Summary
हम एक्सवाई विमान में फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक सरल और सुलभ विधि प्रस्तुत करते हैं। एक कम-गलनांक एगारोस मैट्रिक्स का उपयोग किया गया था, जिससे विभाजन में शामिल प्रोटीन की छवियों के अधिग्रहण की अनुमति मिलती है, एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में। इसलिए, इस पद्धति को किसी भी फिलामेंटस जीव और विभिन्न प्रकार के प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
बैक्टीरियल सेल डिवीजन में एक मुख्य घटना सेप्टेशन प्रक्रिया है, जहां प्रोटीन एफटीएसजेड प्रमुख तत्व है। एफटीएसजेड कोशिका के बीच में एक अंगूठी जैसी संरचना (जेड-रिंग) बनाने के लिए पॉलीमराइज़ करता है जो अन्य डिवीजन प्रोटीन के लिए मचान के रूप में कार्य करता है। बैक्टीरियल मॉडल एस्चेरिचिया कोलाई और बैसिलस सब्टिलिस में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि जेड-रिंग असंतुलित है, जबकि लाइव सेल इमेजिंग अध्ययनों से पता चला है कि एफटीएसजेड ट्रेडमिलिंग नामक तंत्र द्वारा रिंग के साथ चलता है। विवो में एफटीएसजेड की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक्सवाई विमान में अंगूठी की पूरी संरचना की इमेजिंग के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिति में एक विशेष सेल प्लेसमेंट आवश्यक है। बहुकोशिकीय साइनोबैक्टीरिया में एफटीएसजेड इमेजिंग के मामले में, जैसे कि एनाबेना एसपी PCC7120, कोशिकाओं के आकार और फिलामेंट्स की लंबाई के कारण ऊर्ध्वाधर स्थिति में फिलामेंट्स को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है। इस लेख में, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो कम गलनांक एग्रोज और सिरिंज का उपयोग करके एनाबेना एसपी पीसीसी 7120 फिलामेंट्स के ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण की अनुमति देता है, जो एक उत्परिवर्ती में जेड-रिंग को रिकॉर्ड करता है जो एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी संलयन प्रोटीन को व्यक्त करता है। यह विधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डिवीजन साइट पर प्रोटीन गतिशीलता को पंजीकृत करने का एक तेज़ और सस्ता तरीका है।
Introduction
बैक्टीरियल सेल डिवीजन वह प्रक्रिया है जिसमें एक मां कोशिका दो बेटी कोशिकाओं को उत्पन्न करती है, ज्यादातर मामलों में द्विआधारी विखंडन के रूप में जाना जाने वाला तंत्र। सेप्टेशन प्रक्रिया में शुरुआती घटनाओं में से एक सेल1 के बीच में एफटीएसजेड का स्थानीयकरण है। यह प्रोटीन, जो संरचनात्मक रूप से ट्यूबुलिन2 के समरूप है, अधिकांश बैक्टीरिया में संरक्षित और व्यापक रूप से वितरित किया जाता है, और इसका पोलीमराइजेशन एक सिकुड़ा हुआ संरचना उत्पन्न करता है जिसे जेड-रिंग3 के रूप में जाना जाता है। यह अंगूठी अन्य डिवीजन प्रोटीन के लिए एक मचान के रूप में कार्य करती है और साथ में वे एक आणविक मशीनरी बनाते हैं जिसे डिविसोम कहा जाता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि जेड-रिंग अत्यधिक गतिशील है और एफटीएसजेड प्रोटोफिलामेंट्स 4,5,6 ट्रेडमिलिंग द्वारा चलते हैं। टाइम-लैप्स प्रयोगों में जेड-रिंग का अध्ययन करने के लिए, बेहतर रिज़ॉल्यूशन और तेजी से नमूने के लिए एक्सवाई विमान में डिवीजन साइट को रिकॉर्ड करना उचित है। इसे प्राप्त करने के लिए, ऊर्ध्वाधर सेल स्थिरीकरण विधियों को विकसित करना आवश्यक है जिसमें आमतौर पर माइक्रोहोल सेल ट्रैप और जटिल माइक्रोफ्लुइडिकउपकरणों के नैनोफैब्रिकेशन शामिल हैं।
सायनोबैक्टीरिया प्रकाश संश्लेषक सूक्ष्मजीव हैं जिन्हें उनके सेलुलर आकृति विज्ञान द्वारा ग्राम-नकारात्मक के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। हालांकि, फाइटोलैनेटिक रूप से वे ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया8 के करीब हैं। इन जीवों में कोशिका विभाजन जीन होते हैं जो ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के भीतर आम होते हैं, लेकिन उनके विभाजन मेंअद्वितीय तत्व भी होते हैं। पीसीसी 7120 (इसके बाद एनाबेना एसपी) एक डिवीजन प्लेन के साथ फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया है और बहुकोशिकीय साइनोबैक्टीरिया में कोशिका विभाजन के अध्ययन के लिए एक मॉडल है। इस तनाव में, कोशिकाओं10 के बीच में एफटीएसजेड की स्थिति निर्धारित करना संभव हो गया है। फिर भी, इस मॉडल में एफटीएसजेड की विवो गतिशीलता दिखाने वाले कोई अध्ययन नहीं हैं। हमारी प्रयोगशाला में, त्रि-अभिभावकीय संभोग और समरूप पुनर्संयोजन के माध्यम से, हमने एनाबेना एसपी का एक पूरी तरह से अलग उत्परिवर्ती प्राप्त किया जो एसएफजीएफपी से जुड़े एफटीएसजेड प्रोटीन को व्यक्त करता है, जिसने पूर्ण अंतर्जात एफटीएसजेड जीन को बदल दिया। हमने एक तेजी से और सरल सेल स्थिरीकरण विधि विकसित की है जो फिलामेंटस सायनोबैक्टीरिया में विभाजन प्रोटीन की कल्पना करने के लिए समय-चूक प्रयोगों के लिए उत्परिवर्ती तनाव फिलामेंट्स के ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास का समर्थन करती है। इस विधि को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की आवश्यकता नहीं है जो महंगे और विकसित करने में मुश्किल हो सकते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हमने कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी उत्परिवर्ती में जेड-रिंग की कल्पना करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया।
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Protocol
1. सेलुलर मॉडल के विचार और चयन
नोट: प्रकाश संश्लेषक वर्णक की उपस्थिति के कारण सायनोबैक्टीरिया में एक मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस होता है। यह संकेत स्पेक्ट्रम के लाल हिस्से में है, इसलिए, साइनोबैक्टीरिया में इमेजिंग के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन वे हैं जो लाल उत्सर्जन से दूर हैं। उदाहरण के लिए, जीएफपी, वाईएफपी, शुक्र, फ़िरोज़ा और बीएफपी।
- लक्ष्य फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियल तनाव में मौजूद एक डिविसोम घटक का चयन करें। प्रयोगों के लिए, एक फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियल उत्परिवर्ती का निर्माण करना आवश्यक है जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े चयनित डिविसोम घटक को व्यक्त करता है। इस प्रोटोकॉल में, एक एनाबेना एसपी उत्परिवर्ती जो एफएसटीजेड-एसएफजीएफपी को एक उदाहरण के रूप में व्यक्त करता है। यह तनाव ई कोलाई11 के साथ त्रि-अभिभावकीय संभोग द्वारा प्राप्त किया गया था।
- उपयोग किए जाने वाले उत्परिवर्ती के अलगाव स्तर की जांच करें। उदाहरण में, अलगाव लक्ष्य जीन के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा निर्धारित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी उत्परिवर्ती एक पूरी तरह से अलग तनाव है जिसमें जंगली प्रकार के एफटीएसजेड जीन की कमी है।
2. विकास की स्थिति
- स्थिर चरण में 10 एमएल कल्चर का उपयोग करके उत्परिवर्ती का एक ताजा उपसंस्कृति बनाएं (लगातार प्रकाश में लगभग 14 दिनों के लिए उगाया जाता है, 25 डिग्री सेल्सियस पर, एनाबेना एसपी के लिए) और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक बीजी 11 माध्यम के 90 एमएल में जोड़ना (एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी उत्परिवर्ती के लिए स्पेक्टिनोमाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन 10 μl ml-1 )।
- घातीय चरण तक पहुंचने तक निरंतर प्रकाश में और इष्टतम तापमान पर नई सेल संस्कृति विकसित करें। एनाबेना एसपी के एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी उत्परिवर्ती को नमूना तैयार करने से पहले 7 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है।
3. एक अगारोस मैट्रिक्स में नमूना तैयारी।
- होमोजिनाइज्ड ग्रोथ कल्चर का 2 एमएल लें।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
- इस बीच, 50 एमएल फ्लास्क में, बीजी 11 तरल माध्यम में 3% कम गलनांक के 30 एमएल को गर्म करें। मध्यम बिजली स्तर पर माइक्रोवेव सेट का उपयोग करें और पूरी तरह से घुलने तक हर 15 सेकंड में समाधान की जांच करें। 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने के लिए अलग रखें।
नोट: संदूषण से बचने के लिए अगारोस के समाधान को आटोक्लेव करें। - एक बार सेंट्रीफ्यूजेशन हो जाने के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 1.9 एमएल को छोड़ दें और कम से कम तीन बार ऊपर और नीचे पाइप करके शेष मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- पुन: निलंबित कोशिकाओं को कम से कम तीन बार ऊपर और नीचे पाइप करके 3% एगारोस समाधान के 900 μL के साथ मिलाएं।
नोट: अगारोस समाधान तरल होना चाहिए लेकिन सेल क्षति से बचने के लिए बहुत गर्म नहीं होना चाहिए। अगला चरण तेजी से किया जाना चाहिए और इससे पहले कि अगारोस समाधान स्थिरता की तरह एक जेल बनाता है = - 1 एमएल सिरिंज में एगारोस मैट्रिक्स को सावधानी से एस्पिरेट करें। सिरिंज के साथ नमूना एस्पिरेटेड होने के दौरान बुलबुले की पीढ़ी से बचना महत्वपूर्ण है।
नोट: इस चरण से पहले, सुनिश्चित करें कि संकीर्ण प्रवेश छेद को खत्म करने के लिए सिरिंज की नोक काट दी गई है। - 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर क्षैतिज स्थिति में सिरिंज रखकर नमूना-एगारोस मिश्रण को ठोस होने दें।
- प्लंजर का उपयोग करके एगारोस मैट्रिक्स को सावधानी से निकालें और इसे एक साफ और सपाट सतह पर रखें।
- मैट्रिक्स की अखंडता को बनाए रखते हुए, ठोस नमूने को 0.5 - 1 मिमी की मोटाई सीमा में स्लाइस में काटें।
नोट: बेहतर परिणामों के लिए, स्केलपेल या पतले रेजर ब्लेड का उपयोग करके एगारोस मैट्रिक्स को काट लें। - स्लाइस को कवरस्लिप पर अगल-बगल रखें। कवरस्लिप पर डिस्क की संख्या इसके आयामों पर निर्भर करेगी।
नोट: टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के लिए, माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए बनाए गए सेल चैंबर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (उदाहरण के लिए, एटोफ्लुर या चैमलाइड चुंबकीय कक्ष)। ये कक्ष निर्जलीकरण से बचने के लिए नमूने के अधिग्रहण की अनुमति देते हैं। इस उदाहरण में नमूने एटोफ्लुर कक्ष का उपयोग करके गोल कवरलिप्स (25 मिमी) पर तैयार किए जाते हैं। - निर्जलीकरण को रोकने के लिए कक्ष में रखे गए नमूने पर 2 मिलीलीटर पिघला हुआ 3% एगारोस घोल जोड़ें।
- जेल बनाने के लिए अगारोस घोल के पूरी तरह से जमने तक प्रतीक्षा करें।
4. छवि अधिग्रहण
- एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में उत्परिवर्ती तनाव में रुचि के फ्लोरोसेंट प्रोटीन की कल्पना करने के लिए मापदंडों को मानकीकृत करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप ऑटोफ्लोरेसेंस और चयनित फ्लोरोसेंट मार्कर दोनों का पता लगा सकता है।
- अधिकतम आवर्धन के साथ उज्ज्वल क्षेत्र रचना में नमूने की कल्पना करें, और चित्र 1 में दिखाए गए अनुसार एक लंबवत उन्मुख फिलामेंट खोजें।
- जेड विमान के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल का उपयोग करके प्रारंभिक स्कैनिंग के साथ रुचि की विभाजन साइट का पता लगाएं।
- विभाजन स्थल पर रुचि के प्रोटीन के संकेत की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के मापदंडों का उपयोग करें।
- जैविक मॉडल और रुचि के प्रोटीन के अनुसार समय-चूक प्रयोग करें। उदाहरण के लिए, इस मामले में एनाबेना एसपी में जेड-रिंग के साथ एफटीएसजेड की गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए 50 सेकंड में 10 एस के टाइम-लैप्स प्रयोग किए गए थे।
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Representative Results
ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि का उपयोग करके एनाबेना एसपी में जेड-रिंग का विज़ुअलाइज़ेशन।
बैक्टीरिया में जेड-रिंग घटकों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, लंबवत उन्मुख कोशिकाओं में छवियों को प्राप्त करना आवश्यक है। इस स्थिति में, टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी के लिए जेड-रिंग और डिविसोम के मुख्य प्रोटीन की कल्पना करना संभव है। बैक्टीरिया के लिए क्लासिक नमूना तैयारी फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया के लिए काम नहीं करती है। अनाबेना एसपी के मामले में, फिलामेंट्स एक ऐसी स्थिति में उन्मुख होते हैं जो जेड-रिंग की कल्पना करने की अनुमति नहीं देता है। इसके अतिरिक्त, विस्तारित अवधि में एक ही कोशिका में कोशिका विभाजन प्रोटीन के सही दृश्य के लिए फिलामेंट्स को स्थिर रखना संभव नहीं है। इसलिए, अनाबेना एसपी में एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी उत्परिवर्ती के जेड-रिंग्स की कल्पना करने के लिए हमने एलएमपी अगारोस और नमूने के क्षैतिज इनक्यूबेशन का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल विकसित और मानकीकृत किया। यह प्रोटोकॉल पहले से उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं (चित्रा 1) की तुलना में लंबवत उन्मुख फिलामेंट्स का एक उच्च अनुपात प्राप्त करने की अनुमति देता है। इसलिए, कवरस्लिप (चित्रा 2 ए) के साथ सीधे संपर्क पर उत्परिवर्ती तनाव की कोशिकाओं में एक्सवाई विमान में जेड-रिंग रिकॉर्ड करना संभव था।
ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि का उपयोग करके एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी एनाबेना एसपी उत्परिवर्ती में जेड-रिंग गतिशीलता।
पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि का परीक्षण करने के बाद, उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी एनाबेना एसपी उत्परिवर्ती के नमूने एयरीस्कैन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए थे। इस तकनीक के साथ, हमने छल्ले में कम फोटोब्लीचिंग देखी और इसलिए, प्रतिदीप्ति संकेत को खोए बिना प्रयोगों को लंबे समय तक किया जा सकता है। वास्तव में, हम कम फोटोब्लीचिंग के साथ हर 10 सेकंड में छवियों के अधिग्रहण के साथ लगभग 16.5 मिनट की अवधि के लिए छवियों को प्राप्त करने में सक्षम थे, जिसने हमें जेड-रिंग के विभिन्न क्षेत्रों में समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता में भिन्नता का पता लगाने की अनुमति दी (चित्रा 2 बी)।
चित्र 1. ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि का उपयोग करके एनाबेना एसपी फिलामेंट्स का विज़ुअलाइज़ेशन। एनाबेना एसपी का एक नमूना एक सिरिंज के भीतर बीजी 11 में एलएमपी में क्षैतिज रूप से 3% तक इनक्यूबेट किया गया था। नमूना तब डिस्क में काटा गया था और अंत में सेल कक्ष में रखा गया था। कोशिकाओं का विज़ुअलाइज़ेशन एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। (ए) ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि का प्रदर्शन किए बिना अगारोस मैट्रिक्स में इनक्यूबेट किए गए नमूने की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी। इस छवि से पता चलता है कि अधिकांश फिलामेंट्स क्षैतिज रूप से उन्मुख हैं। स्केल बार = 20 μm. (B) प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि का उपयोग करने के बाद एनाबेना एसपी के लंबवत उन्मुख फिलामेंट्स का एक उच्च अनुपात दिखाती है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि का उपयोग करके एनाबेना एसपी के लंबवत उन्मुख फिलामेंट्स में जेड-रिंग का विज़ुअलाइज़ेशन। एक्सवाई विमान में जेड-रिंग्स को प्रदर्शित करने के लिए, एसएफजीएफपी-एफटीएसजेड स्ट्रेन की कोशिकाओं को ऊर्ध्वाधर स्थिरीकरण विधि (एआई) का पालन करते हुए 25 डिग्री सेल्सियस पर एलएमपी एग्रोज 3% में इनक्यूबेट किया गया था। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में उत्परिवर्ती के एक फिलामेंट को दिखाती है। स्केल बार = 10 μm (A.II) (A.I) में दिखाए गए फिलामेंट के Z-रिंग में FtsZ-sfGFP संकेत। यह छवि 1 मिनट के लिए हर 10 सेकंड में ली गई 6 छवियों की औसत तीव्रता है। स्केल बार = 2 μm (B) Z-रिंग के FtsZ-sfGPP सिग्नल को BG11-Agarose मैट्रिक्स में लंबवत रूप से उन्मुख FtsZ-sfGFP उत्परिवर्ती की कोशिकाओं में 50 सेकंड के लिए हर 10 सेकंड में दर्ज किया जाता है। प्रत्येक छवि के ऊपरी बाएं कोने पर समय (सेकंड) इंगित किया गया है। जेड-रिंग और एफटीएसजेड-एसएफजीएफपी के एक समूह का निरीक्षण करना संभव है जो समय के साथ अपनी स्थिति बदलता है (सफेद तीर)। स्केल बार = 1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
डिविसोम प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन निस्संदेह एक चुनौती है। विशेष रूप से, फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया में, चुनौतियों में से एक क्षैतिज विमान में जेड-रिंग का विज़ुअलाइज़ेशन है, जिसके लिए कोशिकाओं को लंबवत उन्मुख होना चाहिए। यहां वर्णित विधि एक्सवाई विमान में जेड-रिंग की स्थिति को विभिन्न विश्लेषण करने की अनुमति देती है। यह फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया के लिए पहली सरल विधि है जो जेड-रिंग के पूर्ण विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है।
यद्यपि यह प्रोटोकॉल सरल और तेज़ है, लेकिन एगारोस मैट्रिक्स में नमूना तैयार करने के चरण के दौरान विशेष देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि कम-गलनांक अगारोस को सेल समाधान के साथ मिश्रण के लिए पर्याप्त तरल पदार्थ होने के लिए उपयुक्त तापमान पर होना चाहिए। इसी समय, अगारोस समाधान बहुत गर्म नहीं हो सकता है क्योंकि यह सेल क्षति को भड़का सकता है। विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम डिस्क की कटाई है क्योंकि यदि यह सावधानी से नहीं किया जाता है, तो मैट्रिक्स ढह सकता है और नमूने को नुकसान पहुंचा सकता है।
इस विधि का उपयोग करके, ऊर्ध्वाधर स्थिति में फिलामेंट्स का अनुपात शास्त्रीय प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक है। हालांकि, सांख्यिकीय विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए जितना संभव हो उतने डिस्क को काटना आवश्यक है, यानी, एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में कई फिलामेंट्स।
अन्य तरीकों की तुलना में, जहां माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में एकल सेल अध्ययन किया जा सकता है, हमारी विधि आसान, तेज और सस्ती है, जिसमें केवल सामग्री और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है जो किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से उपलब्ध होते हैं। दूसरी ओर, हालांकि माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम का व्यापक रूप से बहुकोशिकीय साइनोबैक्टीरिया अध्ययन में उपयोग किया जा रहा है, हमारे ज्ञान के लिए उन्होंने ऊर्ध्वाधर स्थिति12 में सेल पोजिशनिंग की समस्या को हल नहीं किया है।
तकनीक की एक सीमा यह है कि अभिविन्यास हमेशा सही नहीं होता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि हमने एगारोस मैट्रिक्स में झुके हुए फिलामेंट्स देखे हैं, हालांकि, ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल का उपयोग करके पिछली स्क्रीनिंग के साथ इस आर्टिफैक्ट की पहचान करना संभव है। इसके अलावा, हम एक पूर्ण विभाजन घटना की कल्पना नहीं कर सके, क्योंकि यह प्रोटोकॉल विभाजन साइट के विज़ुअलाइज़ेशन को 1 घंटे तक की अनुमति देता है, जबकि अनाबेना एसपी का विभाजन समय लगभग 12 घंटे है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल तेजी से बढ़ते बैक्टीरिया में एक पूर्ण विभाजन घटना को रिकॉर्ड करने में सहायक हो सकता है।
यद्यपि हमारी विधि अनाबेना एसपी के लिए मानकीकृत की गई थी, इसे सभी फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया या फिलामेंटस जीवों पर लागू किया जा सकता है, न केवल एफटीएसजेड बल्कि डिविसोम से जुड़े अन्य प्रोटीनों का भी अध्ययन करने के लिए क्योंकि वे एक ही एक्सवाई विमान में उन्मुख होंगे।
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Disclosures
इसमें हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम वित्तपोषण के लिए राष्ट्रीय डॉक्टरेट छात्रवृत्ति (एएनआई 21211333; 21191389) के आभारी हैं। ग्रांट फोन्डेसाइट 1161232।
यह काम उन्नत माइक्रोस्कोपी सुविधा उमा यूसी द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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