Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

使用间充质干细胞通过 体内 软骨内骨化进行整合骨形成

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

通过植入由间充质干细胞产生的人工软骨组织，通过软骨内骨化进行骨治疗有可能规避传统疗法的缺点。透明质酸水凝胶可有效扩大均匀分化的软骨移植物，并在 体内融合移植物之间形成具有血管化的整合骨。

Abstract

使用间充质干细胞 （MSC） 的常规骨再生疗法很难应用于大于临界尺寸的骨缺损，因为它没有诱导血管生成的机制。植入由间充质干细胞制成的人造软骨组织通过软骨内骨化 （ECO） 在 体内 诱导血管生成和骨形成。因此，这种ECO介导的方法可能是未来一种很有前途的骨再生疗法。这种 ECO 介导的方法临床应用的一个重要方面是建立一个方案，用于准备足够的软骨以植入以修复骨缺损。设计大小符合实际骨缺损形状的单个移植软骨块尤其不切实际。因此，被移植的软骨必须具有多块植入时整体形成骨骼的特性。水凝胶可能是一种有吸引力的工具，用于扩大用于软骨内骨化的组织工程移植物以满足临床要求。尽管许多天然衍生的水凝胶在 体外 支持MSC软骨形成，在 体内支持ECO，但满足临床应用需求的最佳支架材料尚未确定。透明质酸（HA）是软骨细胞外基质的重要组成部分，是一种可生物降解和生物相容的多糖。在这里，我们表明HA水凝胶具有优异的特性，可以支持基于MSC的软骨组织的 体外 分化，并促进 体内软骨内骨的形成。

Introduction

自体骨仍然是修复因创伤、先天性缺损和手术切除引起的骨缺损的金标准。然而，自体骨移植具有显着的局限性，包括供体疼痛、感染风险和可从患者中分离出的骨量有限 1,2,3,4。许多生物材料已被开发为骨替代品，将天然或合成聚合物与矿化材料（如磷酸钙或羟基磷灰石）相结合 5,6。这些工程材料中的骨形成通常使用矿化材料作为启动材料来实现，以使干细胞通过膜内骨化 （IMO） 过程直接分化成成骨细胞7。该过程缺乏血管生成步骤，导致植入后移植物的体内血管化不足8,9,10，因此，使用这种过程的方法可能不是治疗大骨缺损的最佳方法11。

用于概括软骨内骨化 （ECO） 过程的策略已被证明可以克服与传统的基于 IMO 的方法相关的重大问题。在 ECO 中，软骨模板中的软骨细胞释放血管内皮生长因子 （VEGF），促进血管浸润和软骨模板重塑为骨12。ECO 介导的通过软骨重塑和血管生成进行成骨的方法，在骨折修复过程中也被激活，使用人工创建的源自 MSC 的软骨组织作为启动材料。软骨细胞可以耐受骨缺损的缺氧，诱导血管生成，并将游离软骨移植物转化为血管生成组织。许多研究报告说，基于 MSC 的软骨移植物通过实施这样的 ECO 程序在体内产生骨 13,14,15,16,17,18,19,20,21。

这种 ECO 介导的方法的临床应用的一个基本要求是如何在临床环境中制备所需数量的软骨移植物。制备适合实际骨缺损尺寸的临床软骨是不切实际的。因此，移植软骨在植入多个碎片时必须整体形成骨22.水凝胶可能是一种有吸引力的工具，用于扩大用于软骨内骨化的组织工程移植物。许多天然来源的水凝胶在体外支持MSC软骨形成，在体内支持ECO 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32;然而，满足临床应用要求的最佳支撑材料仍未确定。透明质酸 （HA） 是一种可生物降解且具有生物相容性的多糖，存在于软骨33 的细胞外基质中。HA 通过 CD44 等表面受体与 MSC 相互作用，以支持软骨生成分化 25,26,28,30,31,32,34。此外，HA支架促进IMO介导的人牙髓干细胞成骨分化35，支架与胶原蛋白结合促进ECO介导的成骨36,37。

在这里，我们提出了一种使用骨髓来源的成人人间充质干细胞制备 HA 水凝胶的方法，以及它们在体外用于肥厚软骨生成和随后的体内软骨内骨化 38。我们将 HA 的特性与胶原蛋白的特性进行了比较，胶原蛋白是一种广泛用于骨组织工程的材料，具有 MSC，并且是用于扩大人工移植物用于软骨内骨化的有用材料17。在免疫功能低下的小鼠模型中，通过皮下植入评估接种了人间充质干细胞的 HA 和胶原构建体的体内 ECO 潜力。结果表明，HA水凝胶非常适合作为MSCs的支架，以产生人工软骨移植物，从而通过ECO形成骨骼。

该协议分为两个步骤。首先，制备接种在透明质酸水凝胶上的人间充质干细胞的构建体，并在 体外分化为肥厚软骨。接下来，将分化的构建体皮下植入裸模型中以诱导 体内 软骨内骨化（图1）。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

该方案使用4周龄的雄性裸鼠。在22-24°C和50%-70%相对湿度下，在12小时光/暗循环下将四只小鼠饲养在笼子中。所有动物实验均按照东京医科齿科大学机构动物护理和使用委员会批准的指南（批准编号：A2019-204C、A2020-116A 和 A2021-121A）进行。

1. 缓冲液和试剂的制备

  1. 通过将MSC生长培养基的补充试剂盒添加到MSC基础培养基中来制备间充质干细胞生长培养基（MSC生长培养基），并将其储存在4°C。
  2. 通过向培养基中加入10%胎牛血清（FBS），50μg/ mL庆大霉素，200μML-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1ng / mL碱性成纤维细胞生长因子来制备Dulbecco改良的Eagle培养基和Ham's F12（DMEM / F-12）培养基，并将其储存在4°C。
  3. 使用前向DMEM中加入1%ITS-G添加剂，0.12%牛血清白蛋白，50μg/ mL庆大霉素，0.35mM L-脯氨酸，100nM地塞米松和10ng / mL TGF-β3来制备软骨培养基。
  4. 使用前向DMEM中加入10mM β-甘油磷酸盐，0.12%牛血清白蛋白，10nM地塞米松，200μM抗坏血酸-2-磷酸盐，50nM L-甲状腺素，50μg/ mL庆大霉素和50pg / mL IL-1β来制备肥厚培养基。
  5. 用200μL在60°C预热的熔化石蜡涂覆24孔培养皿。 在室温下静置，直到石蜡凝固。

2. 人类间充质干细胞的扩增

注：在开始实验之前，应在微量培养物中选择具有高MSC软骨形成潜力的MSC，如17所述。

  1. 根据制造商的说明，在37°C下，在5%CO2和95%加湿空气培养箱中，用MSC生长培养基在10cm培养皿中以5×103个细胞/ cm 2的密度培养原代人骨髓来源的MSC（传代2）。
  2. 每 2-3 天更换一次培养基。一旦细胞达到 80%-90% 汇合度，使用真空泵从细胞培养皿中吸出培养基，用 5 mL PBS 洗涤，然后用真空泵吸出溶液。
  3. 向培养皿中加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶/0.02% EDTA 溶液。将培养皿在37°C孵育5-10分钟。
  4. 加入 1 mL MSC 生长培养基以终止酶促反应。将细胞悬液转移到 50 mL 试管中。
  5. 将来自其他培养皿的细胞悬浮液混合在 50 mL 试管中，并将其保持在冰上。
  6. 使用细胞计数器通过将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 0.4% 台盼蓝染色剂混合来计数细胞。
  7. 在室温下以220× g 离心剩余的细胞悬浮液3分钟。除去上清液，加入浓度为1.0×10 6个细胞/ mL的冻存溶液。
  8. 将1mL细胞悬液分配到每个冷冻管中，并在-80°C下储存12小时，然后转移到液氮中。由此产生的冷冻库存（第3代）用于该协议。
  9. 对于实验，将储存的MSC以5×103 个细胞/cm 2的密度接种在10cm培养皿中。在 DMEM/F-12 培养基中培养细胞直至 80%-90% 汇合（第 4 代）。

3. MSC包封水凝胶的制备

  1. 胰蛋白酶消化细胞并制备细胞悬液，如步骤2.3-2.6所述。
  2. 要制备 10 个构建体（每个构建体 2.5 x 10 5 个细胞），将含有 2.5 x 106 个细胞的细胞悬液等分到1.5 mL 微管中。
  3. 将悬浮液以220× g 离心3分钟，用真空泵除去上清液，并将其保持在冰上。
  4. 将巯基改性透明质酸 （HA）、巯基反应联剂、聚乙二醇二丙烯酸酯和脱气水瓶置于室温。
  5. 在无菌条件下，使用带针头的注射器将 1.0 mL 脱气水添加到含有 HA 的瓶子中（参见制造商的说明）。
  6. 偶尔涡旋升温至37°C，直到溶液变清，然后置于冰上。固体完全溶解需要不到 30 分钟的时间。
  7. 在无菌条件下，使用带针的注射器向交联剂瓶中加入 0.5 mL 脱气水。倒置数次溶解，然后放在冰上。
  8. 将 120 μL 溶解的 HA 溶液加入等分的细胞沉淀（2.5 x 106 个细胞）中。通过来回移液重悬细胞沉淀。
  9. 将30μL溶解的交联剂溶液加入含有HA和细胞的试管中（步骤3.8），并通过敲击试管合并，然后短暂旋转。将 HA 溶液和交联剂溶液以 4：1 的比例混合。
  10. 将15μL含有MSCs（2.5×10,5个细胞）的组合溶液滴到石蜡包被的24孔板上，并使其在37°C下固化30分钟（图2）。由于粘度高，因此准备至少 10% 的额外量的细胞/水凝胶混合物。
    注：水凝胶的特性在前面已经描述过39。

4. 体外 分化条件

  1. 将 0.5 mL 软骨分化培养基加入 MSC 接种的 HA 水凝胶构建体中。每 2-3 天更换一次培养基。
  2. 3 周后，改用肥厚分化培养基（每孔 0.5 mL）并将构建体再培养 2 周。

5 . 间 充质干细胞体内植入

  1. 在总共5周的体外培养后，将构建体皮下植入裸鼠的背部，如前所述38,40。
  2. 称量小鼠并通过腹膜内注射给予用0.75mg / kg体重（b.w.）美托咪定，4.0mg / kg b.w.咪达唑仑和5.0mg / kg b.w.布托啡诺制备的组合麻醉剂，如所述38。
  3. 通过对手术刺激的不动来确认充分的麻醉，并在手术期间通过缓慢、有规律的胸部运动和定期通过粉红色粘膜的颜色适当供氧来监测呼吸深度。在眼睛上使用兽药膏，以防止麻醉期间干燥。
  4. 将小鼠放在俯卧位的无菌手术单上，用50ppm次氯酸水（pH 5.0;HAW），并在小鼠上放置穿孔手术单。
    注意： 在高压灭菌器、环氧乙烷气体或 HAW 中对所有手术材料进行灭菌。外科医生应清洗手指并穿上手术衣和手套。
  5. 用剪刀在肩部和臀部区域沿脊柱中心线做两个相距 2 厘米的 5 毫米长的皮肤切口。
  6. 将刮刀皮下插入切口，形成皮下口袋。
  7. 用镊子将两到三个构建体（每个~15μL，步骤5.1）插入每个口袋中。植入同一口袋的 HA 构建体非常容易发生融合。为防止融合，请在每个口袋中插入一个 HA 构建体。
  8. 用 4-0 编织丝线缝合切口。向小鼠注射拮抗剂，以0.75mg / kg b.w.阿替美唑制备麻醉剂，如所述38。
  9. 当小鼠从麻醉中恢复时，将小鼠置于无菌恢复笼中，该笼含有无菌地板垫料，没有食物和水瓶，并持续监测体温，脉搏和呼吸。
  10. 不要让小鼠无人看管，直到它恢复足够的意识以保持胸骨卧位。完全康复后，将动物与其他动物一起放回饲养室。
  11. 在愈合期间，每隔几天监测一次动物是否有任何可能的并发症。通过吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死，在植入后4周和8周几乎没有痛苦。
  12. 切开移植部位的皮肤，并用镊子取出植入的结构。将构建体固定在4%多聚甲醛中16小时，然后对其进行分析。

6. 统计分析

  1. 以平均值±标准差 （SD） 的形式报告定量数据。使用商业软件进行统计分析。
  2. 使用学生 t 检验或单因素方差分析，然后使用 Tukey 的多重比较检验来确定组间的显着差异。p<0.05和p<0.01表示两组间差异有统计学意义。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

将MSC封装的HA水凝胶在补充有TGFβ3（软骨生成诱导剂41 ）的软骨形成培养基中培养（步骤4.1）。我们将 HA 的特性与胶原蛋白的特性进行了比较，胶原蛋白已被证明可有效创建用于软骨内骨化的基于 MSC 的人工软骨移植物，如前所述38。本研究中未将未分化的 MSC 列为阴性对照，因为已经证明未分化的 MSC 需要矿化表面作为启动基质，才能通过成骨分化（即膜内骨化）产生骨骼7。

透明质酸水凝胶的大小在整个 体外 培养期间没有变化，这是根据倒置显微镜下测量的直径判断的，而用于比较的胶原蛋白水凝胶在培养开始后不久就开始收缩。为了减少 体外 培养后 HA 和胶原构建体之间的大小差异，与用于制备 HA 水凝胶的凝胶相比，MSC 的数量和用于制造 HA 水凝胶的凝胶体积减半。然而，软骨培养 3 周后 HA 构建体的湿重是胶原构建体的 4 倍。

体外软骨形成和肥厚分化 。
软骨分化后（ 体外 培养第 3 周），硫酸化糖胺聚糖 （sGAG） 阳性（番红 O/快绿染色; 图3A）在两种构建体中都观察到 II 型胶原阳性细胞外基质，表明 HA 和胶原水凝胶都支持软骨生成。然而，与胶原构建体相比，sGAG、II 型胶原 （Col II） 和 X 型胶原 （Col X） 在 HA 构建体中整个组织中的分布更加均匀。两种构建体之间的差异在细胞形态学上也很明显：具有软骨细胞样圆形形态的细胞分布在 HA 构建体的整个组织中。然而，在胶原结构中，外围的细胞显示出异质的形态，从不规则/拉伸到圆形形态不等。与此一致，HA构建体中细胞的平均圆度高于胶原构建体，无论是在外围区域还是在中心区域（分别为34%对77.6%（p<0.01）和78.3%对100%（p<0.05）; 图3B）。在培养 5 周时，在两种构建体的外缘都检测到钙沉积（茜素红; 图3C）。此外，通过实时定量RT-PCR检测软骨生成（Sox-9，聚集聚糖（ACAN），Col II），肥厚（Col X，基质金属肽酶13（MMP-13））和成骨（I型胶原（Col I），骨唾液蛋白（BSP），骨钙素（OCN））标志物14 的表达，证实了 体 外培养过程中软骨生成和肥厚分化的进展（图4）。

皮下植入结构在体内的软骨内骨化。
在裸鼠的背部创建皮下口袋，并在肥厚分化后（在体外培养的第5周）在每个口袋中植入2至3个构建体。在植入后 4 或 8 周，所有 HA 构建体在植入的口袋中相互附着（表 1）。在胶原蛋白结构中，在60%的口袋中观察到粘附，而在其余的口袋中，移植物彼此独立。苏木精和伊红 （H&E） 染色显示，在植入后 8 周的两种构建体中，在构建体的外部区域形成了具有层状形态的类骨组织（图 5Aa，f）。sGAG染色在HA构建体中消失，表明其软骨表型的丧失（图5Ah）。在这两种结构中，在内软骨和外骨质组织之间形成了含有造血细胞和脂肪组织的骨髓成分。在所有 HA 构建体中，融合构建体的骨组织连接并被关节纤维组织包围，骨髓沿着两个贴壁构建体之间的空间发育，表明多个 HA 构建体倾向于形成整合的骨组织（图 5Ag）。粘附的胶原结构类似地整合在三个融合案例中的两个案例中，但在第三个案例中，两个构建体的骨组织没有连接（表 1 和图 5Ab）。在这两种构建体中，在骨髓中观察到由 CD31 阳性内皮细胞42 鉴定的血管（图 5Ad，i），并且内软骨区域被破骨细胞谱系的 TRAP 阳性多核细胞包围，表明软骨组织受到重塑（图 5Ae，j）。

矿物质沉积在HA和胶原结构的外部骨质区域（图5B）。虽然 HA 和胶原结构之间的新骨的总矿物质密度相似，但 HA 结构中的矿物质体积明显高于胶原结构中的矿物质体积，这可能反映了 HA 水凝胶在体外培养过程中没有收缩，导致构建 体 比胶原水凝胶更大（图 5C，D）。

