9n (Rep/Cap) Addgene 112865
pAnc80L65AAP Addgene 92307
KP1 (rep/cap) gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
LK03 (rep/cap) gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
pAAV4 (rep/cap) gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNA Addgene 61591
pAAV.MCS Addgene 46954
gBlock (synthetic DNA fragement) IDT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456 (2016).
  2. Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
  3. Lundstrom, K. Viral Vectors in Gene Therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
  4. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  5. Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175 (2015).
  6. Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
  7. Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
  8. Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
  9. Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
  10. Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
  11. Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2021).
  12. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
  13. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  14. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  15. Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662 (2020).
  16. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
  17. Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871 (2021).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
  20. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  21. Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
  22. Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
  23. Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
  24. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  27. Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
  28. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610 (2019).
  29. Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85 (2021).
  30. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  31. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
  32. Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
  33. Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
  34. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  35. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
  36. Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
  37. Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
  38. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  39. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  40. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  41. Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
  42. McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
  43. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
  44. Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
  45. Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439 (2019).
  46. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).

Tags

इस महीने JoVE में अंक 200
अशुद्ध पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benyamini, B., Esbin, M. N.,… More

Benyamini, B., Esbin, M. N., Whitney, O., Walther, N., Maurer, A. C. Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (200), e65572, doi:10.3791/65572 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter