Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Transgen ekspresjon i dyrkede celler ved bruk av urensede rekombinante adenoassosierte virale vektorer

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65572
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

Summary

Rekombinant adenoassosiert virus (rAAV) er mye brukt for klinisk og preklinisk genlevering. En undervurdert bruk for rAAVs er robust transduksjon av dyrkede celler uten behov for rensing. For forskere som er nye innen rAAV, tilbyr vi en protokoll for transgen kassettkloning, råvektorproduksjon og cellekulturtransduksjon.

Abstract

Rekombinante adenoassosierte virale vektorer (rAAV) kan oppnå potent og holdbart transgenuttrykk uten integrering i et bredt spekter av vevstyper, noe som gjør dem til et populært valg for genlevering i dyremodeller og i kliniske omgivelser. I tillegg til terapeutiske anvendelser er rAAVs et nyttig laboratorieverktøy for å levere transgener skreddersydd for forskerens eksperimentelle behov og vitenskapelige mål i dyrkede celler. Noen eksempler inkluderer eksogene reportergener, overuttrykkskasetter, RNA-interferens og CRISPR-baserte verktøy, inkludert de for genombrede skjermer. rAAV-transduksjoner er mindre skadelige for celler enn elektroporering eller kjemisk transfeksjon og krever ikke noe spesielt utstyr eller dyre reagenser for å produsere. Rålysater eller kondisjonerte medier som inneholder rAAV-er kan tilsettes direkte til dyrkede celler uten ytterligere rensing for å transdusere mange celletyper - en undervurdert egenskap ved rAAV. Her gir vi protokoller for grunnleggende transgen kassettkloning og demonstrerer hvordan man produserer og påfører rå rAAV-preparater på dyrkede celler. Som prinsippbevis demonstrerer vi transduksjon av tre celletyper som ennå ikke er rapportert i rAAV-applikasjoner: placentaceller, myoblaster og små tarmorganoider. Vi diskuterer hensiktsmessige bruksområder for rAAV-preparater, rAAVs begrensninger for genfødsler og hensyn til kapsidvalg. Denne protokollen skisserer en enkel, billig og effektiv metode for forskere å oppnå produktiv DNA-levering i cellekultur ved hjelp av rAAV uten behov for arbeidskrevende titrerings- og rensetrinn.

Introduction

Å belyse molekylære baser av cellulære funksjoner krever ofte ekspresjon av transgent DNA i cellekultur. For å komme til uttrykk må transgener trenge gjennom en celles selektive membran og nå kjernen 1,2. Derfor er evnen til effektivt å omgå cellens fysiske barrierer og manipulere dens sentrale prosesser en nødvendighet for å anvende transgenese for å avdekke nye biologiske fenomener. En tilnærming utnytter virusets iboende evne til å levere og uttrykke fremmed DNA 3,4.

Adenoassosiert virus (AAV) er et av de minste pattedyrvirusene: dets 4,7 kilobase (kb), enkeltstrengede DNA-genom inneholder to gener, rep (for replikasjon) og cap (for kapsid), pakket inne i et 60-mer icosahedral kapsid som måler 25 nm. Rep / cap-genene har flere promotorer, leserammer og spleiseprodukter som koder for minst ni unike proteiner som kreves for viral replikasjon, produksjon og emballasje 5,6. I tillegg inneholder begge ender av genomet sekundære strukturer kalt inverterte terminale repetisjoner (ITR) som er nødvendige for DNA-replikasjon, genomemballasje og nedstrømsbehandling under transduksjon 7,8,9,10. ITR er de eneste DNA-elementene som kreves for å pakke genomet inn i kapsiden, og derfor kan AAV klones for transgene leveringsformål ved å erstatte virusrep/cap-genene med forskerens valg av regulatoriske elementer og/eller gener av interesse6. Den resulterende rekombinante AAV (rAAV), med et konstruert vektorgenom (VG), er mye brukt i klinikken for human genterapi og har oppnådd suksess11. En undervurdert bruk av vektoren er i laboratoriet; rAAVs kan effektivt oppnå transgen ekspresjon i dyrkede celler for å oppfylle en forskers eksperimentelle behov12.

Den vanligste metoden for å produsere rAAV er ved trippelplasmidtransfeksjon til HEK293- eller 293T-celler (figur 1). Det første plasmidet, ofte kalt cis-plasmidet, inneholder det ønskede transgenet flankert av ITR (pAAV). Avhengig av applikasjonen er cis-plasmider med vanlige elementer, for eksempel sterke promotorer eller CRISPR-baserte verktøy, tilgjengelige for kjøp. Det andre er pRep/Cap-plasmidet som inneholder villtype-AAV-rep- og cap-genene gitt i trans – dvs. på et separat, ikke-ITR-holdig plasmid som uttrykker regulatoriske og strukturelle elementer som deretter interagerer med cis-plasmidet – og kalles dermed transplasmidet. I tillegg til å fysisk omslutte VG, påvirker kapsidet cellulær tropisme12,13. Ved å gi det serotypespesifikke cap-genet i trans, kan forskere enkelt maksimere transduksjonseffektiviteten ved å velge en optimalisert kapsidserotype for deres gitte målcelle. Til slutt, som et Dependoparvovirus, krever AAV et hjelpervirus for å aktivere rep / cap-uttrykk fra sine virale promotorer, oppnådd av adenovirale hjelpergener, gitt på et tredje plasmid som pAdΔF614,15. Etter 72 timer trippelplasmidtransfeksjon kan vektoren frigjøres fra produsentceller til kulturmediet ved gjentatte fryse-/tinesykluser. Hele plateinnholdet samles deretter, og store cellulære rusk fjernes ved sentrifugering; den resulterende mediesupernatanten er en grov rAAV-forberedelse klar for nedstrøms transduksjoner.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over rAAV vektorproduksjon av råolje. Produksjon og transduksjon av rav rAAV kan oppnås innen 5 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

rAAV kan være gunstigere for transgenlevering sammenlignet med andre transfeksjonsmetoder, som ofte er forbundet med cellulær toksisitet, lav effektivitet og dyre reagenser og utstyr, for eksempel for elektroporering eller kjemisk/lipidbasert transfeksjon16,17. rAAV omgår disse hindringene og gir ofte potent transgenuttrykk med minimal toksisitet og minimal praktisk tid. Det er viktig å produsere rAAV og anvende det i cellekultur er enkelt og krever sjelden rensing av vektoren fra kulturmediet (figur 1). I tillegg integrerer ikke rAAV sin VG i vertsgenomet, i motsetning til lentiviral transgenlevering, og reduserer dermed risikoen for innsettingsmutagenese18. Til tross for de potensielle fordelene ved å bruke rAAV for transgen levering, må begrensninger vurderes. Det er viktig at størrelsen på transgenet, inkludert ITR, ikke bør overstige 4,9 kb på grunn av fysiske begrensninger av kapsiden, og dermed begrense forskerens evne til effektivt å levere store regulatoriske elementer og transgener. Videre, siden rAAV er et ikke-integrerende virus, resulterer transduksjon i forbigående transgenuttrykk i delende celler og kan ikke være praktisk for stabilt uttrykk. Imidlertid kan metoder som bruker doble rAAV-leverte Cas9 og homologi-rettet reparasjon (HDR) maler brukes til å stabilt sette inn sekvenser på bestemte genomiske loci hvis en forsker ønsker19.

