Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65573
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

Abstract

טיפול קונבנציונלי בהתחדשות עצם באמצעות תאי גזע מזנכימליים (MSCs) קשה ליישום על פגמים בעצם גדולים מהגודל הקריטי מכיוון שאין לו מנגנון לגרימת אנגיוגנזה. השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מ-MSCs גורמת לאנגיוגנזה וליצירת עצם in vivo באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית (ECO). לכן, גישה זו בתיווך אקולוגי עשויה להיות טיפול מבטיח להתחדשות עצם בעתיד. היבט חשוב ביישום הקליני של גישה זו בתיווך אקולוגי הוא קביעת פרוטוקול להכנת מספיק סחוס להשתלה כדי לתקן את הפגם בעצם. במיוחד לא מעשי לתכנן מסה אחת של סחוס מושתל בגודל המתאים לצורת פגם העצם בפועל. לכן, הסחוס להשתלה חייב להיות בעל תכונה של יצירת עצם באופן אינטגרלי כאשר חלקים מרובים מושתלים. הידרוג'לים עשויים להיות כלי אטרקטיבי להרחבת שתלים מהונדסים רקמות עבור אוסיפיקציה אנדוכונדרלית כדי לעמוד בדרישות הקליניות. למרות שהידרוג'לים רבים ממקור טבעי תומכים בהיווצרות סחוס MSC in vitro ו- ECO in vivo, חומר הפיגום האופטימלי שיענה על הצרכים של יישומים קליניים טרם נקבע. חומצה היאלורונית (HA) היא מרכיב חיוני במטריצה החוץ תאית של הסחוס והיא פוליסכריד מתכלה ותואם ביולוגית. כאן, אנו מראים כי הידרוג'ל HA יש תכונות מצוינות לתמוך בהתמיינות חוץ גופית של רקמת סחוס מבוססת MSC ולקדם היווצרות עצם אנדוכונדרלית in vivo.

Introduction

עצם אוטולוגית היא עדיין תקן הזהב לתיקון מומים בעצם עקב טראומה, מומים מולדים וכריתה כירורגית. עם זאת, להשתלת עצם אוטוגנית יש מגבלות משמעותיות, כולל כאב תורם, סיכון לזיהום ונפח עצם מוגבל שניתן לבודד מהחולים 1,2,3,4. ביו-חומרים רבים פותחו כתחליפי עצם, המשלבים פולימרים טבעיים או סינתטיים עם חומרים מינרליים כגון סידן פוספט או הידרוקסיאפטיט 5,6. היווצרות עצם בחומרים מהונדסים אלה מושגת בדרך כלל באמצעות החומר המינרלי כחומר ראשוני כדי לאפשר לתאי גזע להתמיין ישירות לאוסטאובלסטים באמצעות תהליך האוסיפיקציה התוך-ממברנית (IMO)7. תהליך זה חסר את השלב האנגיוגני, וכתוצאה מכך אין מספיק וסקולריזציה in vivo של השתל לאחר ההשתלה 8,9,10, ולכן גישות המשתמשות בתהליך כזה עשויות שלא להיות אופטימליות לטיפול במומים גדולים בעצמות 11.

אסטרטגיות המיושמות כדי לשחזר את תהליך האוסיפיקציה האנדוכונדרלית (ECO), מנגנון מולד בשלד במהלך הפיתוח, הוכחו כמתגברות על בעיות משמעותיות הקשורות לגישות מסורתיות מבוססות IMO. ב- ECO, כונדרוציטים בתבנית הסחוס משחררים גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), אשר מקדם הסננה וסקולרית ועיצוב מחדש של תבנית הסחוס לעצם12. הגישה בתיווך אקולוגי לאוסטאוגנזה באמצעות עיצוב מחדש של סחוס ואנגיוגנזה, המופעלת גם במהלך תיקון שבר, משתמשת ברקמת סחוס שנוצרה באופן מלאכותי שמקורה ב- MSCs כחומר ראשוני. כונדרוציטים יכולים לסבול היפוקסיה במומים בעצמות, לגרום לאנגיוגנזה ולהמיר שתל סחוס ללא כלי דם לרקמה אנגיוגנית. מחקרים רבים דיווחו כי שתלי סחוס מבוססי MSC מייצרים עצם in vivo על ידי יישום תוכנית ECO כזו 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

דרישה חיונית ליישום קליני של גישה זו בתיווך אקולוגי היא כיצד להכין את הכמות הרצויה של שתל סחוס בסביבה קלינית. הכנת סחוס קליני בגודל המתאים לפגם העצם בפועל אינה מעשית. לכן, סחוס השתל חייב ליצור עצם באופן אינטגרלי כאשר מושתלים שברים מרובים22. הידרוג'לים עשויים להיות כלי אטרקטיבי להרחבת שתלים מהונדסים רקמות לאוסיפיקציה אנדוכונדרלית. הידרוג'לים רבים ממקור טבעי תומכים בהיווצרות סחוס MSC במבחנה ו- ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; עם זאת, חומר התמיכה האופטימלי שיעמוד בדרישות היישום הקליני טרם נקבע. חומצה היאלורונית (HA) היא פוליסכריד מתכלה ותואם ביולוגית הנמצא במטריצה החוץ תאית של סחוס33. חומצה היאלורונית מקיימת אינטראקציה עם MSCs באמצעות קולטני שטח כגון CD44 לתמיכה בהתמיינות כונדרוגנית 25,26,28,30,31,32,34. בנוסף, פיגומים HA מקדמים התמיינות אוסטאוגנית בתיווך IMO של תאי גזע אנושיים ממוך השן35, ופיגומים בשילוב עם קולגן מקדמים אוסטאוגנזה36,37 בתיווך אקולוגי.

כאן, אנו מציגים שיטה להכנת הידרוג'לים HA באמצעות MSCs אנושיים בוגרים שמקורם במח עצם והשימוש בהם עבור chondrogenesis in vitro hypertrophic ולאחר מכן ossification endochondral in vivo38. השווינו את המאפיינים של חומצה היאלורונית לאלה של קולגן, חומר הנמצא בשימוש נרחב בהנדסת רקמת עצם עם MSCs וחומר שימושי להרחבת שתלים מלאכותיים עבור אוסיפיקציה אנדוכונדרלית17. במודל עכבר מדוכא חיסון, מבני HA וקולגן שנזרעו עם MSCs אנושיים הוערכו עבור פוטנציאל ECO in vivo על ידי השתלה תת עורית. התוצאות מראות כי הידרוג'ל HA מצוין כפיגום עבור MSCs ליצירת שתלי סחוס מלאכותיים המאפשרים היווצרות עצם באמצעות ECO.

הפרוטוקול מחולק לשני שלבים. ראשית, מבנים של MSCs אנושיים שנזרעו על הידרוג'ל היאלורונן מוכנים ומובחנים לסחוס היפרטרופי במבחנה. לאחר מכן, המבנים המובחנים מושתלים באופן תת-עורי במודל עירום כדי לגרום לאוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה משתמש בעכברים עירומים זכרים בני 4 שבועות. אכלסו ארבעה עכברים בכלוב תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 22-24°C ו-50%-70% לחות יחסית. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ודנטלית של טוקיו (מזהה אישור: A2019-204C, A2020-116A ו- A2021-121A).

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

  1. הכן מדיום גידול תאי גזע מזנכימלי (מדיום גידול MSC) על ידי הוספת ערכת התוספת של מדיום גידול MSC למדיה הבסיסית של MSC ואחסן אותה ב -4 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו את מדיום הנשר המותאם של דולבקו ואת מדיום F12 (DMEM/F-12) של Dulbecco על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, 200 מיקרומטר L-אלניל-L-גלוטמין, וגורם גדילה פיברובלסטי בסיסי 1 ננוגרם/מ"ל למדיום ואחסנו אותו ב -4 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו מדיום כונדרוגני על ידי הוספת תוסף ITS-G 1%, אלבומין בסרום בקר 0.12%, 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 0.35 מ"מ L-פרולין, 100 ננומטר דקסמתזון ו-10 נ"ג/מ"ל TGF-β3 ל-DMEM ממש לפני השימוש.
  4. הכינו מדיום היפרטרופי על ידי הוספת 10 mM β-glycerophosphate, 0.12% אלבומין בסרום בקר, 10 nM dexamethasone, 200 μM ascorbate-2-phosphate, 50 nM L-thyroxine, 50 μg / mL gentamycin, ו 50 pg/mL IL-1β ל- DMEM ממש לפני השימוש.
  5. מצפים צלחת תרבית 24 בארות עם 200 μL של פרפין מומס שחומם מראש ב 60 ° C. מניחים לעמוד בטמפרטורת החדר עד שהפרפין מתייצב.

2. הרחבת MSCs אנושיים

הערה: לפני תחילת הניסויים, MSCs עם פוטנציאל גבוה עבור MSC chondrogenesis צריך להיות נבחר בתרבית מיקרו מסה כמתואר ב17.

  1. על פי הוראות היצרן, תרבית ראשונית מח עצם אנושית MSCs (מעבר 2) עם מדיום גידול MSC בצלחת 10 ס"מ בצפיפות של 5 x 103 תאים / ס"מ 2 ב 37 ° C ב 5% CO2 ו 95% אינקובטור אוויר לח.
  2. שנה את המדיום כל 2-3 ימים. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%, שאפו את התווך מצלחת תרבית התאים באמצעות משאבת ואקום, שטפו עם 5 מ"ל PBS, ולאחר מכן שאפו את התמיסה עם משאבת ואקום.
  3. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין/0.02% תמיסת EDTA לצלחת. לדגור על המנה במשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 1 מ"ל של מדיום גידול MSC כדי לעצור את התגובה האנזימטית. העבר את מתלה התא לצינור 50 מ"ל.
  5. שלב את מתלה התא מכלים אחרים בצינור 50 מ"ל ולשמור אותו על קרח.
  6. השתמש במונה התאים כדי לספור את התאים על ידי ערבוב 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של 0.4% כתם כחול טריפאן.
  7. צנטריפוגה את מתלה התא הנותר ב 220 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ולהוסיף תמיסה cryopreservation בריכוז של 1.0 x 106 תאים לכל מ"ל.
  8. יש להוציא 1 מ"ל מתרחיף התא לכל צינור קריו-צינור ולאחסן בטמפרטורה של -80°C למשך 12 שעות לפני העברתו לחנקן נוזלי. המלאי הקפוא שנוצר (מעבר 3) משמש לפרוטוקול זה.
  9. עבור הניסויים, זרעו את MSCs מלאי בצלחת 10 ס"מ בצפיפות של 5 x 103 תאים / ס"מ2. תאי תרבית עד 80%-90% מפגש (מעבר 4) בתווך DMEM/F-12.

3. הכנת הידרוג'לים בכמוסה MSC

  1. טריפסיניזציה של התאים והכן השעיית תאים כמתואר בשלבים 2.3 - 2.6.
  2. כדי ליצור 10 מבנים (2.5 x 10 5 תאים לכל מבנה), aliquot את תרחיף התא המכיל 2.5 x 106 תאים לתוך microtube1.5 מ"ל.
  3. צנטריפוגו את המתלה ב 220 x גרם במשך 3 דקות, להסיר את supernatant עם משאבת ואקום, ולשמור אותו על קרח.
  4. הביאו לטמפרטורת החדר את החומצה ההיאלורונית (HA), הקרוסלינקר הריאקטיבי של תיול, דיאקרילט פוליאתילן גליקול ובקבוקי מים נטולי גזים.
  5. בתנאים סטריליים, יש להוסיף 1.0 מ"ל מים נטולי גז לבקבוק המכיל HA (ראה הוראות יצרן) באמצעות מזרק עם מחט.
  6. מערבולת מתחממת מדי פעם ל 37 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה מתבהרת, ואז מניחים על קרח. לוקח פחות מ-30 דקות עד שהמוצקים מתמוססים לחלוטין.
  7. בתנאים סטריליים, להוסיף 0.5 מ"ל של מים degassed בקבוק crosslinker באמצעות מזרק עם מחט. יש להמיס על ידי היפוך מספר פעמים, ואז להניח על קרח.
  8. הוסף 120 μL של תמיסת HA מומסת לגלולת התא aliquoted (2.5 x 106 תאים). השהה מחדש את גלולת התא על ידי פיפטציה קדימה ואחורה.
  9. הוסף 30 μL של תמיסת הקרוסלינקר המומסת לצינור המכיל את החומצה ההיאלורונית והתאים (שלב 3.8) ושלב על ידי הקשה על הצינור, ולאחר מכן סובב מטה לזמן קצר. שלב את פתרון החומצה ההיאלורונית ואת תמיסת הקרוסלינקר ביחס של 4:1.
  10. זרקו 15 μL של התמיסה המשולבת המכילה MSCs (2.5 x 10,5 תאים) על צלחת 24 בארות מצופה פרפין ואפשרו לה להתמצק ב-37°C למשך 30 דקות (איור 2). בשל צמיגות גבוהה, הכינו לפחות 10% תוספת של תערובת התא/הידרוג'ל מהנדרש.
    הערה: המאפיינים של הידרוג'ל תוארו בעבר39.

4. תנאי התמיינות חוץ גופית

  1. הוסף 0.5 מ"ל של מדיום התמיינות כונדרוגנית למבנה של הידרוג'ל HA זרעי MSC. שנה את המדיום כל 2-3 ימים.
  2. לאחר 3 שבועות, לעבור בינוני התמיינות היפרטרופית (0.5 מ"ל לכל באר) ותרבית את המבנים במשך שבועיים נוספים.

5. השתלת In vivo של MSCs

  1. לאחר סך של 5 שבועות של תרבית חוץ גופית, להשתיל את המבנים תת עורית לתוך החלק האחורי של עכברים עירומים כפי שתואר קודם38,40.
  2. לשקול עכברים ולתת חומר הרדמה משולב שהוכן עם 0.75 מ"ג / ק"ג משקל גוף (b.w.) medetomidine, 4.0 מ"ג / ק"ג b.w. midazolam, ו 5.0 מ"ג / ק"ג b.w. butorphanol על ידי הזרקה intraperitoneal כמתואר38.
  3. יש לוודא הרדמה נאותה על ידי חוסר תנועה לגירויים כירורגיים ולעקוב אחר עומק הנשימה על ידי תנועות חזה איטיות וסדירות ואספקת חמצן נאותה על ידי צבע הרירית הוורודה מעת לעת במהלך הניתוח. השתמש משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
  4. מניחים את העכבר על וילון כירורגי סטרילי במצב נוטה, מעקרים את אתר החתך במי חומצה היפוכלורית 50 ppm (pH 5.0; HAW), ומניחים וילון כירורגי מחורר מעל העכבר.
    הערה: יש לעקר את כל חומרי הניתוח באוטוקלאב, גז אתילן אוקסיד או HAW. המנתחים צריכים לשטוף את אצבעותיהם וללבוש חלוקים וכפפות כירורגיות.
  5. בצע שני חתכי עור באורך 5 מ"מ במרחק של 2 ס"מ זה מזה באזור הכתפיים והירכיים לאורך קו המרכז של עמוד השדרה באמצעות מספריים.
  6. הכנס מרית תת עורית דרך החתך ליצירת כיס תת עורי.
  7. הכנס שניים עד שלושה מבנים (~ 15 μL כל אחד, שלב 5.1) לכל כיס עם מלקחיים. מבני HA המושתלים באותו כיס נוטים לאיחוי בתדירות גבוהה מאוד. כדי למנוע איחוי, הכנס מבנה HA אחד לכל כיס.
  8. סגרו את החתכים עם 4-0 תפרי משי קלועים. הזריקו לעכבר אנטגוניסט להרדמה שהוכן עם 0.75 מ"ג/ק"ג B.W. atipamezole כמתואר38.
  9. בזמן שהעכברים מתאוששים מההרדמה, הכניסו את העכברים לכלובי התאוששות סטריליים המכילים מצעי רצפה סטריליים ללא בקבוקי מזון ומים ועקבו באופן רציף אחר טמפרטורת הגוף, הדופק והנשימה.
  10. אל תשאירו את העכברים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. לאחר החלמה מלאה, החזירו את בעלי החיים לחדר הרבייה עם שאר בעלי החיים.
  11. עקוב אחר בעלי החיים כל כמה ימים במהלך תקופת הריפוי עבור כל סיבוכים אפשריים. הרדימו את העכברים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני עם מעט סבל לאחר 4 ו 8 שבועות לאחר ההשתלה.
  12. חותכים את העור באתרים המושתלים ומסירים את המבנים המושתלים בעזרת מלקחיים. תקן את המבנים ב 4% paraformaldehyde במשך 16 שעות ולאחר מכן להכפיף אותם לניתוח.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. דווח על נתונים כמותיים כממוצע ± סטיית תקן (SD). ביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה מסחרית.
  2. השתמש במבחן t של התלמיד או ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey כדי לקבוע הבדלים משמעותיים בין קבוצות. P<0.05 ו-P<0.01 מצביעים על הבדלים משמעותיים בין שתי קבוצות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הידרוג'ל HA בעטוף MSC גודלו בתרבית בתווך כונדרוגני בתוספת TGFβ3, גורם לכונדרוגנזה41 (שלב 4.1). השווינו את התכונות של HA עם אלה של קולגן, אשר הוכח כיעיל ביצירת שתלי סחוס מלאכותיים מבוססי MSC עבור ossification endochondral, כפי שתואר קודם38. MSCs לא ממוינים לא נכללו כבקרות שליליות במחקר זה מכיוון שהוכח כי MSCs לא ממוינים דורשים משטחים מינרליים כמצע ראשוני ליצירת עצם על ידי התמיינות אוסטאוגנית (כלומר, אוסיפיקציה תוך ממברנלית)7.

גודלם של ההידרוג'לים ההיאלורוניים לא השתנה לאורך כל תקופת תרבית המבחנה , כפי שנשפט על סמך קטרים שנמדדו במיקרוסקופ הפוך, בעוד שהידרוג'ל הקולגן ששימש להשוואה החל להתכווץ זמן קצר לאחר תחילת התרבית. כדי להפחית את הבדלי הגודל בין מבנה החומצה ההיאלורונית לבין מבנה הקולגן לאחר תרבית חוץ-גופית , מספר MSCs ונפח הג'ל המשמש ליצירת הידרוג'ל HA הופחתו בחצי בהשוואה לאלה המשמשים להידרוג'ל קולגן. עם זאת, המשקל הרטוב של מבני חומצה היאלורונית לאחר 3 שבועות של תרבית סחוס היה כבד פי 4 מזה של מבני הקולגן.

התמיינות כונדרוגנית והיפרטרופית במבחנה.
לאחר התמיינות כונדרוגנית (בשבוע 3 של תרבית במבחנה ), גליקוזאמינוגליקנים סולפטים (sGAG)-חיוביים (ספרנין O/צביעה ירוקה מהירה; איור 3A) ומטריצת קולגן חוץ-תאית חיובית מסוג II נצפתה בשני המבנים, מה שמצביע על כך שגם HA וגם קולגן הידרוג'ל תמכו בכונדרוגנזה. עם זאת, בהשוואה למבנה הקולגן, התפלגות sGAG, קולגן מסוג II (Col II) וקולגן מסוג X (Col X) הייתה הומוגנית יותר בכל הרקמה במבני חומצה היאלורונית (HA). הבדלים בין שני המבנים ניכרו גם במורפולוגיה של התא: תאים בעלי מורפולוגיה מעוגלת דמוית כונדרוציטים התפזרו ברחבי הרקמה במבני HA. במבני הקולגן, לעומת זאת, התאים בפריפריה הראו מורפולוגיה הטרוגנית, הנעה בין מורפולוגיה לא סדירה/מתוחה למורפולוגיה מעוגלת. בהתאם לכך, המעוגלות הממוצעת של תאים במבני חומצה היאלורונית הייתה גבוהה יותר מאשר במבני הקולגן, הן באזור הפריפריה והן באזור המרכז (34% לעומת 77.6% (p<0.01) ו-78.3% לעומת 100% (p<0.05), בהתאמה; איור 3B). לאחר 5 שבועות של תרבית, שקיעת סידן זוהתה בקצוות החיצוניים בשני המבנים (אדום אליזרין; איור 3C). יתר על כן, ביטוי של סמנים כונדרוגניים (Sox-9, aggrecan (ACAN), Col II), היפרטרופיים (Col X, metallopeptidase matrix 13 (MMP-13)), ואוסטאוגניים (קולגן מסוג I (Col I), סיאלופרוטאין עצם (BSP), אוסטיאוקלצין (OCN)) סמנים14 זוהה על ידי RT-PCR כמותי בזמן אמת, המאשר את התקדמות התמיינות כונדרוגנית והיפרטרופית במהלך תרבית חוץ גופית (איור 4).

אוסיפיקציה אנדוכונדרלית של מבנים מושתלים תת עורית in vivo.
כיסים תת-עוריים נוצרו על גבם של עכברים עירומים, ושניים עד שלושה מבנים הושתלו בכל כיס לאחר התמיינות היפרטרופית (בשבוע 5 של תרבית חוץ גופית). 4 או 8 שבועות לאחר ההשתלה, כל מבני החומצה ההיאלורונית חוברו זה לזה בכיסים המושתלים (טבלה 1). במבני הקולגן נצפתה הידבקות ב-60% מהכיסים, ואילו בכיסים הנותרים השתלים היו בלתי תלויים זה בזה. צביעת Hematoxylin ו-eosin (H&E) גילתה שבשני המבנים לאחר 8 שבועות לאחר ההשתלה, רקמת אוסטאואיד עם מורפולוגיה למלרית נוצרה באזורים החיצוניים של המבנים (איור 5Aa,f). צביעת sGAG נעלמה במבני ה-HA, מה שמצביע על אובדן פנוטיפ הסחוס שלהם (איור 5Ah). בשני המבנים נוצר מרכיב מח עצם המכיל תאים המטופויטיים ורקמת שומן בין הסחוס הפנימי לבין רקמות האוסטואידים החיצוניות. בכל מבני החומצה ההיאלורונית רקמות העצם של המבנים המאוחים היו מחוברות ומוקפות ברקמה סיבית משותפת ובמח עצם שהתפתחו לאורך החלל שבין שני המבנים הדבקים, מה שמצביע על כך שמבני חומצה היאלורונית מרובים נוטים ליצור רקמת עצם משולבת (איור 5Ag). מבני הקולגן המודבקים שולבו באופן דומה בשניים מתוך שלושת המקרים המאוחים, אולם במקרה השלישי רקמת העצם של שני המבנים לא הייתה מחוברת (טבלה 1 ואיור 5Ab). בשני המבנים, כלי דם שזוהו על-ידי תאי אנדותל חיוביים ל-CD3142 נצפו במח העצם (איורים 5Ad,i), ואזורי הסחוס הפנימי היו מוקפים בתאים מרובי גרעינים חיוביים ל-TRAP של שושלת האוסטאוקלסט, מה שמצביע על כך שרקמת הסחוס הייתה נתונה לעיצוב מחדש (איורים 5Ae,j).

מינרל שוקע באזור האוסטואידים החיצוני גם במבנה HA וגם במבנה הקולגן (איור 5B). בעוד שצפיפות המינרלים הכוללת של העצם החדשה הייתה דומה בין מבני HA וקולגן, נפח המינרלים היה גבוה משמעותית במבני HA מאשר במבני הקולגן, מה שעשוי לשקף את העובדה שהידרוג'ל HA לא התכווץ במהלך תרבית במבחנה , וכתוצאה מכך נוצרו מבנים גדולים יותר מאשר הידרוג'ל קולגן (איור 5C, ד).

Figure 1
איור 1: תכנון ניסויי. הצעד הראשון של פרוטוקול זה הוא לתמצת MSCs מורחבים בהידרוג'לים של HA כדי לקדם התמיינות כונדרוגנית והיפרטרופית במבחנה. מבנים מתורבתים בתנאי התמיינות כונדרוגניים במשך 3 שבועות, ולאחר מכן שבועיים נוספים בתנאי התמיינות היפרטרופיים. השלב השני של פרוטוקול זה הוא להשתיל תת עורית את המבנים בעכברים עירומים בשבוע 5 של תרבית חוץ גופית כדי לעבור ossification endochondral in vivo במשך 8 שבועות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכנת הידרוג'לים מזרעי MSCs. זרוק תמיסת HA/crosslinker שונה המכילה MSCs על צלחת מצופה פרפין בעלת 24 בארות ואפשר לה להתמצק ב-37°C למשך 30 דקות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי של מבני חומצה היאלורונית וקולגן לאחר תרבית חוץ גופית 22. (A) מבנים בתרבית חוץ גופית של 3 שבועות (3W) הוכתמו עבור sGAG (ספרנין O/ירוק מהיר), קולגן מסוג II (Col II) וקולגן מסוג X (Col X). (B) ערכי המעגליות הממוצעים של תאים לאחר 3 שבועות של תרבית חוץ גופית (n = 5). פסים פתוחים ואפורים מצביעים על מבני קולגן וחומצה היאלורונית בהתאמה. קבוצות ללא אות משותפת שונות סטטיסטית (a לעומת b, p<0.01; b לעומת c, p<0.05). (C) מבנים בגיל 5 שבועות (5W) של תרבית חוץ גופית הוכתמו לסידן (אדום אליזרין). כל התמונות צולמו באותה הגדלה (סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר). סקירה כללית של הגדלה נמוכה של כל הרקמות מוצגת בכניסות (סרגל קנה מידה: 1 מ"מ). קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (SD). מבחן ANOVA החד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי שימשו לקביעת הבדלים משמעותיים בין קבוצות. נתון זה שונהמ-38. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח ביטוי גנים של מבני חומצה היאלורונית וקולגן לאחר 3 ו-5 שבועות של תרבית חוץ גופית. (A) סמנים כונדרוגניים והיפרטרופיים. (B) סמנים אוסטאוגניים. הערכים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD) (n = 3). MSCs לא מובחנים ביטאו רמות גבוהות של Col I ו-MMP-13 ורמות נמוכות של Sox-9 ו-Col X; הם לא ביטאו (#) ACAN, Col II, BSP ו- OCN. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (SD). נתון זה שונהמ-38. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח אימונוהיסטוכימי והסתיידות של מבני HA וקולגן לאחר ההשתלה לאחר 8 שבועות. (A) מבנים הוכתמו עבור Hematoxylin ו-Eosin (H&E, a, b, f ו-g), ספרנין O/Fast Green (c ו-h), תאי אנדותל (Cluster of Differentiation 31, CD31) (d ו-i), וחומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP, e ו-j). (א ו-ו) סקירה כללית של הרקמות השלמות (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). H&E, ספרנין O, CD31: סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר; מלכודת: סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. חצים מציינים תאי אנדותל חיוביים ל- CD31. קיצורים: c = רקמת סחוס פנימית; o = רקמת אוסטואיד חיצונית. (B) הדמיית MicroCT (μCT) של קונסטרוקציות קולגן וחומצה היאלורונית (פסי קנה מידה ראשיים ומשובצים של תמונה = 2 מ"מ). (ג,ד) צפיפות המינרלים הכוללת (C) והנפח (D) של מבני HA וקולגן (n = 4). ** מצביע על הבדלים משמעותיים; עמ' <0.01. ארבעה מבנים נותחו לכל קבוצה באמצעות μCT. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (SD). מבחן t של תלמיד שימש כדי לקבוע הבדלים משמעותיים בין קבוצות. נתון זה שונהמ-38. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: אסטרטגיה להקלה על ECOs באמצעות סחוס מלאכותי מבוסס HA. תרשים סכמטי של אוסיפיקציה והתפתחות מח עצם ללא ועם פיצול (μ-כדוריות) של מבני HA מושתלים. (A) להידרוג'ל HA יש נטיית איחוי מצוינת ליצירת עצם משולבת עם וסקולריזציה והתפתחות מח מוח בין שתלים מאוחים in vivo. הרקמה המושתלת שהתקבלה, לעומת זאת, נשארה בעיקר במצב סחוס גם 8 שבועות לאחר ההשתלה. (B) בהתחשב בנטייה של מבני HA להתיך ליצירת עצם משולבת, עיבוד מבני HA לכדוריות μ עשוי להאיץ את קצב העיצוב מחדש של רקמות מושתלות ולקדם את היווצרות העצם. מיקרוניזציה של המבנים מגדילה את שטח הפנים, מה שעשוי לקדם ספיגה מחדש של רקמת סחוס והיווצרות רקמת עצם ועשוי גם לקדם אנגיוגנזה והתפתחות מח עצם בגלל הגדלת השטח לחדירת תאים מארחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הידרוג'ל ניסויים דבק ארצות % יונייטד
קולגן 5 3 2 40
הא 5 5 5 100

טבלה 1: שיעור האיחוד כאשר הושתלו מבנים מרובים בכיס אחד. שניים או שלושה מבנים הושתלו תת עורית בכיס אחד. המבנים נקצרו 4 או 8 שבועות לאחר ההשתלה ונבדקו היסטולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שימוש בחומרי פיגומים מתאימים המקדמים את המעבר מסחוס היפרטרופי לעצם הוא גישה מבטיחה להרחבת שתלי סחוס היפרטרופיים מהונדסים מבוססי MSC ולטיפול במומי עצם בגודל משמעותי מבחינה קלינית. כאן, אנו מראים כי HA הוא חומר פיגום מצוין לתמיכה בהתמיינות של רקמת סחוס היפרטרופית מבוססת MSC במבחנה ולקידום היווצרות עצם אנדוכונדרלית in vivo38. יתר על כן, in vivo, מבני HA הוכחו כמאפשרים איחוי של מבנים מרובים שהושתלו באותו כיס ליצירת עצם משולבת אחת. מכיוון שהאינטראקציה של MSCs עם חומרי פיגומים משפיעה באופן משמעותי על הסחוס והכונדרוגנזה ההיפרטרופית, בחירת חומר פיגום מתאים עבור ECOs חשובה ליצירת שתלי סחוס מהונדסים רקמה יעילים מבחינה קלינית. תאים המשובצים בהידרוג'ל HA מציגים באופן אחיד מורפולוגיה מעוגלת האופיינית לכונדרוציטים מהמרכז לפריפריה, מה שמצביע על כך שהיאלורונן מספק סביבה המסייעת להיווצרות סחוס אחידה לאורך ההידרוג'ל21,30. שלא כמו חומצה היאלורונית (HA), קולגן מקיים אינטראקציה עם MSCs באמצעות רצפי קישור אינטגרין (RGD); עם זאת, ההתמדה של אינטראקציה זו מונעת MSCs מהתמיינות נוספת במסלול כונדרוגני43, אשר עשוי להסביר את המורפולוגיה הלא אופיינית של תאי כונדרוציטים הבולטת בפריפריה של מבני קולגן.

אם שתלים מרובים מתאחדים ליצירת עצם אחת, ניתן להרחיב גישה זו בתיווך אקולוגי לפגמי עצם רלוונטיים יותר מבחינה קלינית. כאשר מספר סחוס היפרטרופי מבוסס MSC וללא פיגומים הוחל על פגם עצם יחיד, דווח כי שתלי הסחוס השתלבו עם פגם העצם. עם זאת, שתלים סמוכים לא השתלבו זה עם זה22. הגישה המוצגת כאן עשויה להציע פתרון אפשרי אחד להתגברות על מגבלה זו. בהשוואה למבני קולגן, לשתלים מרובים של מבני חומצה היאלורונית הייתה נטייה גדולה יותר להתמזג וליצור עצם אחת. יתר על כן, מח עצם נוצר בין מבני HA מאוחים, מה שעשוי להיות קשור לעובדה שחומצה היאלורונית תומכת בהתמיינות סחוס אחידה לאורך כל ההידרוג'ל מכיוון שסחוס היפרטרופי מפריש VEGF ומספק סביבה לנישה ההמטופויטית של תאי גזע בהתפתחות מח עצם 44.

המפתח לניסוי מוצלח באמצעות פרוטוקול זה הוא האיכות של MSCs. מומלץ מראש לאשר כי MSCs לשימוש יש פוטנציאל התמיינות כונדרוגנית גבוה מספיק. שנית, הגודל של כל מבנה לא צריך להיות גדול מדי. מניסיוננו, נפחו של מבנה בודד מוגבל ל-10-15 מיקרוליטר. מבנים גדולים יותר עלולים לגרום לחדירה לא מספקת של חמצן וחומרי מזון לתוך המבנים, מה שמוביל לנמק ולהתמיינות לקויה במרכז המבנים. לכן, עובי הג'ל צריך להיות מופחת כדי לשפר את חדירת החמצן והחומרים המזינים. על מנת להפחית את עובי הג'ל, זה עשוי להיות מועיל ליצור ג'לים דקים על הממברנה הנקבובית של Transwell מוסיף14,45. לחלופין, מכיוון שמבני חומצה היאלורונית נוטים להתיך וליצור עצם משולבת, ייתכן שיהיה מספיק להשתיל מבנים קטנים רבים ולא מבנה גדול אחד, כפי שנדון להלן.

מגבלות מחקר זה כוללות את הצורך להאיץ את קצב העיצוב מחדש של הרקמות המושתלות, כדי להקל על היווצרות העצם. הרקמה המהונדסת המושתלת נשארה בעיקר במצב סחוס היפרטרופי מסויד גם 8 שבועות לאחר ההשתלה. ביצירת עצם דרך מסלול ECO, תאים שמקורם בפונדקאי ממלאים תפקיד קריטי בקידום ECO16,46. דווח כי אספקת תעלות נוספות בשתלי סחוס היפרטרופיים מקדמת פלישה וסקולרית ומינרליזציה של השתלים in vivo20. תעלות כאלה משמשות כצינורות לחדירה של תאים מארחים, כולל אוסטאובלסטים, אוסטאוקלסטים ומבשרי המטופויטים, ליצירת רקמה חדשה בתוך המבנה. לחלופין, דווח כי ניתן להשתיל מספר כדוריות קטנות עטופות פיברין (μ-pellets) המורכבות מ-MSCs ממוינים כונדרוגניים ליצירת עצםמשולבת 47. עיבוד מבני HA לכדוריות μ יכול להגדיל את שטח הפנים המוקף באוסטאוקלסטים חיוביים ל-TRAP, ובכך לקדם את קצב העיצוב מחדש של רקמת הסחוס ולהגביר אוסטאוגנזה (איור 6)21,48. יתר על כן, השתלת כדורי μ תגדיל את חלל החדירה של תאים מארחים, ובכך תקל על התפתחות אנגיוגנזה ומח עצם ותיצור היווצרות עצם אינטגרלית עם כלי דם שופעים. לכן, בהתחשב בנטייה של מבני HA להתיך וליצור עצם משולבת, אסטרטגיית התחדשות עצם זו שנבנתה μ עשויה להאיץ את תהליך ECO של שתלי סחוס היפרטרופיים באמצעות הידרוג'ל HA.

לסיכום, הידרוג'ל HA יעיל בהגדלת שתלים מהונדסים רקמות עם פחות תאים וג'לים מאשר הידרוג'ל קולגן. בנוסף, הידרוג'ל HA הוא בעל רגישות מעולה לאיחוי ומייצר עצם משולבת עם כלי דם והתפתחות מח מוח בין שתלים מאוחים. לכן, שינוי של מבני חומצה היאלורונית כדי לקדם הסננה של תאים מארחים ועיצוב מחדש של השתלים עשוי להוביל לפיתוח חומרים מושתלים שיכולים לקדם עוד יותר את כלי הדם ואת התפתחות מח העצם. עם אופטימיזציה נוספת, גישה זו יכולה להיות חלופה מבטיחה לטיפולי העצם הנוכחיים בכירורגיה לסת ואורתופדית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים הצהירו כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי (KAKENHI) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מס. JP19K10259 ו- 22K10032 ל- MAI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues--the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Tags

תאי גזע מזנכימליים טיפול בהתחדשות עצם אנגיוגנזה אוסיפיקציה אנדוכונדרלית רקמת סחוס מלאכותית פגם בעצם יישום קליני פרוטוקול הידרוג'לים שתלים מהונדסים רקמות חומצה היאלורונית (HA)
היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית <em>in vivo</em> באמצעות תאי גזע מזנכימליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., … More

Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. A. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter