Filamentli Siyanobakterilerde Hızlandırılmış Mikroskopi Analizi için Dikey İmmobilizasyon Yöntemi

Summary

XY düzleminde filamentli siyanobakteriyel görselleştirme için basit ve erişilebilir bir yöntem sunuyoruz. Düşük erime noktalı bir agaroz matrisi kullanıldı ve bölünmede yer alan proteinlerin görüntülerinin dikey bir yönde elde edilmesine izin verildi. Bu nedenle, bu metodoloji herhangi bir filamentli organizmaya ve farklı protein türlerine uygulanabilir.

Abstract

Bakteriyel hücre bölünmesindeki ana olay, FtsZ proteininin anahtar element olduğu septasyon işlemidir. FtsZ, hücrenin ortasında, diğer bölünme proteinleri için bir iskele görevi gören halka benzeri bir yapı (Z-halkası) oluşturan polimerize olur. Bakteriyel modellerde süper çözünürlüklü mikroskopi Escherichia coli ve Bacillus subtilis , Z-halkasının süreksiz olduğunu gösterirken, canlı hücre görüntüleme çalışmaları FtsZ'nin halka boyunca koşu bandı olarak bilinen bir mekanizma ile hareket ettiğini gösterdi. FtsZ'nin dinamiklerini in vivo olarak incelemek için, XY düzlemindeki halkanın tüm yapısını görüntülemek için dikey konumda özel bir hücre yerleşimi gereklidir. Anabaena sp. PCC7120 gibi çok hücreli siyanobakterilerde FtsZ görüntüleme durumunda, filamentlerin dikey konumda tutulması, hücrelerin büyüklüğü ve filamentlerin uzunluğu nedeniyle zordur. Bu makalede, Z-halkasını bir FtsZ-sfGFP füzyon proteinini ifade eden bir mutantta kaydetmek için Anabaena sp. PCC 7120 filamentlerinin düşük erime noktalı agaroz ve şırıngalar kullanılarak dikey immobilizasyonuna izin veren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanarak bölünme bölgesinde protein dinamiklerini kaydetmenin hızlı ve ucuz bir yoludur.

Introduction

Bakteriyel hücre bölünmesi, bir ana hücrenin, çoğu durumda ikili fisyon olarak bilinen mekanizma ile iki yavru hücre ürettiği süreçtir. Septasyon sürecindeki en erken olaylardan biri, FtsZ'nin^{hücre 1'in} ortasında lokalizasyonudur. Yapısal olarak tübülin^2'ye homolog olan bu protein, çoğu bakteride korunur ve yaygın olarak dağıtılır ve polimerizasyonu Z-halka³ olarak bilinen bir kasılma yapısı oluşturur. Bu halka, diğer bölünme proteinleri için bir iskele görevi görür ve birlikte bölücü adı verilen moleküler bir makine oluştururlar. Birçok çalışma, Z-halkasının oldukça dinamik olduğunu ve FtsZ protofilamentlerinin ^4,5,6 koşu bandı ile hareket ettiğini göstermiştir. Hızlandırılmış deneylerde Z-halkasını incelemek için, daha iyi çözünürlük ve hızlı örnekleme için bölme bölgesini XY düzleminde kaydetmeniz önerilir. Bunu başarmak için, genellikle mikrodelik hücre tuzaklarının ve karmaşık mikroakışkan cihazların nanofabrikasyonunu içeren dikey hücre immobilizasyon yöntemlerinin geliştirilmesi gerekmektedir⁷.

Siyanobakteriler, hücresel morfolojilerine göre gram-negatif olarak sınıflandırılan fotosentetik mikroorganizmalardır. Bununla birlikte, filogenetik olarak gram-pozitif bakterilere daha yakındırlar⁸. Bu organizmalar, gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerde yaygın olan hücre bölünme genlerine sahiptir, ancak bölücüleri de benzersiz elementler içerir⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (bundan böyle Anabaena sp.) bir bölünme düzlemine sahip filamentli siyanobakterilerdir ve çok hücreli siyanobakterilerde hücre bölünmesinin incelenmesi için bir modeldir. Bu suşta, FtsZ'nin hücrelerin ortasındaki konumunu belirlemek mümkün olmuştur¹⁰. Bununla birlikte, bu modelde FtsZ'nin in vivo dinamiklerini gösteren hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Laboratuvarımızda, triparental çiftleşme ve homolog rekombinasyon yoluyla, tam endojen ftsZ geninin yerini alan sfGFP'ye kaynaşmış FtsZ proteinini ifade eden tamamen ayrılmış bir Anabaena sp. mutantı elde ettik. Filamentli siyanobakterilerdeki bölünme proteinlerini görselleştirmek için hızlandırılmış deneyler için mutant suş filamentlerinin dikey oryantasyonunu destekleyen hızlı ve basit bir hücre immobilizasyon yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, pahalı ve geliştirilmesi zor olabilecek mikroakışkan cihazlara ihtiyaç duymaz. Örnek olarak, bu protokolü FtsZ-sfGFP mutantındaki Z-halkasını konfokal mikroskopi ile görselleştirmek için kullandık.

Protocol

1. Dikkat edilmesi gereken noktalar ve hücresel modelin seçimi

NOT: Siyanobakteriler, fotosentetik pigmentlerin varlığı nedeniyle güçlü bir otofloresansa sahiptir. Bu sinyal spektrumun kırmızı kısmındadır, bu nedenle siyanobakterilerde görüntüleme için uygun floresan proteinler kırmızı emisyondan uzak olanlardır. Örneğin, GFP, YFP, Venüs, Turkuaz ve BFP.

1. Hedef filamentli siyanobakteriyel suşta bulunan bir bölücü bileşen seçin. Deneyler için, bir floresan proteine kaynaşmış seçilmiş bölücü bileşeni ifade eden filamentli bir siyanobakteriyel mutant oluşturmak gerekir. Bu protokolde, örnek olarak FstZ-sfGFP'yi ifade eden bir Anabaena sp. mutantı. Bu suş, E. coli¹¹ ile üçlü çiftleşme ile elde edildi.
2. Kullanılacak mutantın ayrışma seviyesini kontrol edin. Örnekte, ayrışma, hedef genin PCR amplifikasyonu ile belirlenmiştir. Bu protokolde kullanılan FtsZ-sfGFP mutantı, vahşi tip ftsZ geninden yoksun tamamen ayrılmış bir suştur.

2. Büyüme koşulları

1. Sabit fazda 10 mL kültür kullanarak ( Anabaena sp için 25 ° C'de sabit ışıkta yaklaşık 14 gün boyunca yetiştirilir) ve antibiyotiklerle desteklenmiş 90 mL BG11 ortamına (FtsZ-sfGFP mutantı için Spectinomycin ve Streptomisin 10 μl ^ml-1 ) ekleyerek mutantın taze bir alt kültürünü yapın.
2. Yeni hücre kültürünü üstel faza ulaşana kadar sabit ışıkta ve optimum sıcaklıkta büyütün. Anabaena sp.'nin FtsZ-sfGFP mutantı, numune hazırlamadan önce 7 gün boyunca 25 ° C'de yetiştirilir.

3. Bir agaroz matrisinde numune hazırlama

1. Homojenize büyüme kültüründen 2 mL alın.
2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj.
3. Bu arada, 50 mL'lik bir şişede, BG11 sıvı ortamında 30 mL% 3 düşük erime noktası agarozu ısıtın. Orta güç seviyesine ayarlanmış bir mikrodalga kullanın ve tamamen çözünene kadar her 15 saniyede bir çözeltiyi kontrol edin. 37 °C'ye kadar soğuması için bir kenara koyun.
   NOT: Kontaminasyonu önlemek için agaroz çözeltisini otoklavlayın.
4. Santrifüjleme yapıldıktan sonra, süpernatantın 1,9 mL'sini atın ve kalan hacimdeki hücreleri en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.
5. Askıya alınmış hücreleri en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 900 μL% 3 agaroz çözeltisi ile karıştırın.
   NOT: Agaroz çözeltisi sıvı olmalı, ancak hücre hasarını önlemek için çok sıcak olmamalıdır. Bir sonraki adım hızlı bir şekilde ve agaroz çözeltisi kıvam = gibi bir jel oluşturmadan önce gerçekleştirilmelidir.
6. Agaroz matrisini 1 mL'lik bir şırıngada dikkatlice aspire edin. Numune şırınga ile aspire edilirken kabarcıkların oluşmasını önlemek önemlidir.
   NOT: Bu adımdan önce, dar giriş deliğini ortadan kaldırmak için şırınganın ucunun kesildiğinden emin olun.
7. Şırıngayı 2 saat boyunca oda sıcaklığında yatay konuma getirerek numune-agaroz karışımının katılaşmasını sağlayın.
8. Agaroz matrisini pistonu kullanarak dikkatlice çıkarın ve temiz ve düz bir yüzeye koyun.
9. Katılaştırılmış numuneyi, matrisin bütünlüğünü koruyarak 0,5 - 1 mm kalınlık aralığında dilimler halinde kesin.
   NOT: Daha iyi sonuçlar için, agaroz matrisini bir neşter veya ince tıraş bıçağı kullanarak kesin.
10. Dilimleri bir kapak kayması üzerine yan yana yerleştirin. Bir kapak fişindeki disk sayısı, boyutlarına bağlı olacaktır.
    NOT: Hızlandırılmış mikroskopi için, mikroskopi analizi için yapılmış bir hücre odasının kullanılması önerilir (örneğin, Attofluor veya Chamlide Manyetik odaları). Bu odalar, dehidrasyondan kaçınarak numunenin elde edilmesine izin verir. Bu örnekte, numuneler Attofluor haznesi kullanılarak yuvarlak kapaklar (25 mm) üzerinde hazırlanmıştır.
11. Dehidrasyonu önlemek için odaya yerleştirilen numuneye 2 mL erimiş% 3 agaroz çözeltisi ekleyin.
12. Bir jel oluşturmak için agaroz çözeltisi tamamen katılaşana kadar bekleyin.

4. Görüntü alma

1. Konfokal mikroskopta mutant suşa ilgi duyan floresan proteini görselleştirmek için parametreleri standartlaştırın. Mikroskopun hem otofloresanı hem de seçilen floresan işaretleyiciyi algılayabildiğinden emin olun.
2. Numuneyi parlak alan konformasyonunda maksimum büyütme ile görselleştirin ve Şekil 1'de gösterildiği gibi dikey olarak yönlendirilmiş bir filament arayın.
3. Z düzlemi boyunca otofloresan sinyalini kullanarak ilk taramayla ilgilendiğiniz bölme bölgesini bulun.
4. Bölünme bölgesinde ilgilenilen proteinin sinyalini görselleştirmek için floresan protein işaretleyicisinin parametrelerini kullanın.
5. Biyolojik modele ve ilgilenilen proteine göre hızlandırılmış deneyler yapın. Örneğin, bu durumda, Anabaena sp.'deki Z-halkası boyunca FtsZ'nin dinamiklerini kaydetmek için 50 saniyede 10 s'lik hızlandırılmış deneyler yapılmıştır (Şekil 2).

Representative Results

Anabaena sp.'deki Z-halkasının dikey immobilizasyon yöntemi kullanılarak görselleştirilmesi
Bakterilerdeki Z-halka bileşenlerinin dinamiklerini incelemek için, dikey olarak yönlendirilmiş hücrelerde görüntüler elde etmek gerekir. Bu pozisyonda, hızlandırılmış mikroskopi ile protein dinamiklerini izlemek için Z-halkasını ve bölücünün ana proteinlerini görselleştirmek mümkündür. Bakteriler için klasik numune hazırlama, filamentli siyanobakteriler için çalışmaz. Anabaena sp. durumunda, filamentler Z-halkasını görselleştirmeye izin vermeyen bir konuma yönlendirilir. Ek olarak, hücre bölünmesi proteinlerinin tek bir hücrede uzun süre doğru bir şekilde görselleştirilmesi için filamentleri hareketsiz tutmak mümkün değildir. Bu nedenle, Anabaena sp'deki FtsZ-sfGFP mutantının Z-halkalarını görselleştirmek için, LMP agarozu ve numunenin yatay inkübasyonunu kullanarak bir protokol geliştirdik ve standartlaştırdık. Bu protokol, daha önce kullanılan prosedürlere kıyasla dikey olarak yönlendirilmiş filamentlerin daha yüksek bir oranının elde edilmesini sağlar (Şekil 1). Bu nedenle, XY düzlemindeki Z-halkasını, kapak kayması ile doğrudan temas halinde mutant suşun hücrelerinde kaydetmek mümkün olmuştur (Şekil 2A).

Dikey immobilizasyon yöntemini kullanarak FtsZ-sfGFP Anabaena sp. mutantında Z-halka dinamikleri
Konvansiyonel konfokal mikroskopide vertikal immobilizasyon yöntemi test edildikten sonra, aynı protokol kullanılarak hazırlanan FtsZ-sfGFP Anabaena sp mutant örnekleri Airyscan mikroskobu ile görselleştirildi. Bu teknikle, halkalarda daha az fotobeyazlatma gözlemledik ve bu nedenle deneyler floresan sinyalini kaybetmeden daha uzun süreler boyunca gerçekleştirilebilir. Aslında, yaklaşık 16.5 dakikalık periyotlar için görüntüler elde edebildik, düşük fotobeyazlatma ile her 10 saniyede bir görüntü elde ettik, bu da Z-halkasının farklı bölgelerinde zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklikleri tespit etmemizi sağladı (Şekil 2B).

Şekil 1. Anabaena sp. filamentlerinin dikey immobilizasyon yöntemi kullanılarak görselleştirilmesi. Bir Anabaena sp. örneği, bir şırınga içinde BG11'de% 3 oranında LMP agarozunda yatay olarak inkübe edildi. Örnek daha sonra disklere kesildi ve son olarak hücre odasına yerleştirildi. Hücrelerin görselleştirilmesi ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. (A) Dikey immobilizasyon yöntemi uygulanmadan agaroz matrisinde inkübe edilen bir numunenin temsili parlak alan mikroskopisi. Bu görüntü, filamentlerin çoğunun yatay olarak yönlendirildiğini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Dikey immobilizasyon yöntemini kullandıktan sonra Anabaena sp.'nin dikey olarak yönlendirilmiş filamentlerinin yüksek bir oranını gösteren temsili parlak alan mikroskobu. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Dikey immobilizasyon yöntemi kullanılarak Anabaena sp.'nin dikey olarak yönlendirilmiş filamentlerinde Z-halkasının görselleştirilmesi. XY düzleminde Z-halkalarını görüntülemek için, sfGFP-FtsZ suşunun hücreleri, dikey immobilizasyon yöntemini (AI ) takiben 25 ° C'de% 3 LMP agarozunda inkübe edildi. Brightfield mikroskobu, mutantın bir filamentini dikey konumda gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (A.II) (A.I) 'de gösterilen filamentin Z-halkasındaki FtsZ-sfGFP sinyali. Bu görüntü, 1 dakika boyunca her 10 saniyede bir çekilen 6 görüntünün ortalama yoğunluğudur. Ölçek çubuğu = 2 μm (B) Z-halkasının FtsZ-sfGFP sinyali, BG11-agaroz matrisinde dikey olarak yönlendirilmiş FtsZ-sfGFP mutantının hücrelerinde 50 s boyunca her 10 saniyede bir kaydedilir. Zaman (saniye) her görüntünün sol üst köşesinde gösterilir. Z-halkasını ve zamanla konumunu değiştiren bir FtsZ-sfGFP kümesini (beyaz oklar) gözlemlemek mümkündür. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bölücü proteinlerin dinamiklerinin incelenmesi şüphesiz bir meydan okumadır. Özellikle, filamentli siyanobakterilerde, zorluklardan biri, hücrelerin dikey olarak yönlendirilmesi gereken yatay düzlemde Z-halkasının görselleştirilmesidir. Burada tarif ettiğimiz yöntem, farklı analizleri gerçekleştirmek için Z-halkasının XY düzleminde konumlandırılmasını sağlar. Bu, Z-halkasının tam olarak görselleştirilmesini sağlayan filamentli siyanobakteriler için ilk basit yöntemdir.

Bu protokol basit ve hızlı olmasına rağmen, agaroz matrisindeki numune hazırlama adımı sırasında özel dikkat gösterilmelidir, çünkü düşük erime noktası agaroz, hücre çözeltisi ile karıştırılacak kadar akışkan olması için uygun bir sıcaklıkta olmalıdır. Aynı zamanda, agaroz çözeltisi çok sıcak olamaz, çünkü hücre hasarına neden olabilir. Dikkate alınması gereken bir diğer kritik adım, disklerin kesilmesidir, çünkü dikkatli bir şekilde yapılmazsa, matris çökebilir ve numuneye zarar verebilir.

Bu yöntemi kullanarak, dikey pozisyondaki filamentlerin oranı klasik protokolden daha yüksektir. Bununla birlikte, istatistiksel analizi, yani dikey konumda birkaç filamenti sağlamak için mümkün olduğunca çok disk kesmek gerekir.

Mikroakışkan sistemlerde tek hücreli çalışmaların yapılabildiği diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz daha kolay, daha hızlı ve daha ucuzdur ve yalnızca herhangi bir laboratuvarda kolayca bulunabilen malzeme ve reaktifler gerektirir. Öte yandan, mikroakışkan sistemler çok hücreli siyanobakteri çalışmalarında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bildiğimiz kadarıyla dikey pozisyonda hücre konumlandırma problemini çözmemişlerdir¹².

Tekniğin bir sınırlaması, oryantasyonun her zaman mükemmel olmamasıdır. Bunun nedeni, agaroz matrisinde eğik filamentler görmemizdir, ancak otofloresan sinyalini kullanan önceki tarama ile bu artefaktı tanımlamak mümkündür. Ayrıca, tam bir bölünme olayını görselleştiremedik, çünkü bu protokol bölme alanının 1 saate kadar görselleştirilmesine izin verirken, Anabaena sp.'nin bölünme süresi yaklaşık 12 saattir. Bununla birlikte, bu protokol hızlı büyüyen bakterilerde tam bir bölünme olayını kaydetmek için yararlı olabilir.

Yöntemimiz Anabaena sp. için standartlaştırılmış olmasına rağmen, sadece FtsZ'yi değil, aynı zamanda aynı XY düzleminde yönlendirilecekleri için bölücü ile ilişkili diğer proteinleri incelemek için tüm filamentli siyanobakterilere veya filamentli organizmalara uygulanabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	-	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	-	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.