Protocol

1. Plasmid oppkjøp

MERK: Denne protokollen vil klone et gen av interesse (GOI) til et ITR-inneholdende plasmid med en cytomegalovirus (CMV) promotor og en SV40 polyadenyleringssekvens (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Imidlertid kan dette plasmidet brukes uten ytterligere kloning for å produsere rAAV-er, og pakke en praktisk dobbel EGFP- og Luciferase-reporter. Plasmider med forskjellige regulatoriske elementer eller for forskjellige applikasjoner, for eksempel for CRISPR-baserte eksperimenter, er tilgjengelige online og vil følge lignende kloningstrinn som de nedenfor (se diskusjon for ytterligere kloningstrinn). I tillegg kan rep/cap, eller trans, plasmider for forskjellige serotyper brukes – denne protokollen vil bruke rep/cap for AAV serotype 2.

  1. Kjøp bakterielle stabs som inneholder et ITR-inneholdende cis-plasmid , et adenovirushjelperplasmid, et rep / cap-plasmid og et plasmid som inneholder en GOI. Strip bakteriene på individuelle agarplater som inneholder antibiotika som er spesifikke for resistensen til hvert plasmid. Inkuber bakteriene ved 30 °C over natten for å vokse.
    MERK: Hvis et plasmid med en GOI ikke er lett tilgjengelig for kjøp, kan et syntetisk DNA-fragment (se materialtabell) kjøpes online. I tillegg kan et syntetisk DNA-fragment brukes til å hoppe over hele PCR-prosessen hvis ønskelig.
  2. Velg en enkelt koloni fra hver plate og dyrk i 3 ml Luria Bertani (LB) buffer supplert med tilsvarende antibiotika ved 30 °C over natten, risting ved 180 o / min. Overfør 1 ml av bakteriene til en steril 250 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 50 ml LB-buffer supplert med tilsvarende antibiotika. Rist ved 30 °C, 180 o / min over natten.
  3. Overfør bakteriene til et 50 ml konisk rør og sentrifuge i 20 minutter ved 3000 x g, romtemperatur. Kast supernatant. Isoler plasmidet ved hjelp av et endotoksin-lavt eller fritt midiprep-sett i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: ITR er ustabile strukturer. For å forhindre ITR-delesjoner eller mutasjoner, bør bakterieceller dyrkes ved 30 °C for å bremse celledeling og redusere replikasjonsfeil. For å øke plasmidutbyttet og renheten er et midiprep- eller maxiprep-sett ideelt. Det anbefales å bruke et endotoksin-lavt eller fritt sett for å redusere nedstrøms endotoksinforurensning av celler. Det er ikke nødvendig å utføre plasmidisolering inne i en avtrekkshette for laminær luftstrøm, da kontaminering av plasmidpreparat ikke er sannsynlig hvis det utføres på en standardbenk.

2. Kloning av interessant gen i AAV ITR-inneholdende plasmid

  1. Åpne plasmidkartet som inneholder GOI i et DNA-visningsprogram.
    MERK: Den fulle kassetten, inkludert ITR-ene, bør ikke overstige 4,9 kb på grunn av kapsidens fysiske emballasjebegrensninger. I tillegg kan PCR-amplifikasjon ikke oppnås gjennom ITR på grunn av sekundære strukturer. Som sådan anbefales ikke Gibson-montering for rAAV-transgen kloning.
    1. Klikk på kategorien Sekvens for å vise hele sekvensen av plasmidet. Bla til 5' mest regionen i GOI-sekvensen og klikk på det første nukleotidet mens du drar innover mot genlegemet for å lage en fremoverprimer. Slipp ut når en smeltetemperatur (Tm) på ~55 °C er nådd.
    2. Klikk Videresend primer. Inkluder sekvensen for et EcoRI-restriksjonssted manuelt (5' GAATTC 3') i den 5'ste enden av primersekvensen. I tillegg legger du til seks ekstra tilfeldige baser på 5 'slutten av dette begrensningsstedet for å tillate enzymet å effektivt samhandle med DNA. Klikk på Legg til primer. Se figur 2 for et representativt eksempel.
    3. Kontroller primeren for å sikre at den ikke kan danne hårnåler eller primerdimerer (unntatt begrensningsstedet som er palindromisk). Hvis hårnåler dannes, endre den tilfeldige sekvensen av de seks ekstra basene. I tillegg må du sørge for at primeren ikke binder seg noe annet sted på plasmidet.
    4. Gjenta trinnene for å lage en omvendt primer på 3 'mest regionen av GOI innover til genlegemet. Klikk på Reverse Primer og inkluder et NotI-begrensningsside (5' GCGGCCGC 3').
      MERK: GOI kan ikke inneholde EcoRI- eller NotI-restriksjonssteder - i så fall må forskjellige restriksjonsenzymer brukes.
  2. Forsterk GOI i en 50 μL PCR-reaksjon. Bruk de nødvendige enkeltkomponentene fra tabell 1.
    1. Plasser reaksjonen i en termosyklist og følg syklusparametrene fra tabell 2 for programmering. Hvis primere har forskjellig T m, bruk den nedre Tm for programmet.
    2. Verifiser amplifisering av riktig PCR-fragment ved å tilsette 1 μL gellastingsfargestoff (6x) til 5 μL PCR-reaksjon. Kjør en DNA-stige og PCR-blandingen på en 0,8% agarosegel som inneholder ethidiumbromid og visualiser med UV-lys.
      FORSIKTIG: Ethidiumbromid er et kjent mutagen.
    3. Hvis et enkelt, spesifikt bånd vises på gelen, må du rense det gjenværende PCR-produktet i PCR-striprøret ved hjelp av et kolonnebasert PCR-oppryddingssett i henhold til produsentens instruksjoner. Hvis flere bånd vises (på grunn av ikke-spesifikk forsterkning), må du skjære det ønskede båndet og rense DNA ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Fordøy det rensede PCR-produktet og pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 ryggradsplasmid i en 50 μL-reaksjon med de nødvendige individuelle komponentene fra tabell 3 i 1 time ved 37 °C. En større mengde pAAV-plasmid-DNA er nødvendig på grunn av forventet ineffektiv gjenvinning etter gelekstraksjon.
    MERK: Restriksjonsenzymene som brukes er high fidelity (HF) versjoner. Vanlig NotI kan ikke brukes med CutSmart buffer. Hvis forskjellige enzymer brukes, kan det være nødvendig med en annen inkubasjonstemperatur og buffer.
    1. Rens det fordøyde PCR-produktet med et kolonnebasert PCR-oppryddingssett i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Forbered det fordøyde pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 ryggradsplasmid for gelelektroforese ved å tilsette 10 μL gellastingsfargestoff (6x) til 50 μL fordøyelsesreaksjon. Legg en DNA-stige, fordøyelsesreaksjon og 250 ng ufordøyd plasmid (negativ kontroll) på en 0,8% agarosegel som inneholder ethidiumbromid med brede tenner. Visualiser med UV-lys, fjern ønsket fragment (~ 4,5 kb), og rens DNA ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Ligat det fordøyde PCR-produktet og fordøyd pAAV-ryggradsplasmid i en 20 μL ligeringsreaksjon med de nødvendige individuelle komponentene fra tabell 4. For å beregne mengden PCR-produkter som trengs, bruk Formel 1. Bruk vanligvis et 3: 1 molforhold mellom PCR-produkt (innsats) og ryggrad (pAAV), med en masse på 50 ng ryggrad.
    Equation 1Formel 1
  5. Utfør en negativ kontroll ved å erstatte PCR-produktet med vann. Inkuber ligeringsreaksjoner ved 16 °C over natten eller ved romtemperatur i 2 timer.
  6. Tine et hetteglass med kompetente, rekombinasjonsfattige bakterieceller (som Stbl3-celler) på is og plasser 50 μL i et 1,5 ml rør. Tilsett 3 μL av ligeringsreaksjonen direkte på cellene og inkuber på is i 30 minutter.
    MERK: ITR er ustabile strukturer og krever derfor rekombinasjonsmangelfulle bakteriestammer for å begrense ITR-delesjon og rekombinasjonshendelser. DH5a-celler kan brukes periodisk til formering (en eller to ganger), men anbefales ikke til langvarig bruk. ITR-integriteten bør kontrolleres regelmessig etter midiprep rensing.
    1. Varmesjokk bakteriene i et vannbad på 42 °C i 30 sekunder, og overfør deretter umiddelbart til is i 2 minutter. Tilsett 200 μL LB-buffer og rist i 1 time ved 30 °C, 180 o / min.
    2. Fordel 125 mikrol av blandingen på en agarplate med tilsvarende antibiotika og inkuber over natten (~18 timer) ved 30 °C. Plukk flere kloner og legg hver i et sterilt plastkulturrør med 3 ml LB som inneholder tilsvarende antibiotika. Inkuber risting over natten ved 30 °C, 180 o / min.
      MERK: For å forhindre ITR-delesjoner eller mutasjoner, bør bakterieceller dyrkes ved 30 °C for å bremse celledeling og redusere replikasjonsfeil. I tillegg bør mindre kolonier velges, da de uten ITR kan ha en vekstfordel i forhold til andre.
    3. Pipett 1,8 ml av hver kultur i et 2 ml rør og sentrifuge ved 6000 x g i 3 minutter, romtemperatur. Isoler DNA ved hjelp av et miniprep-sett. Oppbevar de resterende 1,2 ml kulturen ved 4 °C. Bekreft korrekte kloner ved DNA-sekvensering eller diagnostisk restriksjonsenzymfordøyelse.
      MERK: Sanger-sekvensering av innsatsen anbefales, men prosessivitet gjennom ITR kan ikke oppnås med standardmetoder. ITR bør verifiseres ved begrensningssammendrag som beskrevet nedenfor.
    4. Tilsett 50 ml LB-buffer inneholdende tilsvarende antibiotika til en steril 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Tilsett 500 μL av den gjenværende kulturen til kolben og rist ved 30 °C, 180 o / min til en OD600 på 0,2-0,5 er nådd (~ 18 timer). Overfør bakteriene til et 50 ml konisk rør og sentrifuge i 20 minutter ved 3000 x g, 4 °C. Isoler DNA ved hjelp av et endotoksin-lavt eller fritt midiprep-sett.
    5. Sjekk ITR-integriteten med 20 μL diagnostisk restriksjonsenzymfordøyelse ved bruk av XmaI (eller SmaI). Forbered en reaksjon som inneholder 500 ng plasmid, 0,5 μL enzym og 1x buffer; ruge i 1 time ved 37 °C. Kjør reaksjonen på en 0,8% agarose-gel. Hvis ITR er intakte, vil fordøyelsen gi et bånd på ~ 2.9 kb og et annet bånd på størrelse med kassetten. Hvis dette distinkte båndet ikke observeres, kan det hende at ITR ikke er intakt, og kloning må gjøres om.
      MERK: Plasmider som inneholder XmaI (eller SmaI ) restriksjonssteder (i tillegg til de i ITR) vil ha flere bånd vises på gelen.

Figure 2
Figur 2: Representativt eksempel for primerdesign. Forover og bakover primer design for en mScarlet transgen (representativt eksempel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Beløp Komponent
X μL Mal DNA (25 ng)
1 μL F-grunning (10 μM)
1 μL R-primer (10 μM)
1 μL dNTP (10 mM)
10 μL Phusion Buffer (5x)
1 μL Phusion Polymerase
X μL Vann
50 μL Siste bind

Tabell 1: PCR-amplifikasjonsreagenser. De nødvendige komponentene for en vellykket PCR-reaksjon.

Skritt Temperatur Tid
Innledende denaturering 98 °C 1 min
30 sykluser 98 °C 10 s
TM av primer 30 s
72 °C 30 s per kb
Endelig forlengelse 72 °C 10 min
Holde 4 °C Uendelige

Tabell 2: PCR-amplifikasjonsprogrammering. De nødvendige sykliske parametrene for en vellykket PCR-reaksjon.

Beløp Komponent
X μL PCR-produkt (1μg) eller pAAV-plasmid (3μg)
5 μL Buffer (10x)
1 μL EcoRI-HF
1 μL IkkeI-HF
X μL Vann
50 μL Siste bind

Tabell 3: Fordøyelsesreagenser. De nødvendige komponentene for en vellykket fordøyelsesreaksjon.

Beløp Komponent
X μL Sett inn (X ng)
X μL Ryggrad (50 ng)
2 μL T4 DNA ligase buffer (10x)
1 μL T4 DNA-ligase
X μL Vann
20 μL Siste bind

Tabell 4: Ligeringsreagenser. De nødvendige komponentene for en vellykket ligeringsreaksjon.

3. Vektorproduksjon med trippel-plasmidtransfeksjon

MERK: Følgende verdier er optimalisert for en enkelt brønn på en 6-brønns plate som gir et endelig råprepareringsvolum på 2 ml. Alle verdier kan skaleres opp med 10x for en 15 cm plate som gir et endelig volum på 20 ml eller skaleres ned med 4x for en 24-brønns plate med et endelig volum på 500 μL.