Figure 1
图1：实验设计。 该方案的第一步是将扩增的MSC封装在HA水凝胶中，以促进 体外软骨生成和肥厚分化。将构建体在软骨分化条件下培养 3 周，然后在肥厚分化条件下再培养 2 周。该方案的第二步是在体外培养的第5周将构建 体 皮下植入裸鼠中，以 在体内 进行软骨内骨化8周。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图2：MSCs种子水凝胶的制备。 将含有MSC的改性HA /交联剂溶液滴到石蜡包被的24孔板上，并在37°C下固化30分钟。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3： 体外 培养后 HA 和胶原构建体的组织学和免疫组织化学分析22. （A） 在体外培养 3 周 （3W） 时对构建 体 进行 sGAG（番红 O/固绿）、II 型胶原 （Col II） 和 X 型胶原 （Col X） 染色。（B） 体外 培养 3 周时细胞的平均圆度值 （n = 5）。开放条和灰色条分别表示胶原蛋白和透明质酸结构。没有共同字母的组在统计学上存在差异（a与b，p<0.01;b与c，p<0.05）。（C） 在体外培养 5 周 （5W） 时对构建 体 进行钙（茜素红）染色。所有照片均以相同的放大倍率（比例尺：200μm）拍摄。插图中显示了整个组织的低倍率概览（比例尺：1 mm）。误差线表示平均值±标准差 （SD）。采用单因素方差分析后Tukey多重比较检验确定组间差异。这个数字是从38修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4： 体外 培养 3 周和 5 周时 HA 和胶原构建体的基因表达分析 。 （A） 软骨和肥厚标志物。（B） 成骨标志物。值表示为平均值±标准差 （SD） （n = 3）。未分化间充质干细胞表达高水平的 Col I 和 MMP-13 以及低水平的 Sox-9 和 Col X;他们没有表达 （#） ACAN、Col II、BSP 和 OCN。误差线表示平均值±标准差 （SD）。这个数字是从38修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5：植入 8 周时 HA 和胶原蛋白构建体的免疫组织化学分析和钙 化。 （A） 对苏木精和曙红（H&E、a、b、f 和 g）、番红 O/固绿（c 和 h）、内皮细胞（分化簇 31、CD31）（d 和 i）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP、e 和 j）的构建体进行染色。（a 和 f）整个组织的概述（比例尺= 500μm）。H&E，番红O，CD31：比例尺= 200μm;陷阱：比例尺= 50μm。箭头表示 CD31 阳性内皮细胞。缩写：c = 软骨内组织;o = 外骨质组织。（B） 胶原蛋白和 HA 构建体的 MicroCT （μCT） 成像（主图像和插图比例尺 = 2 mm）。（C，D）HA 和胶原蛋白结构的总矿物质密度 （C） 和体积 （D） （n = 4）。** 表示显著差异;第 < 页 0.01。使用μCT分析每组4个结构。 误差线表示平均值±标准差 （SD）。采用学生t检验确定组间差异有统计学意义。这个数字是从38修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6：使用基于 HA 的人工软骨促进 ECO 的策略。植入的 HA 构建体在没有和有碎裂（μ 颗粒）的情况下骨化和骨髓发育的示意图。 （A） HA水凝胶具有极好的融合倾向，可在体内融合移植物之间形成具有血管化和骨髓发育的整合骨。然而，即使在植入后 8 周，由此产生的植入组织仍主要处于软骨状态。（B）鉴于HA构建体融合形成整合骨的趋势，将HA构建体加工成μ颗粒可以加快移植组织的重塑速度并促进骨形成。微粉化构建体会增加表面积，这可能促进软骨组织的吸收和骨组织的形成，并且由于宿主细胞浸润的空间增加，也可能促进血管生成和骨髓发育。请点击这里查看此图的较大版本.

水 凝 胶 实验 坚持 联合 % 美联航
胶原 5 3 2 40
医 管 局 5 5 5 100

表1：将多个构建体植入单个口袋时的统一率。 将两个或三个结构皮下植入一个口袋中。在植入后 4 周或 8 周收获构建体并进行组织学检查。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

使用适当的支架材料来促进从肥厚软骨到骨骼的过渡，是扩大基于 MSC 的工程肥厚性软骨移植物和治疗具有临床意义的骨缺损的有前途的方法。在这里，我们表明 HA 是一种极好的支架材料，可在体外支持基于 MSC 的肥厚软骨组织的分化并促进体内软骨内骨形成 38。此外，在体内，HA构建体被证明可以促进植入同一口袋中的多个构建体的融合，以形成单个整合的骨骼。由于间充质干细胞与支架材料的相互作用会显着影响软骨和肥厚软骨生成，因此为 ECO 选择合适的支架材料对于产生临床有效的组织工程软骨移植物非常重要。嵌入HA水凝胶中的细胞从中心到外围均匀地表现出软骨细胞的圆形形态特征，表明透明质酸在整个水凝胶21,30中提供了有利于均匀软骨形成的环境。与 HA 不同，胶原蛋白通过整合素结合序列 （RGD） 与 MSC 相互作用;然而，这种相互作用的持续性阻止了MSCs在软骨形成途径43中进一步分化，这可能解释了在胶原结构外围突出的非典型软骨细胞形态。

如果多个移植物联合形成一块骨头，这种 ECO 介导的方法可以扩展到更具临床相关性的骨缺损。当将多个基于 MSC 且无支架的肥厚软骨应用于单个骨缺损时，据报道软骨移植物与骨缺损融合。然而，相邻的移植物没有相互整合22。这里介绍的方法可能为克服这一局限性提供了一种可能的解决方案。与胶原结构相比，HA构建体的多个移植物更倾向于融合形成单个骨骼。此外，骨髓是在融合的 HA 构建体之间形成的，这可能与 HA 支持整个水凝胶的均匀软骨分化有关，因为肥厚软骨分泌 VEGF 并为骨髓发育中的造血干细胞生态位提供环境 44。

使用该协议成功实验的关键是MSC的质量，建议提前确认要使用的MSC具有足够高的软骨分化潜力。其次，每个结构的大小不宜过大。根据我们的经验，单个构建体的体积限制为 10-15 μL。 较大的构建体可能导致氧气和营养物质渗透到构建体中不足，导致构建体中心坏死和分化不良。因此，需要减少凝胶厚度以提高氧气和营养物质的渗透性。为了减小凝胶厚度，在Transwell插入物14,45的多孔膜上产生薄凝胶可能会有所帮助。或者，由于 HA 构建体倾向于融合并形成整合骨，因此植入许多较小的构建体可能就足够了，而不是单个大型构建体，如下所述。

本研究的局限性包括需要加快植入组织的重塑速度以促进骨形成。即使在植入后 8 周，植入的工程组织也主要处于肥厚钙化软骨状态。在通过 ECO 途径形成的骨骼中，宿主来源的细胞在促进 ECO16,46 中起着关键作用。据报道，在肥厚软骨移植物中提供额外的通道可促进体内血管侵袭和移植物矿化 20。这些通道用作宿主细胞（包括成骨细胞、破骨细胞和造血前体）浸润的管道，以在构建体内形成新组织。或者，据报道，可以植入多个由软骨形成分化间充质干细胞组成的小纤维蛋白包封颗粒（μ颗粒）以形成整合骨47。将 HA 构建体加工成μ颗粒可以增加 TRAP 阳性破骨细胞包围的表面积，从而促进软骨组织的重塑率并增强成骨（图 6）21,48。此外，植入μ丸会增加宿主细胞的浸润空间，从而促进血管生成和骨髓发育，并产生具有丰富血管化的整体骨形成。因此，考虑到 HA 构建体融合并形成整合骨的趋势，这种μ构建的骨再生策略可能会加速使用 HA 水凝胶的肥厚软骨移植物的 ECO 过程。

总之，与胶原水凝胶相比，HA水凝胶可有效扩大细胞和凝胶的细胞和凝胶。此外，HA水凝胶具有出色的融合灵敏度，并在融合移植物之间产生具有血管化和骨髓发育的整合骨。因此，修饰 HA 构建体以促进宿主细胞浸润和移植物重塑可能会导致可植入材料的开发，从而进一步促进血管形成和骨髓发育。通过进一步优化，这种方法可能成为目前颌面和骨科手术中骨骼疗法的有前途的替代方案。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者宣称不存在任何利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了日本科学振兴会（JSPS）的科学研究补助金（KAKENHI）的支持（资助号）。JP19K10259 和 22K10032 到 MAI）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues--the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Tags

间充质干细胞， 骨再生疗法， 血管生成， 软骨内骨化， 人工软骨组织， 骨缺损， 临床应用， 方案， 水凝胶， 组织工程移植物， 透明质酸 （HA）
使用间充质干细胞通过 <em>体内</em> 软骨内骨化进行整合骨形成
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., … More

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter