Summary
Questo articolo delinea una procedura passo passo per stabilire un modello di topi con una fistola oronasale. La fistola oronasale è stata creata impiegando un cauterizzatore oftalmologico riscaldato per danneggiare la porzione mediana del palato duro, con conseguente formazione di un'apertura tra le cavità orali e nasali.
Abstract
Questo studio presenta un metodo che utilizza il cauterizzazione oftalmologica riscaldata per sviluppare un modello praticabile per lo studio delle fistole oronasali. I topi C57BL/6 sono stati utilizzati per stabilire il modello di fistola oronasale (ONF). Per creare l'ONF, i topi sono stati anestetizzati e immobilizzati e i loro palati duri sono stati esposti. Durante la procedura chirurgica, è stata indotta una lesione della mucosa a tutto spessore di 2,0 x 1,5 mm nella linea mediana del palato duro utilizzando la cauterizzazione oftalmologica. Era fondamentale controllare le dimensioni dell'ONF e ridurre al minimo il sanguinamento per garantire il successo dell'esperimento. La verifica dell'efficacia del modello ONF è stata condotta il 7° giorno dopo l'intervento, comprendendo sia valutazioni anatomiche che funzionali. La presenza del setto nasale all'interno della cavità orale e il deflusso di acqua sterile dalle narici al momento dell'iniezione nella cavità orale hanno confermato il successo del modello ONF. Il modello ha dimostrato una fistola oronasale pratica e di successo, caratterizzata da un basso tasso di mortalità, variazioni di peso significative e variazioni minime nelle dimensioni dell'ONF. Studi futuri potrebbero prendere in considerazione l'adozione di questa metodologia per chiarire i meccanismi di guarigione delle ferite del palato ed esplorare nuovi trattamenti per le fistole oronasali.
Introduction
La fistola oronasale (ONF), un'apertura anomala tra la cavità orale e quella nasale, si manifesta clinicamente come un difetto in un'area strutturale dal processo alveolare all'ugola, che si verifica comunemente come complicanza dopo la riparazione della palatoschisi1. I pazienti con ONF soffrono di reflusso alimentare, disturbi articolari e compromissione della funzione velofaringea, con un impatto significativo sulla qualità della vita 2,3,4. Il tasso di ONF post-operatoria varia dal 2,4% al 55% a causa di fattori quali la larghezza della schisi, il tipo di Veau e il metodo chirurgico 5,6,7,8. Inoltre, il tasso di recidiva dopo la riparazione dell'ONF è elevato, compreso tra lo 0% e il 43%9.
Diversi nuovi trattamenti si sono recentemente dimostrati promettenti nel campo dell'ONF, tra cui diversi materiali, farmaci e nuove tecniche 10,11,12,13,14,15,16,17. Una valutazione accurata degli effetti terapeutici è essenziale in quanto fornisce la base per la selezione e l'ulteriore sviluppo dei trattamenti per l'ONF. Tuttavia, ottenere una valutazione valida a breve termine per gli effetti terapeutici diversi dalla chirurgia è difficile, poiché le caratteristiche degli ONF variano tra i diversi pazienti. Pertanto, è necessario stabilire un modello di malattia ONF per verificare l'efficacia di questi metodi di trattamento.
Per diversi decenni, i ricercatori hanno generato il modello della fistola oronasale (ONF) in varie specie animali, tra cui ratti18,19, suinetti20,21, minipig22 e cani23, poiché queste specie possiedono un palato duro sostanziale adatto alla manipolazione chirurgica. Tuttavia, i topi hanno una sequenza genetica e un intero genoma simili a quelli degli esseri umani, il che li rende un modello importante per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci24,25,26. Inoltre, i topi offrono poche variazioni da lotto a lotto, il che li rende una scelta favorevole per stabilire il modello ONF12,13,27.
Tuttavia, i passaggi dettagliati per la creazione di ONF non sono stati descritti e la stabilità delle dimensioni ONF non è stata presa in considerazione. Inoltre, la verifica della formazione di ONF si basava esclusivamente sull'osservazione28, senza garantire la comunicazione diretta tra la cavità orale e quella nasale. Non è stato dimostrato con altri mezzi, come la perdita di peso corporeo del topo a causa delle difficoltà alimentari causate dall'ONF. Inoltre, non è stata presa in considerazione la normale variazione delle dimensioni della ferita, che è fondamentale per gli studi su farmaci o materiali che promuovono o inibiscono la guarigione della ferita. Pertanto, vi è una forte necessità di stabilire un modello ONF stabile e convalidato.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello pratico di ONF che affronti le questioni di cui sopra, con la speranza che questo protocollo serva come base per la ricerca futura sui meccanismi di guarigione delle ferite palatali e nuovi trattamenti per l'ONF.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico della Scuola di Stomatologia della Cina Occidentale, Università del Sichuan. Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 (femmine).
1. Preparazione chirurgica
- Raccogli gli strumenti chirurgici necessari per la procedura: germinatore, cauterizzazione oftalmologica, forbici microchirurgiche, pinzette microchirurgiche, siringhe e aghi (26 g x 0,63 pollici) (Figura 1A,B) (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Prima della procedura chirurgica, sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici, inclusi il cauterizzatore oftalmologico, le pinzette microchirurgiche e le forbici microchirurgiche, a 102,9 kPa (1,05 kg/cm2) e 121 °C per 20 minuti. - Raccogliere le forniture chirurgiche necessarie: teli chirurgici, guanti in lattice, cotone sterile, fogli sterili, fogli di metallo sterili, pannelli di schiuma come piattaforma chirurgica, elastici (che possono essere ottenuti strappando un guanto in lattice medico) e nastro adesivo (Figura 1C) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Utilizzare un set separato di materiali di consumo per ciascun topo, comprese siringhe e fogli sterili per il campo chirurgico. - Pulire l'area chirurgica e l'apparecchio (sorgente luminosa, pannello in schiuma e dispositivo di mantenimento della temperatura, vedere la tabella dei materiali) utilizzando salviette imbevute di alcol. Coprire le manopole e le maniglie degli strumenti che potrebbero essere necessari durante la procedura con un foglio di metallo sterile.
- Aprire in modo asettico i singoli strumenti e posizionarli con cura nell'area chirurgica. Attivare il germinatore (vedi Tabella dei materiali) e le luci per l'uso durante la procedura. Mettere il cauterizzazione oftalmologica nel germinatore e riscaldarlo a 250 °C per 20 min.
2. Procedura chirurgica
- Eseguire la fissazione del mouse e aprire la cavità orale seguendo i passaggi seguenti.
- Selezionare una femmina di topo C57BL/6J del peso di 20-25 g e di 8-12 settimane. Tenere a casa il topo per 7 giorni prima di eseguire qualsiasi procedura.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di Zoletil50 (80 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali). Applicare un unguento oftalmico per gli occhi sull'occhio del topo. Attendi fino a quando non c'è una risposta di pizzicamento delle dita dei piedi.
NOTA: Il mouse è pronto per la procedura quando non è in grado di capovolgersi autonomamente. - Fissare il mouse a un pannello di schiuma rivestito con fogli sterili. Utilizzare del nastro adesivo per legare il mouse alla piattaforma chirurgica in posizione supina (Figura 2A).
- Aprire la cavità orale del topo. Posizionare due aghi (26 g x 0,63 pollici) davanti al piano orbitale dell'orecchio e altri due dietro di esso. Metti un elastico intorno agli aghi e incrocia gli incisivi per tenere la bocca aperta. Utilizzare una pinzetta microchirurgica per aprire gli angoli della bocca (Figura 2B).
NOTA: Assicurarsi che il palato duro sia chiaramente esposto. Fissare la linguetta sotto l'elastico per evitare l'ostruzione del campo visivo e il bruciore durante gli esperimenti successivi.
- Creare la fistola oronasale (ONF) sul palato duro (Figura 3A-F).
- Recuperare il cauterizzazione oftalmologica, che è stato riscaldato a 250 °C per 20 min. Posizionare la punta del cauterismo a 1 mm di distanza dall'intersezione tra la linea mediana del palato e la linea del primo premolare, creando una lesione della mucosa a tutto spessore al palato duro nella linea mediana.
NOTA: Evitare di scottare la lingua del mouse. - Dopo alcuni secondi, rimuovere il cauterismo oftalmologico quando la mucosa intorno alla punta del cauterio diventa bianca.
- Posizionare il cauterizzazione oftalmologica nel germinatore e continuare a riscaldarlo a 250 °C per 10 min. Ripetere il passaggio precedente per allargare la ferita lungo i bordi fino a raggiungere una lunghezza di 2,0 mm e una larghezza di 1,5 mm.
NOTA: Ogni estensione deve seguire il bordo dell'ultima lesione. Usa un calibro a corsoio per misurare la lunghezza e la larghezza della lesione. La lesione dovrebbe coprire il 10% del palato. - Utilizzare forbici microchirurgiche per rimuovere i tessuti molli denaturati in eccesso intorno alla ferita. Utilizzare cotone sterile per fermare l'emorragia e prevenire l'asfissia per inalazione del topo. Misurare la ferita per assicurarsi che formi una lesione della mucosa del palato duro a tutto spessore che misura 2,0 x 1,5 mm nella linea mediana.
- Recuperare il cauterizzazione oftalmologica, che è stato riscaldato a 250 °C per 20 min. Posizionare la punta del cauterismo a 1 mm di distanza dall'intersezione tra la linea mediana del palato e la linea del primo premolare, creando una lesione della mucosa a tutto spessore al palato duro nella linea mediana.
3. Cure post-operatorie
- Somministrare Meloxicam al topo al momento del risveglio postoperatorio, alla dose di 5 mg/kg/die per 3 giorni, per via sottocutanea29.
- Posizionare il mouse su un dispositivo di mantenimento della temperatura fino a quando non riprende completamente conoscenza.
NOTA: Assicurarsi che il mouse sia posizionato in modo da facilitare la respirazione. Ruotare i topi ogni 10-15 minuti per prevenire il ristagno di sangue o il collasso dei lobi polmonari. Una volta che il topo si è riscaldato, rimettilo nella sua gabbia. Fornire gelatina sterile e mangime irradiato sul fondo della gabbia per i topi.
4. Verifica della creazione della fistola oronasale
NOTA: Il successo della creazione della fistola oronasale (ONF) viene valutato il 7° giorno successivo alla procedura chirurgica.
- Preparare le forniture chirurgiche necessarie: elastico, nastro adesivo, siringhe, teli chirurgici, guanti in lattice, fogli sterili, fogli di metallo sterili e pannelli di schiuma.
- Indossare teli chirurgici e guanti sterili per mantenere le condizioni asettiche. Disinfettare il pannello in schiuma, la fonte di luce e il dispositivo di mantenimento della temperatura con alcol.
- Indurre l'anestesia generale mediante iniezione intraperitoneale di Zoletil50 (80 mg/kg). Attendi fino a quando non c'è una risposta di pizzicamento delle dita dei piedi. Utilizzare lo stesso metodo descritto nei passaggi 2.1.3 e 2.1.4 per immobilizzare il mouse ed esporre il palato duro.
- Eseguire la verifica strutturale anatomica assicurandosi che il setto sia ancora visibile nel sito della ferita, indicando la corretta creazione di ONF (Figura 4A,B).
- Eseguire la verifica funzionale: chiudere la cavità orale del topo e iniettare acqua sterile nella sua cavità orale utilizzando una siringa sterile. Il successo della creazione di ONF è confermato quando il fluido scorre dalle narici del topo.
- Posizionare il mouse sul dispositivo di mantenimento della temperatura (37 °C) fino a quando non riprende completamente conoscenza. Ruotare i topi ogni 10-15 minuti per prevenire il ristagno di sangue o il collasso dei lobi polmonari.
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Representative Results
Per valutare la fattibilità e la stabilità di questo metodo sperimentale, la stessa procedura è stata eseguita su dieci topi e sono state fatte osservazioni riguardanti la mortalità, i cambiamenti nelle dimensioni della ferita, il peso corporeo e l'analisi istologica. I topi sono stati soppressi il giorno 7.
La procedura ha mostrato un basso tasso di mortalità. Il cauterizzazione oftalmologica e il germinatore, raffigurati nella Figura 1A-C, sono stati gli strumenti chiave utilizzati in questo esperimento. Il modello ONF è stato creato in base al protocollo fornito. Tra i dieci topi operati, solo uno è deceduto il 7° giorno dopo l'operazione. Il tasso di mortalità complessivo durante l'esperimento è stato di circa il 10%.
I risultati hanno rivelato una notevole variabilità nella dimensione dell'ONF generato utilizzando il metodo descritto. Il giorno dell'intervento, tutti i topi presentavano ferite di forma ovale che misuravano 2,0 mm di lunghezza e 1,5 mm di larghezza. Quando si è valutata la formazione di ONF il 7° giorno dopo l'intervento chirurgico, è stata osservata una variazione significativa nelle dimensioni dell'ONF (P = 0,0085) (Figura 5A,B).
La presenza di ONF può causare complicazioni come reflusso alimentare e difficoltà alimentari, portando potenzialmente a cambiamenti di peso. Pertanto, è stato preso in considerazione anche il peso corporeo dei topi. I topi sono stati pesati il giorno dell'intervento chirurgico (giorno 1) e il 7° giorno (giorno 7) quando è stata esaminata la formazione di ONF. Una significativa riduzione del peso è stata osservata il giorno 7 rispetto al giorno 1 (P < 0,001) (Figura 6A,B). La perdita di peso corporeo è stata del 25,16%.
Per l'analisi istologica, sia la ferita che il tessuto normale sono stati prelevati dai topi il giorno 7. Palati isolati sono stati utilizzati come campioni per il sezionamento istologico. Sono stati inseriti in scatole di inclusione tissutale e fissati utilizzando il 4% di paraformaldeide e il 10% di reagente di decalcificazione dell'acido formico. I tessuti sono stati quindi incorporati in paraffina, sezionati in fette di 7 μm lungo i piani coronali e colorati con ematossilina ed eosina (H&E). L'analisi istologica dell'ONF ha rivelato la perdita della mucosa del palato duro, l'osso denudato e la formazione di ONF (Figura 7). È stata eseguita un'analisi istologica dei polmoni e non sono state rilevate anomalie tra topi normali e ONF.
Figura 1: Strumenti e forniture chirurgiche . (A) Il germinatore utilizzato per riscaldare il cauterizzazione oftalmologica. (B) Strumenti chirurgici: cauterizzazione oftalmologica, forbici microchirurgiche, pinzette microchirurgiche, siringhe e aghi (26 g x 0,63 pollici). (C) Forniture chirurgiche: teli chirurgici, guanti sterili, cotone sterile, fogli sterili, fogli metallici sterili, pannelli di schiuma, elastici e nastro adesivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fissazione del topo e apertura del cavo orale . (A) Gli arti anteriori del topo sono stati fissati con del nastro adesivo. (B) Gli aghi della siringa sono stati inseriti nel pannello di schiuma e un elastico è stato posizionato sopra gli aghi. La cavità orale del topo è stata aperta utilizzando un elastico e pinzette microchirurgiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Creazione della fistola oronasale . (A) Esposizione del cavo orale. (B) Posizionamento della punta del cauterizzazione oftalmologica sulla porzione mediana del palato duro. (C) Rimozione del cauterizzazione oftalmologica. (D) Rimozione dei tessuti molli in eccesso intorno alla ferita utilizzando forbici microchirurgiche. (E) Fermare l'emorragia utilizzando cotone sterile. (F) Ferita palatale formatasi definitivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esame della ferita palatale il 7° giorno dopo l'intervento . (A) Ferita palatale il giorno 1. (B) Ferita palatale il giorno 7. Le frecce bianche indicano la fistola oronasale (ONF). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Dimensione della ferita palatale il giorno 1 e il giorno 7. (A) Valori medi per i topi nei giorni 1 e 7. (B) Differenza significativa verificata utilizzando il test t dei campioni appaiati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Peso dei topi il giorno 1 e il giorno 7. (A) Valori medi per i topi il giorno 1 e il giorno 7. (B) Differenza significativa verificata utilizzando il test t dei campioni appaiati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Osservazione istologica. L'analisi istologica dell'ONF mostra la perdita della mucosa del palato duro, l'osso denudato e la formazione di ONF. (A) Fistola oronasale il giorno 7, ingrandimento: 4x. (B) Fistola oronasale il giorno 7, ingrandimento: 10x. (C) Controllo senza lesioni, ingrandimento: 4x. (D) Controllo senza lesioni, ingrandimento: 10x. La freccia nera mostra la posizione dell'ONF. Barre di scala: A,C = 200 μm; B,D = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I ricercatori hanno esplorato vari materiali, farmaci e nuove tecniche per il trattamento dell'ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. Con i progressi nelle procedure chirurgiche, l'incidenza e la recidiva di ONF sono state ridotte. Tuttavia, a causa delle caratteristiche uniche della malattia, il numero di pazienti ONF in clinica è limitato, rendendo necessario un modello standardizzato per lo studio di potenziali trattamenti. Sebbene siano stati descritti diversi metodi per la creazione di modelli ONF 18,19,20,21,22,23, essi erano spesso brevi e mancavano di una discussione dettagliata del metodo sperimentale. La formazione di ONF è stata verificata attraverso studi microscopici e istologici che ne descrivono le caratteristiche istopatologiche12,13,27. Questo protocollo mirava a stabilire un modello murino riproducibile di ONF per facilitare la ricerca.
Raggiungere la creazione uniforme di ONF ha rappresentato una sfida. Per garantire la riproducibilità, era fondamentale danneggiare uniformemente il palato dei topi. Il controllo del diametro dell'ONF, la riduzione al minimo della guarigione delle ferite e l'arresto efficace dell'emorragia sono stati passaggi chiave nella creazione dell'ONF. Le forbici microchirurgiche sono state utilizzate per rimuovere i tessuti molli in eccesso intorno alla ferita dopo aver utilizzato il cauterizzazione oftalmologica, riducendo così al minimo i cambiamenti nel diametro della ferita durante la fase di guarigione. Tuttavia, l'uso di forbici microchirurgiche per rimuovere il tessuto in eccesso comportava il rischio di sanguinamento significativo e persino la morte dei topi, contribuendo a tassi di mortalità più elevati osservati in altri esperimenti12,13,27. In questo protocollo, la combinazione di forbici microchirurgiche e un cauterizzatore oftalmico emostatico è stata impiegata per denaturare e rimuovere il tessuto in eccesso, mentre il cotone sterile è stato utilizzato per controllare il sanguinamento. Questo metodo ha ridotto significativamente il sanguinamento o addirittura ha raggiunto l'emostasi completa grazie all'effetto cauterizzante del cauterizzatore oftalmico riscaldato.
È stato riportato un metodo alternativo per la creazione del modello ONF nei topi, che prevede l'uso di un punzone da biopsia13,27. Sebbene questo metodo fornisse un migliore controllo sul diametro della ferita a causa delle dimensioni costanti del punzone, aveva un alto tasso di fallimento e poneva sfide nella gestione della forza richiesta, portando potenzialmente alla morte dei topi. Controllare la profondità e la forza della creazione di ONF con questo metodo è stato difficile e determinare se il setto nasale era stato raggiunto è stato impegnativo. Inoltre, il controllo dell'emorragia era problematico e i topi erano a rischio di soffocamento a causa di gravi emorragie durante l'esperimento.
Tuttavia, ci sono dei limiti a questo metodo sperimentale. In primo luogo, la dimensione della ferita non può essere controllata dalla stessa dimensione della fistola in ogni topo rispetto a un punzone da biopsia con una dimensione di diametro fissa. E gli strumenti di misurazione dovrebbero essere utilizzati per massimizzare le dimensioni di ogni fistola. La dimensione della ferita palatale è fondamentale per l'esperimento, poiché la guarigione ritardata della ferita è fondamentale per la formazione di ONF. Pertanto, è importante determinare una dimensione appropriata per la ferita palatale. Se la ferita è troppo piccola, può guarire rapidamente, non soddisfacendo i requisiti di tempo per gli esperimenti successivi. Al contrario, se è troppo grande, i topi possono morire per eccessiva perdita di sangue durante l'intervento chirurgico o avere difficoltà a mangiare dopo l'intervento chirurgico, portando alla fame. Pertanto, è necessario esplorare la dimensione ottimale della ferita palatale. Ciononostante, le dimensioni (2,0 mm x 1,5 mm) utilizzate nell'esperimento in corso sono state ritenute appropriate. In questo protocollo, utilizziamo solo topi femmina, ma è possibile scegliere topi femmina o maschi in base al disegno dello studio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca e sviluppo, dall'ospedale di stomatologia della Cina occidentale, dall'Università del Sichuan (RD-02-202107), dal programma di supporto alla scienza e alla tecnologia della provincia del Sichuan (2022NSFSC0743) e dalla sovvenzione della Fondazione scientifica post-dottorato del Sichuan (TB2022005) a H. Huang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Germinator | Electron Microscopy Sciences | 66118-20 | Heating and disinfection equipment |
| Latex gloves | Allmed | or similar | |
| Lights | Olympus | A1813 | |
| Meloxicam | MedChemExpress | HY-B0261 | crushed; 5 mg/kg |
| Microsurgical instruments (scissors and tweezers) | Jiangsu Tonghui Medical Devices Co. | M-Y-0087 | Surgical instrument |
| Ophthalmologic cautery | Suqian Wenchong Medical Equipment Co. | 1.00234E+13 | Surgical instrument |
| Sterile cotton, | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Sterile metal foil | Biosharp | or similar | |
| Sterile sheets | 3M | XH003801129 | or similar |
| Surgical drapes | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Syringes | Yancheng Begu Technology Co. | S-015301 | or similar |
| Tape | Bkmamlab | or similar | |
| Temperature maintenance device | Harvard Apparatus | LE-13-2104 | |
| Zoletil50 | Virbac | 80 mg/kg |
References
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