  1. Lag en 1 μg/μL polyetyleniminhydroklorid (PEI) MAX ved å løse opp 100 mg PEI MAX i 100 ml destillert vann. Juster pH til 7,1 med NaOH. Filtrer steriliser blandingen med et 0,22 μm filter og frys 1 ml alikoter ved -20 °C for langtidslagring. Etter opptining skal reagenset oppbevares i 1 måned ved 4 °C.
  2. Frø 3 x 10 5 HEK293 eller HEK293T celler i en 6-brønnsplate med forvarmet Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM,4,5 g / l glukose, 110 mg / L natriumpyruvat) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS). Vokse til ~75%-90% konfluens i et inkubatorsett ved 37 °C og 5% CO2 (figur 3).
    MERK: Celler dyrket med penicillin / streptomycin (P / S) har blitt observert å redusere vektorproduksjonsutbyttet. Bruk av riktig steril teknikk omgår behovet for å bruke P/S, og det anbefales derfor ikke å dyrke HEK293-celler med antibiotika20. Hvis P/S kreves ved nedstrøms transduksjoner, anbefales det å tilsette P/S til råpreparering etter høsting.
  3. I et 2 ml rør fremstilles en blanding inneholdende 1,3 μg pAAV2/2 (Rep/Cap, serotype 2), 1,3 μg pAAV.GOI, 2,6 μg pAdΔF6 og serumfri (SF) DMEM (4,5 g/l glukose, 110 mg/l natriumpyruvat) til et totalvolum på 100 μL (se tilleggstabell 1 for praktiske beregninger).
  4. Forbered en negativ kontroll i et separat rør ved å erstatte pRep / Cap med ikke-relatert plasmid. Den negative kontrollen står for uemballert pAAV.GOI-plasmid som er tilstede i det rå preparatet som muligens kan transfektere celler under transduksjon, selv om det er sjeldent.
    MERK: Endotoksin-lav eller -fri maxiprep eller midiprep plasmid er ideelt for trippel-transfeksjon og produserer generelt høyere titervektor sammenlignet med miniprep DNA, selv om miniprep DNA kan brukes til rask og skitten foreløpig testing.
  5. Tilsett 5,2 μl PEI MAX til plasmidblandingen; dette er en plasmid: PEI-blanding med et forhold på 1: 1. Bland godt ved å pulsere 10-15 ganger på en virvelmikser satt til 7. Hvis flere vektorpreparater produseres, tilsett PEI til hver plasmidblanding ved forskjøvne tidsintervaller på 1 min (dvs. preparat 1 ved t = 0 min, preparat 2 ved t = 1 min, etc.) for å tillate tilstrekkelig timing for å aspirere brønner og fortynne reaksjonen i de følgende trinnene.
    MERK: Et 1:1-forhold mellom plasmid:PEI har blitt observert å være optimalt. Imidlertid kan enkelte brukere optimalisere dette forholdet for maksimal effektivitet. Se diskusjonen om hvordan PEI-optimalisering skal utføres (se også tilleggstabell 2).
  6. Inkuber hvert rør i nøyaktig 15 minutter og fortynn deretter reaksjonen med 1,9 ml SF DMEM (4,5 g / l glukose, 110 mg / l natriumpyruvat) for et endelig volum på 2 ml. Pipetter forsiktig 2x for å blande. Overblanding vil forstyrre plasmid/PEI-komplekser og resultere i lavere transfeksjonseffektivitet.
  7. Aspirer medier fra brønnen og tilsett plasmid: PEI-blanding forsiktig på brønnsider for å forhindre cellulær løsrivelse. Inkuber celler i 72 timer ved 37 °C og 5% CO2. Cellelyse og avløsning under inkubasjon er en normal prosess med rAAV-produksjon (figur 4).

Figure 3
Figur 3: HEK293-celler klare for transfeksjon. Den ideelle konfluensen (75% -90%) av HEK293-celler som trengs for trippel-plasmidtransfeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: HEK293-celler etter transfeksjon. Utseendet til HEK293-celler før og etter 1, 2 eller 3 dager etter transfeksjon med pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 og 1:1-forholdet mellom plasmid:PEI . Skala barer: 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Høsting av råvektorpreparater

  1. Frys hele platen med transfekterte celler i 30 minutter ved -80 °C, etterfulgt av opptining i 30 minutter ved 37 °C. Gjenta i totalt tre fryse-/tinesykluser. Ikke fjern lokket – platen må forbli steril inni. Platene kan forbli ved -80 °C til de er klare til å gå videre til neste trinn.
    MERK: En ikke-fuktet inkubator fungerer best for tining, noe som minimerer kondens på utsiden av platene som kan føre til utilsiktet forurensning.
  2. Utfør følgende to trinn i en avtrekk for laminær luftstrøm ved hjelp av aseptiske teknikker. Bland hver brønn ved pipettering for å sikre maksimal forstyrrelse av celler. Overfør lysat til et 2 ml rør og sentrifuge i 15 minutter ved 15 000 x g, romtemperatur for å fjerne celleavfall.
  3. Overfør supernatanten forsiktig til et nytt 2 ml rør. Dette grove preparatet kan brukes umiddelbart uten titrering eller rensing. Vektoren kan lagres ved 4 °C i flere måneder eller -20 °C i årevis.
    MERK: Om nødvendig kan titere beregnes ved kvantitativ PCR (qPCR) ved å kvantifisere antall vektorgenomer (VG) inne i DNase-resistente partikler. Som sådan er titere gitt i enheter av VG / ml. Vektor lagret i flere måneder ved 4 °C bør titreres på nytt før bruk, da vektoren kan aggregere og/eller binde rørvegger, noe som reduserer titeren av preparatet.

5. Transduksjon

  1. Plate ønsket celletype (f.eks. Huh7) i en 96-brønnsplate ved en målkonfluens på 50% -75%, avhengig av transduksjonsvarigheten. Større konfluens kan gi redusert AAV-transduksjonseffektivitet.
  2. Legg vektor (f.eks. CMV.mScarlet) til celler uten å kjenne titeren til råpreparatet for applikasjoner der dosen ikke er relevant, for eksempel å teste et panel av kapsider for transduksjon i en ny celletype. Utfør en 1:3 fortynningsserie av råpreparatet i serumfrie (SF) medier for å oppnå den optimale mengden vektor som kreves for applikasjonen. Aspiratmedier fra 96-brønnsplate og tilsett 50-100 μL fortynnet råoljepreparasjon til brønner. Inkuber celler ved 37 °C og 5% CO2.
    MERK: Serum kan inneholde antistoffer som kan nøytralisere AAV-vektoren og redusere transduksjonseffektiviteten. Serum kan imidlertid brukes under transduksjon for sensitive celletyper.
  3. Fjern vektoren etter 48 timer etter transduksjon (hpt) og vask cellene en gang med forvarmet fosfatbufret saltvann (PBS). Vektorer kan også fjernes og erstattes med serumholdige medier så snart 2 hpt for sensitive celletyper. For mange applikasjoner, utfør inkubasjon over natten for å transdusere celler og erstatte brønner med ferske serumholdige medier om morgenen. Robuste celletyper, som Huh7 og U2-OS, krever ikke medieendring.
  4. Avslutt transduksjon ved å fikse celler i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter. Ulike termineringsmetoder kan også brukes basert på applikasjonen (f.eks. lysis). For de fleste celletyper forekommer topputtrykk med 48 hpt og er dermed et vanlig eksperimentelt endepunkt.

