Medicine

使用 EV 激活凝血时间（EV-ACT）测定细胞外囊泡（EV）的促凝血活性

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65661

Yalong Gao^1,2,3, Kaiji Li^1,2, Qiong Qin⁴, Jianning Zhang^1,2, Li Liu¹

¹Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, ²Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, ³Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, ⁴Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

Summary

该方案研究了使用富含细胞囊泡（EV）的血浆作为EV凝血能力的指标。通过差速离心和随后的再钙化过程获得富含EV的血浆。

Abstract

细胞外囊泡（EV）在各种疾病中的作用越来越受到关注，特别是由于其强大的促凝血活性。然而，迫切需要床边测试来评估 EV 在临床环境中的促凝血活性。本研究建议使用富含 EV 的血浆的凝血酶激活时间作为 EV 促凝血活性的量度。采用标准化程序获得枸橼酸钠全血，然后进行差速离心以获得富含 EV 的血浆。将富含EV的血浆和氯化钙加入测试杯中，并使用分析仪实时监测粘弹性的变化。测定富含 EV 的血浆（称为 EV-ACT）的自然凝固时间。结果显示，当从健康志愿者获得的血浆中去除EV时，EV-ACT显着增加，而当EV富集时，EV-ACT显着降低。此外，子痫前期、髋部骨折和肺癌的人类样本中的 EV-ACT 显着缩短，表明血浆 EV 水平升高并促进血液高凝。凭借其简单快速的程序，EV-ACT有望作为评估高血浆EV水平患者凝血功能的床边测试。

Introduction

血栓形成是由高凝状态引起的，在脑外伤¹、先兆子痫²、肿瘤³和骨折患者⁴等多种疾病中起着重要作用。高凝状态的潜在机制很复杂，最近重点放在细胞外囊泡（EV）在凝血障碍中的作用。EV 是具有双层结构的囊泡状体，与细胞膜分离，直径范围为 10 nm 至 1000 nm。它们与多种疾病过程有关，尤其是凝血障碍⁵。几项研究已将 EV 确定为血栓形成风险的有希望的预测因子 ^6,7。EV的促凝血活性取决于凝血因子的表达，主要是组织因子（TF）和磷脂酰丝氨酸（PS）。具有强大促凝血活性的EV显著增强了腱蛋白酶和凝血酶原复合物的催化效率，从而促进凝血酶介导的纤维蛋白原和局部血栓形成⁸。在许多疾病中已观察到 EV 水平升高及其与高凝状态的因果关系⁹。因此，标准化 EV 的检测并报告其促凝血活性是研究的一个重要领域¹⁰。

迄今为止，只有少数商业试剂盒可用于检测电动汽车的促凝血活性。MP-Activity 测定和 MP-TF 测定由一家商业公司生产，是用于测量 EV 在血浆中促凝血活性的功能测定¹¹。这些检测采用与酶联免疫吸附检测相似的原理来检测 EV 上的 PS 和 TF。然而，这些试剂盒价格昂贵，并且仅限于少数高级研究机构。该过程复杂且耗时，因此在临床环境中实施它们具有挑战性。此外，商业开发的促凝血磷脂（PPL）检测将无 PS 血浆与测试血浆混合，测量凝血时间以定量检测 PS 阳性 EV^{的水平 12}。然而，这些测定主要集中在 EV 上的 PS 和 TF，忽略了循环 EV 可能参与的其他凝血途径¹².

血浆凝血系统错综复杂，包括“看不见”和“看得见”的成分，包括凝血剂、抗凝剂、纤溶系统和悬浮在血浆中的 EV。在生理上，这些成分保持动态平衡。在病理条件下，循环中 EV 的显着增加会导致高凝状态，尤其是在脑外伤、先兆子痫、骨折和各种癌症患者^{中 13}。目前，临床实验室对凝血状态的评估主要涉及对凝血系统、抗凝系统和纤蛋白溶解的评估14,15,16,17。凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和国际标准化比值通常用于评估凝血系统中的凝血因子水平¹⁸。然而，最近的研究表明，这些测试并不能完全反映某些疾病的高凝状态¹⁹。其他测定方法，如血栓弹力测定法（TEG）、旋转 TEG 和声凝块分析，可测量全血粘弹性变化^20,21。由于全血样本含有大量血细胞和血小板，因此这些测试更有可能表明整个样本的凝血状态。一些研究人员报道了血细胞和血小板在促凝血活性中的作用^22,23。最近的一项研究还发现，以前的凝血功能测试在检测微粒促凝血活性的变化方面面临困难²⁴。因此，提出了一个假设，即可以通过对富含 EV 的血浆中活化凝血时间（ACT）的粘弹性测量来评估 EV 的促凝血功能。

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Protocol

人体样本采集经天津医科大学总医院医学伦理委员会批准。人静脉血采集严格按照中国国家卫生健康委员会发布的指南，即WS/T 661-2020《静脉血标本采集指南》。简而言之，从肱前静脉知情同意的健康个体中采集血液，并使用 3.2% 柠檬酸钠抗凝剂以 1：9 的比例混合样本。当仅收集柠檬酸钠抗凝剂标本时，丢弃第一个收集容器。在样品采集后 0.5 小时内启动处理流程。在获得知情同意后招募成年健康受试者进行样本采集。患者排除标准为：（1）近期血管内血栓形成，（2）肝肾功能损害，（3）高血压，高脂血症，糖尿病和其他慢性疾病，（4）阿司匹林或抗凝治疗，（5）月经和怀孕。

1. 分离富含EV的等离子体

在室温下以120× g 离心样品20分钟以除去血细胞。上清液是富含血小板的血浆。然后，将上清液的上部1/2转移到带有移液管的新离心管中。
在室温下以1500× g 离心富含血小板的血浆20分钟以除去血小板。上清液是贫血小板血浆。然后将上清液的上部1/2转移到新的离心管中。
在室温下以13000× g 离心血小板贫血浆2分钟以除去细胞碎片。上清液是富含EV的等离子体。然后，将上清液的上部1/2转移到新的离心管中进行后续测试。

2. 分析仪检测样品的EV-ACT

打开凝块分析仪（见 材料表）并将仪器预热至37°C。安装一次性探头和测试杯，然后启动机器的质量控制程序。
注意：当屏幕上的粘性电阻信号值显示为直线时，表示检测不受干扰，分析仪状态的质量控制合格。自检合格后即可启动测试程序。
将样品信息输入系统。然后，将 200 μL 富含 EV 的血浆转移到测试杯中，然后转移 20 mM 170 μL 氯化钙。单击“开始”按钮。测试杯中的磁力搅拌棒将样品和氯化钙充分混合。关闭盖子，探头将开始检测样品电阻的变化。
注意：测试完成后，分析仪会自动提示“测试完成”。EV-ACT的时间由系统显示和记录。结果以时间单位“秒”表示。丢弃探头并测试杯子。

3. 基于流式细胞术的富EV血浆样品质量控制

EV首先通过其大小（0.1-1μm）进行识别。提前调整流式细胞仪的参数，并使用市售的聚苯乙烯珠（0.5、0.9和3.0μm）设置EV的“门”（参见 材料表）。
注意：珠混合物由不同直径的荧光球组成，覆盖微囊泡（0.5和0.9μm）和血小板（0.9μm和3μm）的尺寸范围。
调整正向散射和侧向散射的电压，并确保0.9μm微球落在适当的区域。EV区域可以根据微球的直径绘制。
将 50 μL 富含 EV 的血浆转移到流管中，然后转移 450 μL 过滤的磷酸盐缓冲盐水。将流管中的液体彻底混合。最后，使用流式细胞术²⁵检测样品。
使用Ultra Rainbow荧光颗粒（见 材料表）量化 EVs.In 简略的数量，在流量检测前向样品中加入10μL颗粒，并在样品检测完成后使用以下公式计算EV浓度：10,120 * EV （#） / （微珠 * 体积）* 稀释因子²⁶。

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Representative Results

使用粘弹性法分析仪测量富含EV的血浆的凝血酶活化时间，用于血浆凝血时间测量。该机器由四个主要部件组成：电子信号转换器、探头、检测罐和加热元件（图 1A、B）。该探头利用高频和低振幅振荡来检测等离子体粘度的变化。日常质量控制主要涉及空气质量控制，以评估测试平台的稳定性并识别对探头的任何物理干扰。性能质量控制包括使用标准粘度油进行测试，以确保探头检测到的电阻值在设定范围内。

获得富含 EV 的血浆后，使用流式细胞术测量 EV 以进行样品质量控制。不合格的样品在EV的“栅极”附近表现出明显的团簇，粒径略大（图2A）。相比之下，合格的富含 EV 的样本表明，大多数信号作为一组落在 EV 的“门”内（图 2B）。

为了评估来自健康志愿者的富含 EV 的血浆样品中的 EV 浓度，进行了超高速离心（1,00,000 x g，70 分钟）。结果显示，EV浓度的增加缩短了EV-ACT，而EV浓度的降低延长了EV-ACT（图3A）。EV-ACT 时间可能与 EV 水平呈负相关。检查了来自临床患者的几个样本，结果表明，与健康志愿者相比，来自先兆子痫、髋部骨折和肺癌患者（从左到右）的富含 EV 的血浆样本的 EV-ACT 时间明显更短（图 3B）。

综上所述，初步建立了一种快速且具有成本效益的EV促凝血活性检测实验方法，有望在临床临床上应用。

图1：凝块分析仪的原理图和物理图像。（A）和（B）分别代表分析仪的主要部件和操作设置。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2：富含 EV 的血浆中 EV 的代表性流式细胞术。 （A）不合格的富含 EV 的血浆样品。（B）合格的富含 EV 的血浆样品。请点击这里查看此图的较大版本.

图3：样品EV-ACT的代表性结果。（A）来自健康志愿者的富含 EV 的样品中去除 EV 后的 EV-ACT 结果和 EV 浓度（从左到右、超速离心后的沉积物悬浮液、富含 EV 的血浆和超速离心后的上清液）。（B）来自健康志愿者和患者（从左到右、先兆子痫、髋部骨折、肺癌和健康志愿者）的富含 EV 的样本的 EV-ACT 结果。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

本研究阐述了富EV血浆的制备方法，并采用流式细胞术验证了该方法的合理性。随后，使用基于粘弹性^{原理 24} 的凝块分析仪对再钙化的血浆样品进行 ACT 时间分析。如图3A所示，发现通过超速离心获得的EV浓度缩短了EV-ACT时间，而超速离心后的上清液降低了EV-ACT时间，表现出更长的EV-ACT时间。这些发现表明 EV-ACT 结果与 EV 水平之间存在密切关系。在图3B中，将先兆子痫、髋部骨折和肺癌患者血浆样本的EV-ACT与健康志愿者进行了比较，结果显示疾病组的EV-ACT时间明显缩短。先前的报告表明，这些疾病的血浆中促进凝血的 EV 水平升高 27,28,29。然而，应该注意的是，血浆中存在的其他因素可能会影响 EV-ACT 结果，因此需要进一步探索这些影响因素。该测定旨在识别 EV 在某些疾病的高凝状态中的关键作用，并解决缺乏低成本和快速检测 EV 促凝血活性的方法。

在分离的血液样本系统中，凝血相关物质可分为血细胞、血小板、细胞代谢物（主要是EVs）和其他“看不见”的成分（如凝血因子和抗凝因子）30,31,32。鉴于凝血机制的复杂性，检测系统被简化为富含EV的等离子体，以尽量减少其他因素的干扰。该过程的关键步骤包括防止在样品处理过程中产生人工 EV 和最大限度地减少血小板污染。因此，有必要在0.5小时内启动差速离心程序，并在样品收集后2小时内完成检测。先前的研究表明，使用足够高的离心力并保留上清液的上半部分可以有效减少血小板污染³³。流式细胞术用于检测富含 EV 的血浆中残留的血小板，确认它们的存在非常低。不合格的样品主要是由于处理过程引起的血小板污染和细胞碎裂造成的。血小板污染的特征是 EV 的“门”外存在颗粒，而细胞碎裂在 EV 的“门”内表现为一个独特的簇。

最近的研究证实，在某些疾病中，血浆 EV 水平显着升高^34,35。这些 EV 主要通过其表面存在磷脂酰丝氨酸（PS）和组织因子（TF）来促进凝血。因此，富含 EV 的等离子体的 ACT 时间很大程度上取决于凝固剂 EV 的水平。该测试的一个局限性是需要确保凝血因子的水平不会显着变化，以至于它们在 EV-ACT 分析期间影响凝血时间。然而，关于发病后凝血因子水平变化的研究相对较少，它们对 EV-ACT 的影响需要在进一步的研究中评估。此外，过量使用抗凝药物会显着影响 EV-ACT 结果，因此在此类治疗期间不应采用这种方法。

有几种方法可以确定促凝血 EV，每种方法都有其优点和缺点。Piwkham 等人通过将 EV 悬浮液与正常血浆混合并观察 37 °C 水浴中血凝块形成的时间来评估 EV 促凝血剂活性³⁶。虽然这种方法很简单，但对凝块形成时间的主观观察会导致不同观察者之间的结果差异。Patil 等人采用内部标准化凝血测定法在半自动凝血仪³⁷ 上使用 Russell viper 毒液进行促凝血微粒测试。这种检测方法采用半自动设备，效率高，简单易行。然而，添加罗素毒蛇毒液来激活因子 X 忽略了血浆中其他抗凝剂的存在，例如乳粘蛋白。该方法根据血浆中促凝血 EV 和抗凝成分之间的平衡评估结果，从而更准确地反映血浆样本的凝血功能。

现有的凝血功能测试主要关注全血或富血小板血液中的凝血酶活化时间，或检测凝血因子的缺乏²⁴。开发 EV 促凝血活性的测试方法将有助于阐明 EV 在疾病和未来治疗中的作用。样品制备过程简单，仅添加CaCl₂，便于临床医生快速确定患者的凝血功能状态。EV-ACT测试易于执行，可在10-15分钟内获得结果，非常适合作为床边测试开发。先前的研究已初步确定了 EV-ACT 在先兆子痫、肿瘤和骨折中的应用。未来的研究将继续探索EV-ACT的临床应用前景。

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Disclosures

所有作者都声明不存在潜在的利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助，81901525年81930031号资助。此外，我们感谢天津世纪亿康医疗科技发展有限公司为我们提供的机器和技术指导。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.