שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה

Summary

אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.

Abstract

אירוע מרכזי בחלוקת תאי חיידקים הוא תהליך הספטציה, שבו החלבון FtsZ הוא מרכיב המפתח. FtsZ מתפלמר ויוצר מבנה דמוי טבעת (טבעת Z) במרכז התא המשמש כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים. מיקרוסקופ ברזולוציית על במודלים חיידקיים Escherichia coli ו - Bacillus subtilis הראה כי טבעת Z אינה רציפה, בעוד מחקרי הדמיה של תאים חיים הראו כי FtsZ נע לאורך הטבעת על ידי מנגנון המכונה הליכון. כדי ללמוד את הדינמיקה של FtsZ in vivo, מיקום תא מיוחד במצב אנכי נחוץ להדמיית המבנה המלא של הטבעת במישור XY. במקרה של דימות FtsZ בציאנובקטריה רב-תאית, כגון Anabaena sp. PCC7120, שמירה על החוטים במצב אנכי היא מאתגרת בגלל גודל התאים ואורך החוטים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת אימוביליזציה אנכית של חוטי Anabaena sp. PCC 7120 באמצעות נקודת התכה נמוכה agarose ומזרקים, כדי להקליט את טבעת Z במוטציה המבטאת חלבון היתוך FtsZ-sfGFP. שיטה זו היא דרך מהירה וזולה לרשום דינמיקה של חלבונים באתר החלוקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Introduction

חלוקת תאי חיידקים היא תהליך שבו תא אם מייצר שני תאי בת, ברוב המקרים על ידי מנגנון המכונה ביקוע בינארי. אחד האירועים המוקדמים ביותר בתהליך המחיצה הוא לוקליזציה של FtsZ באמצע התא¹. חלבון זה, שהוא הומולוגי מבחינה מבנית לטובולין², נשמר ומופץ באופן נרחב ברוב החיידקים, והפילמור שלו יוצר מבנה כיווץ המכונה טבעת Z³. טבעת זו משמשת כפיגום לחלבוני חלוקה אחרים ויחד הם יוצרים מנגנון מולקולרי הנקרא דיוויזום. מספר מחקרים הראו כי טבעת Z היא דינמית מאוד וכי פרוטופילמנטים FtsZ נעים על ידי הליכון ^4,5,6. כדי לחקור את טבעת Z בניסויי קיטועי זמן, מומלץ להקליט את אתר החלוקה במישור XY לרזולוציה טובה יותר ולדגימה מהירה. על מנת להשיג זאת, יש צורך לפתח שיטות אימוביליזציה של תאים אנכיים הכוללות בדרך כלל ננו-ייצור של מלכודות תאי מיקרו-חורים והתקנים מיקרופלואידים מורכבים⁷.

ציאנובקטריה הם מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים המסווגים כגראם-שליליים על ידי המורפולוגיה התאית שלהם. עם זאת, מבחינה פילוגנטית הם קרובים יותר לחיידקים גראם-חיוביים⁸. לאורגניזמים אלה יש גנים של חלוקת תאים הנפוצים בחיידקים גראם-חיוביים וגראם-שליליים, אך הדיוויזום שלהם מכיל גם יסודות ייחודיים⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (להלן Anabaena sp.) הוא ציאנובקטריה נימית בעלת מישור חלוקה אחד והיא מודל לחקר חלוקת תאים בציאנובקטריה רב-תאית. בזן זה, ניתן היה לקבוע את המיקום של FtsZ באמצע התאים¹⁰. עם זאת, אין מחקרים המראים את הדינמיקה in vivo של FtsZ במודל זה. במעבדה שלנו, באמצעות הזדווגות תלת-הורית ורקומבינציה הומולוגית, השגנו מוטציה מופרדת לחלוטין של Anabaena sp. המבטאת את חלבון FtsZ המאוחה ל-sfGFP, שהחליף את הגן ftsZ האנדוגני המלא. פיתחנו שיטת אימוביליזציה מהירה ופשוטה של תאים המעדיפה את הכיוון האנכי של חוטי הזן המוטנטי לניסויים בהילוך מהיר כדי לדמיין את חלבוני החלוקה בציאנובקטריה נימה. שיטה זו אינה זקוקה להתקנים מיקרופלואידים שיכולים להיות יקרים וקשים לפיתוח. לדוגמה, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לדמיין את טבעת Z במוטציה FtsZ-sfGFP באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Protocol

1. שיקולים ובחירת המודל הסלולרי

הערה: לציאנובקטריה יש אוטופלואורסצנטיות חזקה עקב נוכחות פיגמנטים פוטוסינתטיים. אות זה נמצא בחלק האדום של הספקטרום, ולכן החלבונים הפלואורסצנטיים המתאימים להדמיה בציאנובקטריה הם אלה הרחוקים מהפליטה האדומה. לדוגמה, GFP, YFP, ונוס, טורקיז ו- BFP.

1. בחר רכיב דיוויזומי הקיים בזן הציאנובקטריאלי נימה המטרה. לצורך הניסויים יש צורך לבנות מוטציה ציאנובקטריאלית נימית המבטאת את הרכיב הדיוויזום שנבחר המאוחה לחלבון פלואורסצנטי. בפרוטוקול זה, מוטנט Anabaena sp. המבטא FstZ-sfGFP, כדוגמה. זן זה הושג על ידי הזדווגות תלת-הורית עם E. coli¹¹.
2. בדוק את רמת ההפרדה של המוטציה שבה ייעשה שימוש. בדוגמה, ההפרדה נקבעה על ידי הגברת PCR של גן המטרה. מוטנט FtsZ-sfGFP המשמש בפרוטוקול זה הוא זן מופרד לחלוטין החסר את הגן הפראי ftsZ.

2. תנאי גידול

1. יצירת תת-תרבית חדשה של המוטנט באמצעות תרבית של 10 מ"ל בפאזה נייחת (גדלה במשך כ-14 יום באור קבוע, ב-25 מעלות צלזיוס, עבור Anabaena sp.) והוספה ל-90 מ"ל של מדיום BG11 בתוספת אנטיביוטיקה (ספקטינומיצין וסטרפטומיצין 10 μl ml-1 עבור מוטנט FtsZ-sfGFP).
2. לגדל את תרבית התאים החדשה באור קבוע ובטמפרטורה האופטימלית עד שמגיעים לשלב המעריכי. מוטנט FtsZ-sfGFP של Anabaena sp. גדל ב 25 ° C במשך 7 ימים לפני הכנת המדגם.

3. הכנת מדגם במטריצת אגרוז

1. קח 2 מ"ל של תרבות הצמיחה הומוגנית.
2. צנטריפוגה בגודל 2,500 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. בינתיים, בצלוחית של 50 מ"ל, מחממים 30 מ"ל של 3% נקודת התכה נמוכה אגרוז בתווך נוזלי BG11. השתמשו במיקרוגל בעוצמה בינונית ובדקו את התמיסה כל 15 שניות עד להמסה מלאה. מניחים בצד להתקרר ל-37°C.
   הערה: Autoclave הפתרון של agarose כדי למנוע זיהום.
4. לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו 1.9 מ"ל של הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בנפח הנותר על ידי פיפטציה לפחות שלוש פעמים למעלה ולמטה.
5. מערבבים את התאים המרחפים מחדש עם 900 μL של תמיסת אגרוז 3% על ידי פיפטציה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים.
   הערה: תמיסת האגרוז חייבת להיות נוזלית אך לא חמה מדי כדי למנוע נזק לתאים. השלב הבא חייב להתבצע מהר ולפני שתמיסת האגרוז יוצרת ג'ל כמו עקביות =.
6. שואפים את מטריצת האגרוז במזרק 1 מ"ל בזהירות. חשוב להימנע מיצירת בועות בזמן שהדגימה נשאפת עם המזרק.
   הערה: לפני שלב זה, ודא כי קצה המזרק נחתך כדי לחסל את חור הכניסה הצר.
7. תן לתערובת הדגימה-אגרוז להתמצק על ידי הצבת המזרק במצב אופקי בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
8. הסר את מטריצת agarose בזהירות באמצעות הבוכנה ולשים אותו על משטח נקי ושטוח.
9. חותכים את המדגם מוצק לפרוסות, בטווח עובי של 0.5 - 1 מ"מ, שמירה על שלמות המטריצה.
   הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר, חתכו את מטריצת האגרוז באמצעות אזמל או סכיני גילוח דקים.
10. מניחים את הפרוסות זו לצד זו על כיסוי. מספר הדיסקים על coverslip יהיה תלוי בממדים שלה.
    הערה: עבור מיקרוסקופ בהילוך מהיר, מומלץ להשתמש בתא תא המיועד לניתוח מיקרוסקופיה (למשל, תאים מגנטיים Attofluor או Chamlide). תאים אלה מאפשרים רכישת הדגימה תוך הימנעות מהתייבשות. בדוגמה זו הדגימות מוכנות על גבי כיסויים מעוגלים (25 מ"מ) באמצעות תא Attofluor.
11. הוסף 2 מ"ל של תמיסת אגרוז 3% מומסת על הדגימה שהונחה בתא כדי למנוע התייבשות.
12. המתן עד שתמיסת האגרוז מתמצקת לחלוטין ליצירת ג'ל.

4. רכישת תמונות

1. תקנן את הפרמטרים כדי לדמיין את החלבון הפלואורסצנטי המעניין את הזן המוטנטי במיקרוסקופ קונפוקלי. ודא כי המיקרוסקופ יכול לזהות הן את autofluorescence ואת הסמן הפלואורסצנטי שנבחר.
2. דמיינו את הדגימה בקונפורמציית השדה הבהיר עם הגדלה מרבית, וחפשו חוט להט בכיוון אנכי כפי שמוצג באיור 1.
3. מצא את אתר החלוקה המעניין באמצעות סריקה ראשונית באמצעות האות האוטופלואורסצנטי לאורך מישור Z.
4. השתמש בפרמטרים של סמן החלבון הפלואורסצנטי כדי לדמיין את האות של החלבון המעניין באתר החלוקה.
5. לבצע ניסויים בהילוך מהיר בהתאם למודל הביולוגי ולחלבון המעניין. לדוגמה, במקרה הזה בוצעו ניסויים בהילוך מהיר של 10 שניות ב-50 שניות כדי לתעד את הדינמיקה של FtsZ לאורך טבעת Z ב-Anabaena sp. (איור 2).

Representative Results

הדמיה של טבעת Z ב Anabaena sp. באמצעות שיטת immobilization אנכי
כדי ללמוד את הדינמיקה של רכיבי טבעת Z בחיידקים, יש צורך לרכוש תמונות בתאים בכיוון אנכי. במצב זה, ניתן לדמיין את טבעת Z ואת החלבונים העיקריים של divisome כדי לפקח על דינמיקה של חלבונים על ידי מיקרוסקופ time-lapse. הכנת הדגימה הקלאסית לחיידקים אינה פועלת עבור ציאנובקטריה נימה. במקרה של Anabaena sp., החוטים מכוונים במצב שאינו מאפשר לדמיין את טבעת Z. בנוסף, לא ניתן לשמור על החוטים משותקים לצורך הדמיה נכונה של חלבוני חלוקת התא בתא בודד לאורך פרקי זמן ממושכים. לכן, על מנת להמחיש את טבעות Z של מוטנט FtsZ-sfGFP ב- Anabaena sp פיתחנו ותקננו פרוטוקול באמצעות LMP agarose ודגירה אופקית של הדגימה. פרוטוקול זה מאפשר קבלת שיעור גבוה יותר של חוטים בכיוון אנכי, בהשוואה לפרוצדורות שהיו בשימוש בעבר (איור 1). לכן, אפשר היה להקליט את טבעת Z במישור XY בתאים של הזן המוטנטי במגע ישיר עם הכיסוי (איור 2A).

דינמיקת טבעת Z במוטציה FtsZ-sfGFP Anabaena sp. באמצעות שיטת אימוביליזציה אנכית
לאחר בדיקת שיטת האימוביליזציה האנכית במיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונלי, דגימות של מוטנט FtsZ-sfGFP Anabaena sp שהוכנו באמצעות אותו פרוטוקול הודגמו על ידי מיקרוסקופ Airyscan. בטכניקה זו ראינו פחות הלבנה בטבעות, ולכן ניתן לבצע את הניסויים לפרקי זמן ארוכים יותר מבלי לאבד את אות הפלואורסצנטיות. למעשה, הצלחנו להשיג תמונות לפרקי זמן של כ-16.5 דקות, עם רכישה של תמונות כל 10 שניות עם הלבנה נמוכה, מה שאפשר לנו לזהות שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן באזורים שונים של טבעת Z (איור 2B).

איור 1. הדמיה של Anabaena sp. חוטים באמצעות שיטת immobilization אנכי. דגימה של Anabaena sp. הודגרה אופקית ב- LMP agarose 3% ב- BG11 בתוך מזרק. הדגימה נחתכה אז לדיסקים ולבסוף הונחה בתא התא. ההדמיה של התאים בוצעה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. (A) מיקרוסקופ שדה בהיר מייצג של דגימה מודגרת במטריצת אגרוז מבלי לבצע את שיטת האימוביליזציה האנכית. תמונה זו מראה שרוב החוטים מכוונים אופקית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) מיקרוסקופ שדה בהיר מייצג המציג שיעור גבוה של חוטים בכיוון אנכי של Anabaena sp. לאחר שימוש בשיטת אימוביליזציה אנכית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. הדמיה של טבעת Z בחוטים בכיוון אנכי של Anabaena sp. באמצעות שיטת immobilization אנכי. כדי להציג את טבעות ה-Z במישור XY, תאי הזן sfGFP-FtsZ הודגרו ב-LMP agarose 3% ב-25°C בשיטת האימוביליזציה האנכית (A.I). מיקרוסקופ ברייטפילד מראה חוט להט של המוטנט במצב אנכי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (A.II) האות FtsZ-sfGFP בטבעת Z של חוט הלהט המוצג ב- (A.I ). תמונה זו היא העוצמה הממוצעת של 6 תמונות שצולמו כל 10 שניות במשך דקה אחת. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר (B) אות FtsZ-sfGFP של טבעת Z נרשם כל 10 שניות במשך 50 שניות בתאים של מוטנט FtsZ-sfGFP בכיוון אנכי במטריצת BG11-agarose. זמן (שניות) מצוין בפינה השמאלית העליונה של כל תמונה. ניתן לצפות בטבעת Z ובאשכול של FtsZ-sfGFP המשנה את מיקומו לאורך זמן (חיצים לבנים). סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

חקר הדינמיקה של חלבונים דיוויזומים הוא ללא ספק אתגר. בפרט, בציאנובקטריה נימה, אחד האתגרים הוא הדמיה של טבעת Z במישור האופקי, שעבורה התאים חייבים להיות בכיוון אנכי. השיטה שתיארנו כאן מאפשרת את מיקום טבעת Z במישור XY לביצוע הניתוחים השונים. זוהי השיטה הפשוטה הראשונה עבור ציאנובקטריה נימה המאפשרת הדמיה מלאה של טבעת Z.

למרות שפרוטוקול זה הוא פשוט ומהיר, יש לנקוט בזהירות מיוחדת במהלך שלב הכנת הדגימה במטריצת האגרוז, שכן נקודת ההתכה הנמוכה חייבת להיות בטמפרטורה מתאימה כדי להיות נוזלית מספיק לערבוב עם תמיסת התא. יחד עם זאת, הפתרון agarose לא יכול להיות חם מדי שכן זה יכול לעורר נזק לתאים. צעד קריטי נוסף שיש לקחת בחשבון הוא חיתוך הדיסקים מכיוון שאם זה לא נעשה בזהירות, המטריצה יכולה לקרוס ולפגוע בדגימה.

בשיטה זו, שיעור החוטים במיקום האנכי גבוה יותר מאשר בפרוטוקול הקלאסי. עם זאת, יש צורך לחתוך דיסקים רבים ככל האפשר כדי להבטיח את הניתוח הסטטיסטי, כלומר, כמה חוטים במצב אנכי.

בהשוואה לשיטות אחרות, בהן ניתן לבצע מחקרים של תאים בודדים במערכות מיקרופלואידיות, השיטה שלנו קלה, מהירה וזולה יותר, ודורשת רק חומרים וריאגנטים הזמינים בקלות בכל מעבדה. מצד שני, למרות שמערכות מיקרופלואידיות נמצאות בשימוש נרחב במחקרי ציאנובקטריה רב-תאיים, למיטב ידיעתנו הן לא פתרו את בעיית מיקום התאים במיקום אנכי¹².

מגבלה של הטכניקה היא שהאוריינטציה לא תמיד מושלמת. הסיבה לכך היא שראינו חוטים מוטים במטריצת האגרוז, עם זאת, עם ההקרנה הקודמת באמצעות אות autofluorescence ניתן לזהות את הממצא הזה. כמו כן, לא יכולנו לדמיין אירוע חלוקה מלא, מכיוון שפרוטוקול זה מאפשר הדמיה של אתר החלוקה עד שעה אחת, בעוד שזמן החלוקה של Anabaena sp. הוא בסביבות 12 שעות. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מועיל לתיעוד אירוע חלוקה מלא בחיידקים הגדלים במהירות.

למרות השיטה שלנו היה סטנדרטי עבור Anabaena sp. זה יכול להיות מיושם על כל ציאנובקטריה נימה או אורגניזמים נימה, ללמוד לא רק FtsZ אלא גם חלבונים אחרים הקשורים divisome שכן הם יהיו בכיוון באותו מישור XY.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	-	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	-	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.