6. Variasjoner på transduksjonsmetode etter celletype

MERK: Ulike celletyper krever forskjellige kulturforhold. Derfor bør addisjon av vektor for transduksjon optimaliseres basert på behovene til celletypen. Nedenfor er svært spesifikke transduksjonsprotokoller for celletypene som inngår i de representative resultatene, som illustrerer noen variasjoner av transduksjonsprotokoller som en forsker kan ønske å prøve for sine egne behov.

  1. Mus små tarmorganoider
    1. Utled mus små tarmorganoider (mSIOs) fra en liten tarmkrypt prep fra C57BL/6J mus. Legg inn organoider i 90% kjellermembranmatrise og kultur i 24-brønnsplater som inneholder enten organoid vekstmedium (uten antibiotika) eller pre-transduksjonsmedium (50% Wnt3a-betinget medium [produsert internt ved bruk av L Wnt-3A-celler i organoid vekstmedium], 10 mM nikotinamid, 10 μM ROCK-hemmer og 2,5 μM CHIR99021) i en passasje (5-7 dager) før transduksjon ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Før transduksjon, skyll organoider med D-PBS, forstyrr kjellermembranmatrikskupler ved pipettering, og dissosiere organoider i småcelleklynger ved å inkubere dem i dissosiasjonsmedium i 10 minutter ved 37 ° C og videre pipettering.
    3. Stopp celledissosiasjonsprosessen ved å legge til 5% FBS i DMEM / F-12 med 15 mM HEPES, overfør celleklynger til sentrifugerør og samle celleklynger ved sentrifugering i 5 minutter ved 1000 x g, romtemperatur.
    4. Resuspender celleklyngene i transduksjonsmedium (pre-transduksjonsmedium inneholdende 10 μg/ml polybren eller organoid vekstmedium inneholdende 10 μg/ml polybren) og overfør til 48-brønnsplater, etterfulgt av tilsetning av AAV-råpreparater som inneholder CMV.mScarlet for transduksjon.
    5. Utfør transduksjon av organoider ved å sentrifugere platen i 1 time ved 600 x g og 37 °C og deretter inkubere ved 37 °C i ytterligere 6 timer. Samle transduserte organoider i 1,5 ml mikrosentrifugerør, sentrifuge i 5 minutter ved 1000 x g, romtemperatur og legg på is.
    6. Etter fjerning av supernatanten, resuspenderes transduserte organoider i 90% basalmembranmatrise i pre-transduksjonsmedium eller organoid vekstmedium og frødråper på 20 μL i en brønn av et forvarmet kammerdekselglass.
    7. Etter inkubering i 10 minutter i inkubatoren, legg dråpen i 350 μL pre-transduksjonsmedium eller organoid vekstmedium og inkuber ved 37 ° C i inkubatoren. Bestem transduksjonseffektiviteten 2-5 dager etter transduksjon ved å avbilde de transducerte organoider på et konfokalmikroskop og estimere prosentandelen røde fluorescerende celler per organoid.
  2. BeWo-celler
    1. Ved 24 timer før transduksjon, plate humant placenta choriocarcinoma BeWo-celler ved 10.000 celler per brønn med 96-brønnplate. Fortynn emballasje for AAV-preparater CMV.mScarlet til 1:1 i serumfritt F12-K BeWo-medium opp til et totalt volum på 50 μL per brønn. Aspiratmedium fra brønn og erstatt med 50 μL fortynnet AAV per brønn.
    2. Inkuber celler ved 37 ° C over natten (~ 18 timer) og tilsett deretter 100 μL F12-K BeWo-medium som inneholder 10% FBS for å få opp totalvolumet til 150 μL. Inkuber celler i ytterligere 6 timer for totalt 24 timer etter transduksjon (hpt).
    3. For avbildning, flekk levende celler med Hoechst-fargestoff i 30 minutter i F12-K-medium, bytt deretter mediet for fenolfritt DMEM som inneholder 10% FBS, 1x glutamakstilskudd og 1x natriumpyruvattilskudd for avbildning. Utfør levende celleavbildning på et konfokalmikroskop ved hjelp av DAPI (for Hoechst imaging) og mCherry (for mScarlet imaging) filtersett med 37 ° C og 5% CO2.
  3. Hepa1-6 og Huh7 celler
    1. Platemurine Hepa1-6 leverceller og humane Huh7 leverceller i DMEM (4,5 g / l glukose, 110 mg / L natriumpyruvat, 10% FBS) ved 5000 celler per brønn i en 96-brønnplate 24 timer før transduksjon.
    2. Tilsett 50 μL ufortynnede AAV-preparater som inneholder CMV.mScarlet direkte til cellene og inkuber ved 37 °C i 48 timer. Vask celler en gang i PBS, fest i 4% PFA, og beis med Hoechst-fargestoff i 10 minutter. Utfør avbildning på et konfokalmikroskop ved hjelp av DAPI (for Hoechst imaging) og mCherry (for mScarlet imaging) filtersett.
  4. C2C12- og HSkMC-celler
    1. Plate udifferensierte murine C2C12 myoblaster og udifferensierte humane primære skjelettmuskelceller (HSkMC) myoblaster ved 5000 celler per brønn av en 96-brønnplate, 72 timer før transduksjon.
    2. Fortynnet emballasje for AAV-preparater av rå CMV.mScarlet til 1:1 i DMEM (4,5 g/l glukose, Penn/Strep, 20 % FBS) for C2C12-myoblaster eller vekstmedier for skjelettmuskulatur for HSkMC-myoblaster. Differensiere HSkMC myoblaster til myotuber ved å endre media til differensieringsmedier.
    3. Inkuber myoblaster og myotuber i fortynnede AAV-preparater i 24 timer ved 37 °C. Stain levende celler med Hoechst fargestoff i 10 min og bilde på et konfokalmikroskop ved hjelp av DAPI (for Hoechst imaging) og mCherry (for mScarlet imaging) filtersett.

Representative Results

Finne optimal kapsid for transdusering av dyrkede celler av interesse
En rekke celletyper ble transdusert for å bestemme tropismen til forskjellige kapsidserotyper (figur 5). De naturlige serotypene AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 og de konstruerte kapsidvariantene Anc80 25, DJ 26, LK0327 ogKP1 28 ble pakket med et vektorgenom som uttrykker mScarlet under en CMV-promotor, klonet ved hjelp av metodene gitt i denne protokollen. Ikke-titrerte råvektorpreparater ble fortynnet i passende kulturmedier, og celler ble transdusert i 24+ timer og avbildet (figur 5B). Transduksjonseffektivitet ble beregnet av andelen totale celler som var mScarlet +, eller andelen celler i et enkelt z-plan som var mScarlet + (for mus små tarmorganoider; Figur 5C). Transduksjonseffektivitet (mScarlet+-celler) er ikke gitt for differensierte C2C12- og HSkMC-myotuber, men heller for udifferensierte C2C12- og HSkMC-myoblaster (figur 5A).

AAV2 og KP1 var de mest potente serotypene på tvers av cellelinjer som ble testet (figur 5A). Det ble også observert at lignende celletyper som stammer fra forskjellige arter, blir transdusert med varierende effektivitet. For eksempel viser Hepa1-6 (en murin-avledet levercellelinje) en markert reduksjon i transduksjon sammenlignet med Huh7 (en menneskeavledet levercellelinje) ved bruk av AAV2 (figur 5B). Videre spiller ulike medieforhold en viktig rolle under transduksjon. Mus små tarmorganoider (mSIOs) dyrket i pre-transduksjonsmedier er mindre effektivt transdusert sammenlignet med de som dyrkes i organoid vekstmedia (figur 5C). I tillegg transduserer AAV2 effektivt udifferensierte HSkMC-myoblaster og differensierte HSkMC-myotuber (figur 5B), selv om kvantitativ analyse av myotuber er vanskelig og derfor ikke er gitt.

Den høye transduksjonseffektiviteten observert for ulike celletyper i figur 5 viser at råvektorpreparater kan brukes effektivt til å transdusere en rekke celletyper uten ytterligere trinn som rensing og titrering. Imidlertid bør nøye vurdering gis når du velger et kapsid for å maksimere transgen levering. Mange andre cellelinjer og kapsider har tidligere blitt testet og er publisert, men med rensede vektorpreparater12.

En vektorpartikkeluavhengig effekt av medieforhold kan påvirke effektiviteten av transduksjon. Imidlertid er det generelt akseptert at tropisme (dvs. celletypespesifikt opptak og uttrykk av vektor) er en egenskap som er kapsidspesifikk29. En sammenligning mellom dosematchede råoljepreparater og rensede preparater er ennå ikke observert å påvirke cellulær tropisme. Derfor kan råvektorpreparater brukes på lignende måte som rensede vektorer i cellekultur.

Figure 5
Figur 5: Rå vektortransduksjon av ulike celletyper . (A) Prosentandel av mScarlet+ etter tilsetning av forskjellige AAV-vektorer som inneholder et mScarlet transgen. (B) Celler som uttrykker mScarlet levert fra AAV serotype 2. Skalastenger: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 og HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Forkortelser: hpt = timer etter transduksjon. (C) Små tarmorganoider (mSIOer) fra mus ble enten rAAV-behandlet i pre-transduksjonsmedier eller organoide vekstmedier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell 1: Trippel plasmidtransfeksjonsregneark. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: Regneark for PEI-optimalisering. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Kloning
Kloningsprotokollen er ikke begrenset til pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40-plasmidet som brukes ovenfor, og kan enkelt endres basert på forskerens eksperimentelle behov. Mange ITR-holdige plasmider er lett tilgjengelig online for kjøp. For eksempel er plasmider som inneholder både Cas9 og et sgRNA-kloningssted tilgjengelige, men krever få ekstra trinn som oligonukleotidglødning og PNK-behandling30. I tillegg kan plasmider som inneholder et multippel kloningssted (MCS) med bare ITR og ingen indre regulatoriske elementer finnes31. Hvis forskjellige plasmider skal brukes, er restriksjonsenzymene (RE) som brukes til fordøyelsen vanligvis de eneste elementene som kanskje må endres i denne protokollen. En begrensning ved rAAV er imidlertid den begrensede lastekapasiteten. På grunn av kapsidens fysiske begrensninger bør vektorgenomet ikke overstige 4,9 kb, inkludert ITR-ene.

Når du isolerer plasmid fra bakterier, er det viktig å bruke et endotoksin-lavt eller fritt midiprep- eller maxiprep-sett for å redusere skade på celler under trippelplasmidtransfeksjon eller transduksjon. Plasmid fra miniprep-sett inneholder ofte høyere urenheter, reduserte konsentrasjoner og færre supercoiled DNA, som alle kan påvirke nedstrømsproduksjonen av rAAV og anbefales derfor ikke.

Det er viktig å forstå strukturen og egenskapene til ITR under kloning. For det første er det ekstremt vanskelig å bruke PCR gjennom ITR. Kloning av design som krever PCR-forsterkning gjennom ITR bør unngås, og i tillegg begrense bruken av Gibson-monteringskloningsteknikken. Som sådan er kloning av restriksjonsenzymer den foretrukne metoden for kloning i ITR-holdige plasmider. Videre kan det hende at visse primere for Sanger-sekvensering ikke er kompatible hvis det sekvenserte området inneholder ITR. I stedet anbefales det å bruke primere som sekvenserer vekk fra ITR-ene og inn i vektorgenomkroppen for å få mer presise sekvenseringsresultater. For det andre er ITR utsatt for delesjoner, omorganiseringer og mutasjoner når de transformeres til bakterier for plasmidamplifikasjon32,33. For å redusere disse hendelsene anbefales det å bruke kompetente bakteriestammer med rekombinasjonsmangel, som Stbl3, og inkubere dem ved 30 °C for å bremse celledelingen. Til slutt har det blitt observert at mindre kolonier kan korrespondere med kloner uten omorganiseringer eller slettinger, da de uten ITR kan gi en vekstfordel og være større. Derfor anbefales det å velge kolonier som er små.

Vektor produksjon
Den vellykkede produksjonen av rAAV-vektor kan påvirkes av flere elementer. En kritisk faktor er helsen til HEK293 eller 293T-celler som brukes til transfeksjon. Generelt er lave passasjenumre ideelle, da høyt passasjerte celler kan utvise genotypiske og fenotypiske varianser som kan redusere rAAV-titer. I tillegg bør tettheten av de frøede cellene være 75% -90% sammenløp for effektiv produksjon. Spredte celler genererer lave vektorutbytter fordi det er færre celler tilgjengelig for å produsere vektorer, mens overgrodde celler ikke vil bli effektivt transfektert.

Variasjoner mellom reagenspartier, cellelagre og generell lab-til-lab-variabilitet bidrar til forskjeller i transfeksjonseffektivitet og produksjonstiter. En optimaliserbar faktor som kan føre til titerforbedringer er plasmid: PEI-forholdet i transfeksjonsreaksjoner. Det er viktig å bruke fersk (<1 måned gammel) PEI MAX. Det anbefales at et plasmid:PEI-forhold på 1:1 brukes som utgangspunkt, og hvis transfeksjons- eller transduksjonseffektiviteten virker dårlig, test flere forskjellige forhold. Titeroptimalisering er enklest hvis du bruker et transgen med en visuell avlesning, for eksempel CMV.Luc.IRES.EGFP-reporteren trangene som brukes her som utgangsmateriale for kloning. For å utføre optimaliseringen, følg protokoll trinn 3 ved hjelp av en 12-brønns plate og skalering ned plasmidmassene og reagensvolumene med to (endelig plasmidmasse er 2,6 μg). Juster PEI-volumet tilsvarende for å korrespondere med forhold fra 1:0,75 til 1:3, med økende økninger på 0,25 (figur 6). Fortynn hver reaksjon med 950 μL SF-medier etter 15 minutter. For enkelhets skyld kan en masterblanding som inneholder trippelplasmidene lages og pipetteres individuelt i 1,5 ml rør før tilsetning av PEI-se tilleggsfil 2. Høst vektoren, transdusere celler av interesse og bilde. Brønnen med høyest transduksjonseffektivitet (andel GFP+ celler) tilsvarer det høyeste titer og mest optimale forholdet mellom PEI:DNA.

Figure 6
Figur 6: Arbeidsflyt for PEI-optimalisering. Skjematisk av trinnene som kreves for PEI-optimalisering. Flere forhold mellom plasmid: PEI testes for å bestemme det optimale forholdet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Høste- og titerhensyn
Fryse-/tineteknikken som brukes til å høste rAAV-vektor, lyser effektivt HEK293-celler på en måte som er kompatibel med direkte bruk av det klargjorte lysatet for å transdusere dyrkede celler. Visse rAAV-serotyper, som AAV1, AAV8 og AAV9, frigjøres fra celler under vektorproduksjon og kan høstes fra det dyrkede cellemediet uten fryse-/tinesykluser34. Metoden beskrevet her gir typisk titere i størrelsesorden 1 x 10 10 VG/ml ved bruk av AAV2-kapsider, og 1 x10 11 VG/ml for AAV8. Mens høyere titere kan oppnås ved vaskemiddel eller annen kjemisk basert lysis, er disse skadelige for celler i nedstrøms bruk og krever at rAAVs blir ytterligere renset fra lysatet. Lavere titer er en avveining en forsker bør vurdere når man skal avgjøre om råpreparater passer for deres forskningsbehov, men de marginalt lavere titere produsert av metodene beskrevet her kan transdusere mange celletyper veldig bra (se representative resultater). I tillegg til transfeksjonseffektivitet og cellehelse, varierer vektortitere avhengig av kapsidet som brukes under rAAV-produksjon og størrelsen og sekvensen av transgenet i VG35.

Ved høsting av råvektorpreparater kan plasmid-DNA som ble brukt under trippelplasmidtransfeksjon være tilstede og, selv om det er sjeldent, resultere i nedstrøms transfeksjon under transduksjon. Videre kan uemballerte VG-er binde seg til utsiden av kapsider og påkalle en medfødt immunrespons mot nakent og fremmed enkeltstrenget DNA36,37. Derfor kan sensitive celletyper kreve at vektorpreparater fordøyes og renses for å fjerne uemballerte VG-er og plasmid.

Hvis man ønsker å beregne titer av et råpreparat, kan qPCR utføres for å kvantifisere antall pakkede VG inne i DNase-resistente partikler (DRP). Kort fortalt fordøyes en liten mengde råpreparat for å fjerne plasmid-DNA, forurensende nukleinsyrer eller delvis pakket VG. Prøven blir deretter gjenstand for qPCR og den beskyttede VG inne i DRPs kvantifiseres, noe som resulterer i en titer med enheter vektorgenom per ml råpreparat38. Det anbefales ikke å utføre vektortitrering ved bruk av ELISA-baserte analyser som kvantifiserer kapsidtiter. Sammenlignet med villtype AAV-virus lider rAAV av en andel tomme og delvis pakkede kapsider39. ELISA vil kvantifisere alle kapsider uavhengig av genominnholdet og vil overvurdere de overførbare enhetene som er tilstede i et preparat, noe som krever en pakket VG.

Transduksjon betraktninger
Mange faktorer påvirker rAAV-transduksjoner, og det bør tas riktige hensyn for ethvert nytt eksperiment. Avhengig av promotoren som driver transgenuttrykk, kan uttrykksutbrudd oppstå så tidlig som 4 timer etter transduksjon (hpt), og topputtrykk oppnås vanligvis ved 48 hpt. Det er viktig å huske på varigheten av tiden fra den første såingen av celler til det eksperimentelle endepunktet. Dette er for å estimere startkonfluensen til cellene og sikre at de ikke vokser over ved slutten av forsøket. Hvis celler blir overkonfluerende, kan cellulær oppførsel endres på grunn av en stressrespons og kan forvirre eksperimentelle resultater. Noen celletyper, som U2-OS, tåler overvekst/kontakthemming ganske godt. I tillegg tåler de lange perioder (48 h+) i serumfritt kondisjonert medium – produktet av denne produksjonsprotokollen. Imidlertid kan sensitive celletyper kreve serumtillegg eller fortynning av råpreparatet med spesielt vekstmedium for å opprettholde helsen under transduksjon. En noe redusert transduksjonseffektivitet ved bruk av serumholdige medier er en potensiell avveining for cellehelse og bør vurderes av forskeren.

Vanligvis, for raskt delende celler, er en startkonfluens på rundt 50% optimal for applikasjoner som vil bli avsluttet 48 hpt. Imidlertid kan sammenløp justeres tilsvarende basert på eksperimentets behov. Det anbefales ikke å transdusere monolayer-type immortaliserte cellelinjer over 75% konfluens på grunn av redusert transduksjonseffektivitet. De fleste dyrkede celletyper blir vellykket transdusert og friske etter inkubasjon over natten med rå rAAV-preparater, etterfulgt av bytte til ferske serumholdige medier om morgenen.

Kapsidserotype er en viktig faktor å vurdere når man produserer rAAV for å transdusere en målcelle, da kapsidet er den primære determinanten for cellulær tropisme og påfølgende transgenuttrykk13. AAV2 er en mye brukt serotype på grunn av sin evne til effektivt å transdusere mange typer dyrkede celler12. Denne egenskapen til AAV2 kan tilskrives heparinsulfatproteoglykaner (HSPG) som tjener som den primære vedleggsfaktoren for AAV2 og de høye nivåene av HSPG på dyrkede celler fra tilpasningen til å vokse i en tallerken40. Andre kapsider, som AAV9, er mindre effektive til å transdusere brede celletyper og kan forklares av deres avhengighetstilknytningsfaktorer som ikke uttrykkes i denne innstillingen41. Vi anbefaler derfor AAV2 som førstevalgskapsid i dyrkede celler dersom ønsket målcelle ikke tidligere er testet med rAAV i litteraturen.

Vær oppmerksom på at en stor begrensning for råvektorpreparater er at de er upassende for å transdusere dyremodeller. In vivo studier krever preparater som skal renses og gjennomgå kvalitetsvurdering.

Transgene uttrykk og potensielle integrasjonshensyn
rAAVs resulterer ikke pålitelig i permanent ekspresjon av transgenet. Over tid kan VGs bli fortiet og transgene uttrykk kan bli stengt etter flere passasjer42. I tillegg forblir flertallet av VG-er episomale, og rAAV-er inneholder ikke virale Rep-proteiner som vil formidle hyppig integrasjon i vertsgenomet som i en villtype viral lysogen infeksjon eller fremme replikasjon av VGs43. Som et resultat vil episomer i transducerte celler etter hvert bli fortynnet ut blant datterceller gjennom divisjoner.

Basal-nivå integrasjon er en mulighet for alt levert transgent DNA-materiale. ITR-holdige VG-er er imidlertid utsatt for integrasjon med høyere frekvens44. Derfor kan permanent ekspresjon av et transgen observeres i en liten delmengde av celler. Brukere bør vurdere denne muligheten spesielt når de bruker rAAV til å levere DNA-skjærende enzymer, som Cas9, da dobbeltstrengede brudd kan resultere i en enda større frekvens av integrasjon og permanent uttrykk45. Selv om dette gjør rAAV til en god kandidat for å levere homologirettede reparasjonsmaler for endogen merking eller genaddisjon, bør muligheten for Cas9-innsetting vurderes19,46.

Disclosures

A.C.M. er konsulent for Janssen Pharmaceuticals og sitter i SAB for NewBiologix. Alle de andre forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Vi takker Robert Tjian og Xavier Darzacq for deres støtte og bruk av laboratorieutstyr. Vi takker Kay for hans gave av KP1 og LK03 rep / cap plasmider, og Luk Vandenberghe for AAV4 rep / cap plasmid. Finansiering ble gitt av Howard Hughes Medical Institute (34430, RT) og California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. NW anerkjenner finansiering fra Berkeley Stem Cell Center via et Siebel postdoktoralt stipend og fra den tyske forskningsstiftelsen (DFG) via et Walter Benjamin-stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Snapgene DNA viewing sofrware Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 AddGene 105533
pAAV2/2 (Rep/Cap) AddGene 104963
pAdΔF6 AddGene 112867
LB Agar Carbenicillin Sigma-Aldrich L0418
Boekel Scientific Economy Digital Incubator Boekel Scientific 133000
LB medium, powder MP Biomedicals 113002042
Carbencillin (Disodium) GoldBio C-103-5
New Brunswick I26 Shaker Eppendorf M1324-0000
50 mL Centrifuge Tubes Corning 430828
Centrifuge 5810 R Eppendorf 22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit Qiagen 12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS USA Scientific 1402-3900
Mastercycler nexus Eppendorf 6333000022
dNTP Thermo Fisher Scientific 18427013
5x Phusion Buffer NEB B0518S Provided with purchase of Phusion Polymerase
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
Gel Loading Dye, Orange (6X) NEB B7022S
DNA Clean & Concentrator-100 Zymo D4029
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo D4001
NotI-HF NEB R3189S
EcoRI-HF NEB R3101S
CutSmart Buffer (10x) NEB B6004S Provided with purchase of restriction enzyme
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500100
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E1510
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with purchase of T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) Eppendorf 22363204
Precision Microprocessor Water Bath Thermo Scientific 51221046
Sterile Plastic Culture Tubes Fisher Scientific 149566B
2.0 mL Microcentrifuge Tube Thomas Scientific 1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - Classic Zymo D4015
Xma1 NEB R0180S
Sma1 NEB R0141S
HEK 293T cells ATCC CRL-3216
Falcon 6-well Corning 353046
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate Thermo-Fisher 11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator Marshall Scientific MCO-18AIC
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) Polysciences 24765-100
Mixer Vortex Genie 2 Electron Microscopy Sciences 102091-234
Sanyo Ultra Low Freezer Sanyo 14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 with transparent window VWR 390-0384
Eppendorf Microcentrifuges Eppendorf 05-400-005
Falcon 96-well Corning 353072
C57BL/6J mice JAX strain #000664
organoid growth medium STEMCELL Technologies 6005
L Wnt-3A cells ATCC CRL-2647
nicotinamide Sigma N0636-100G
ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302
CHIR99021 STEMCELL Technologies 72052
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Fisher 356231
24-well plate Fisher 08-772-1
D-PBS Thermo Fisher Scientific 14-190-250
TrypLE Express Fisher 12604013
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES STEMCELL Technologies 36254
polybrene Millipore Sigma TR-1003-G
48-well plates Fisher 08-772-3D
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Fisher 12-565-470
BeWo cells ATCC CCL-98
F-12K Medium ATCC 30-2004
Hepa1-6 ATCC CRL-1830
Huh7 UC Berkeley BSD Cell Culture Facility HUH-7
C2C12 ATCC CRL-1772
HSkMC ATCC PCS-950-010
Skeletal Muscle Cell Growth Medium Sigma C-23060
Skeletal Muscle Differentiation Medium Sigma C-23061
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope Fisher Scientific 12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix Perkin Elmer HH14001000
PhenoPlate 96-well Perkin Elmer 6055302
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Thermo-Fisher 31053028
GlutaMAX Supplement Thermo-Fisher 35050079
Sodium Pyruvate Thermo-Fisher 11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap) Addgene 104964
pAAV2/8 (Rep/Cap) Addgene 112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) Addgene 130878
pAAV2/9n (Rep/Cap) Addgene 112865
pAnc80L65AAP Addgene 92307
KP1 (rep/cap) gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
LK03 (rep/cap) gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
pAAV4 (rep/cap) gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNA Addgene 61591
pAAV.MCS Addgene 46954
gBlock (synthetic DNA fragement) IDT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456 (2016).
  2. Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
  3. Lundstrom, K. Viral Vectors in Gene Therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
  4. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  5. Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175 (2015).
  6. Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
  7. Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
  8. Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
  9. Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
  10. Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
  11. Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2021).
  12. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
  13. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  14. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  15. Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662 (2020).
  16. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
  17. Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871 (2021).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
  20. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  21. Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
  22. Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
  23. Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
  24. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  27. Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
  28. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610 (2019).
  29. Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85 (2021).
  30. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  31. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
  32. Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
  33. Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
  34. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  35. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
  36. Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
  37. Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
  38. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  39. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  40. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  41. Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
  42. McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
  43. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
  44. Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
  45. Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439 (2019).
  46. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 200
Transgen ekspresjon i dyrkede celler ved bruk av urensede rekombinante adenoassosierte virale vektorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benyamini, B., Esbin, M. N.,… More

Benyamini, B., Esbin, M. N., Whitney, O., Walther, N., Maurer, A. C. Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (200), e65572, doi:10.3791/65572 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter