Summary
이 논문은 편광에 민감한 이광자 현미경을 적용하여 표지가 없는 아밀로이드 상부구조-구형석 내의 국소 조직을 특성화하는 방법을 설명합니다. 또한 샘플을 준비 및 측정하고, 필요한 설정을 조립하고, 데이터를 분석하여 아밀로이드 섬유의 국소 조직에 대한 정보를 얻는 방법을 설명합니다.
Abstract
1광자에 비해 2광자 여기(excitation)는 광독성이 낮고, 조직 침투가 깊고, 조밀하게 밀집된 시스템에서 효율적으로 작동하고, 형광단의 각도 광선택이 감소하기 때문에 바이오이미징 실험에 유용합니다. 따라서 이광자 형광 현미경(2PFM)에 편광 분석을 도입하면 선형 광학 프로세스를 기반으로 하는 표준 이미징 방법에 비해 샘플의 분자 조직을 보다 정밀하게 측정할 수 있습니다. 이 연구에서는 편광에 민감한 2PFM(ps-2PFM)과 복잡한 생체 구조-아밀로이드 구형 입자 내 분자 순서 결정에 대한 응용에 중점을 둡니다. 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환은 종종 손상된 단백질 접힘 과정으로 인해 형성된 아밀로이드 단백질 응집체의 검출을 통해 진단됩니다. 이들의 구조를 탐구하면 생성 경로를 더 잘 이해할 수 있고, 결과적으로 더 민감한 진단 방법을 개발할 수 있습니다. 이 논문은 소 인슐린 구형석 및 구형 아밀로이드 단백질 응집체 내부의 국소 피브릴 순서 측정에 적합한 ps-2PFM을 제시합니다. 또한, 우리는 제안된 기술이 구형석 내부의 피브릴의 3차원 조직을 해결할 수 있음을 증명합니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 단백질과 그 응집체1의 바이오이미징을 위한 수많은 형광 현미경 기술이 크게 발전했지만, 샘플 2,3 내에서 국소 순서를 확인하는 데 사용된 것은 소수에 불과합니다. 형광 수명 이미징 현미경4는 아밀로이드 상부 구조-구형석의 고유한 구조적 이질성을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 구형석(spherulites)과 같은 복잡하고 조밀하게 포장된 생물구조 내부의 국소 질서에 대한 정량적 결정은 편광에 민감한 방법을 사용하여 해결할 수 있습니다3. 그러나 UV-VIS 파장을 사용하여 생체 내 형광단을 여기시키면 조직 광 산란이 높기 때문에 표면 조직 침투를 사용하는 표준 형광 기술은 제한적입니다5. 또한 이러한 이미징은 종종 특정 형광 프로브를 설계하고 표적 생체 분자에 바인딩해야 하므로 이미징을 수행하는 데 필요한 비용과 작업량이 증가합니다.
최근 이러한 문제를 해결하기 위해 우리 팀은 생물학적 구조의 무표지 이미징을 위해 편광 민감성 이광자 여기 형광 현미경(ps-2PFM)을 채택했습니다 6,7. Ps-2PFM은 여기 빔의 선형 편광 방향에 대한 이광자 형광 강도의 의존성을 측정하고 방출된 형광8의 편광을 분석할 수 있습니다. 이 기술을 구현하려면 표준 다광자 현미경 설정 여기 경로(그림 1)를 반파장 플레이트로 보완하여 광 편광면을 제어해야 합니다. 그런 다음 여기 레이저 빔의 편광에 대한 이광자 여기 형광 강도의 의존성을 나타내는 극좌표 그래프가 두 개의 애벌랜치 포토다이오드에 의해 수집된 신호에서 생성되어 형광 편광의 두 개의 상호 수직 구성 요소를 수집합니다.
마지막 단계는 데이터 분석 프로세스로, dichroic mirrors 또는 high numerical aperture objective와 같은 광학 요소가 편광에 미치는 영향을 고려합니다. 이광자 공정의 특성으로 인해 이 방법은 초점면 외부의 형광단의 이광자 여기가 확률적으로 제한되기 때문에 각도 광선택이 감소하고 축 분해능이 향상됩니다. 또한 심부 조직 이미징을 위한 근적외선 프로브(NIR)의 생체 내 이미징에 대해 유사한 방법을 성공적으로 구현할 수 있음이 입증되었습니다9. Ps-2PFM은 이전에 세포막10 및 DNA11,12의 이미지 형광단뿐만 아니라 금 나노 입자13과 같은 생물학적 시스템의 비표준 형광 마커에 적용되었습니다. 그러나, 이 모든 예에서, 생체 분자의 조직에 관한 정보는 간접적으로 얻어졌고 형광단과 생체 분자 사이의 사전 정의된 상호 배향을 필요로 했습니다.
최근 논문 중 하나에서 우리는 ps-2PFM이 구형석의 아밀로이드 피브릴에 결합된 아밀로이드 특이적 염료인 Thioflavin T의 아밀로이드 상부 구조 및 형광의 자가형광 국소 분극을 결정하는 데 성공적으로 적용될 수 있음을 보여주었습니다6. 또한, 또 다른 연구에서는 ps-2PFM을 서브미크론 크기 영역에서 아밀로이드 구형 구형 내부의 아밀로이드 피브릴 배향을 검출하는 데 사용할 수 있음을 입증했으며, 이는 투과 전자 현미경(TEM) 이미징7과 연관시켜 확인되었습니다. 이 결과의 달성은 i) 하나 또는 두 개의 광자로 여기될 때 구형석-아밀로이드의 고유 자가형광이 450에서 500nm 범위에 위치한 방출 최대값 및 표준 형광 염료14와 유사한 이광자 흡수 단면을 나타내는 고유 자가형광을 나타내고, ii) 생물학적 막 및 DNA 구조를 표지하는 염료의 ps-2PEF가 어떻게 적용될 수 있는지 설명하기 위해 이전에 소개된 수학적 모델 덕분에 가능했습니다. 구형석과 염료에 의해 표시되는 형광 8,11,15. 따라서 분석을 진행하기 전에 이 주제6에 관한 첫 번째 논문의 본문과 지원 정보 모두에 설명된 필수 이론을 살펴보는 것이 좋습니다. 여기에서는 소 인슐린 구형석의 무표지 아밀로이드 구조적 특성 분석을 위해 ps-2PFM 기법을 적용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
1. 완전히 자란 구형석으로 현미경 슬라이드 준비
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 모든 용액은 정수 시스템에서 얻은 탈이온수(25°C에서 18.2MΩ·cm)로 제조되었습니다.
- Krebs et al16에 의해 기술된 프로토콜에 따라 아밀로이드 스페룰라이트를 배양합니다. 아래에 설명된 대로 몇 가지 수정이 있습니다.
- 1.5mL 튜브에 인슐린 분말 10mg을 넣습니다.
- 탈이온화된 H2O/HCl 용액(pH 1.5)의 1mL 부분 표본으로 분말을 용해시킵니다.
- 샘플을 테이프로 밀봉하고 열 믹서에 넣어 70°C(0rpm)에서 24시간 동안 배양합니다.
참고: 아밀로이드의 네이티브(즉, 수화된) 환경에서 이미징을 수행하고 탈수로 인한 샘플 변형을 방지하려면 다음 설명( 그림 2 참조)에 따라 현미경 슬라이드를 준비해야 합니다.
- 현미경 유리 슬라이드를 물로 철저히 씻으십시오.
- 슬라이드를 메탄올에 담그고 먼지가 없는 물티슈로 주변 조건에서 건조시킵니다.
- 자동 피펫(단계 1.1.2)이 있는 튜브에서 구형석 용액의 100μL 부분 표본을 가져와 현미경 슬라이드의 중앙 영역에 있는 웰에 추가합니다.
- 기포가 형성되지 않도록 커버슬립으로 용액을 덮으십시오.
- 자동 피펫을 사용하여 슬라이드의 커버슬립 가장자리를 따라 마운턴트를 증착하여 구형석의 기본 용액을 밀봉합니다.
알림: 슬라이드 마운던트를 커버슬립과 슬라이드 표면 모두에 부착하는 것이 매우 중요합니다. 휘발성 용매(크실렌)의 독성 때문에 발연 후드 아래에서 이 작업을 수행하십시오. 그림 2의 삽입을 참조하십시오. - 현미경을 그대로 두십시오.amp마운턴트가 굳을 수 있도록 주변 조건에서 le.
알림: 경화 과정은 온도와 습도에 따라 다르지만 12시간 이내에 완료되어야 합니다. - 교차 편광판이 있는 편광 광학 현미경(POM)을 사용하여 인슐린 구형석이 올바르게 형성되었는지 확인합니다. 샘플을 스캔하여 그림 3과 같이 Maltese cross라고 하는 밝은 영역의 특징적인 패턴을 찾습니다.
참고: 아밀로이드 구형석은 코어-쉘 구조를 가진 이질적인 형태를 특징으로 하는 구형 상부구조로 정의할 수 있습니다. 상세하게는, 이들은 비정질 코어(amorphous core)와 방사상으로 성장하는 아밀로이드 피브릴(amyloid fibril)(16)로 구성된다. 구형 구조의 이방성 특성으로 인해 편광과 뚜렷하게 상호 작용(예: 굴절)하고 위상을 변경할 수 있으며, 이는 교차 편광판이 있는 POM에서 쉽게 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 모델과 같은 Maltase 교차 패턴을 특징으로 하는 완전히 발달된 구형석만을 연구하는 데 사용되었습니다. 결과적으로, 응집체 또는 구조적으로 왜곡된 구형석은 추가 조사에서 제외되었습니다.
2. 시스템 구축 및 조정
참고: 편광에 민감한 이광자 현미경의 개략도는 그림 1에서 확인할 수 있습니다.
- 예를 들어 690-1,080nm 범위의 출력 파장 조정 기능이 있는 펨토초 레이저를 설치합니다.ample, 80MHz 반복률의 ~100fs 펄스를 가진 모드 잠금 Ti: 사파이어 레이저에서 작동합니다.
- 회전 스테이지에 장착된 반파장 플레이트를 셋업의 여기 경로에 추가하여 XY 현미경 샘플 평면에서 입사광의 편광을 제어합니다.
- dichroic mirror를 설치하여 검출 광학 장치에서 excitation beam을 차단합니다.
NOTE: dichroic mirror의 광학적 특성은 NIR 파장 범위에서 excitation beam(표본으로)을 반사하고 샘플의 방출에 해당하는 파장 범위에 대해 동시에 투명해야 합니다. - 선택한 Z에 대한 XY 평면 내에서 래스터 스캔을 위한 압전 스캐닝 스테이지를 설치합니다.
- 높은 개구수의 이멀젼 대물렌즈(예: 아포크로매틱 오일 이멀젼 대물렌즈 100x/1.4 NA)를 장착합니다.
알림: 전체 설정이 epi-fluorescence 모드에서 작동하므로 입사 신호와 방출된 신호는 동일한 대물렌즈를 통과합니다. - 방출 경로에서 2광자 여기 방출을 직교하는 두 개의 편광 성분(IX 및 IY)으로 분할하는 편광 빔 스플리터를 추가합니다
- 두 개의 광자 계수 애벌랜치 포토다이오드(APD)를 각각 빔 스플리터를 사용하여 투과 및 반사된 빛을 수집할 수 있는 구성으로 설치합니다(그림 1).
- 시스템의 excitation 및 emission 경로에 올바른 파장 종속 cut-off filter를 장착합니다(예: excitation optical path에 직접 800nm long-pass filter, emission path에 700 short-pass filter).
알림: 올바른 방출 필터를 사용하여 2차 고조파 생성(SHG) 또는 레이저 광의 잠재적 기여를 배제할 수 있도록 구형석의 방출 스펙트럼을 분석합니다. 또한 이 시스템은 편광에 민감한 SHG의 측정을 허용해야 하며, 이는 샘플 내 생체 분자의 순서를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 SHG 신호의 데이터 분석은 Aït-Belkacem et al.17에 의해 더 자세히 설명된 형광과 다릅니다. - 두 포토다이오드를 사용하여 유사한 신호 강도가 수집될 때까지 전체 시스템을 정렬합니다(많은 레이저에 내장된 정렬 모드 사용).
- 높은 NA 대물렌즈에 의해 초점이 맞춰지고 카메라에서 이미징된 여기 빔이 그림 4A와 같이 동심원 모양인지 확인합니다.
- 스캔 시간과 해당 전력을 조정하여 샘플에 입사 레이저로 인한 손상을 최소화합니다. 예시적인 점-유사 연소가 도 4B에 제시되어 있다. 현미경 본체 입구에 있는 포토다이오드 파워 센서에 연결된 디지털 핸드헬드 파워 미터를 사용하여 공칭 파워를 측정합니다.
알림: 생물학적 표본은 레이저 조명으로 인해 쉽게 화상을 입을 수 있습니다. 이 경우 100 -900 μW 출력 범위(대물 렌즈의 초점)는 샘플 안정성과 강렬한 방출 사이의 탁월한 절충안인 것으로 밝혀졌습니다. - 시료를 측정하기 전에 등방성 참조 시료(예: 비정질 폴리머에 포함된 플루오레세인)를 사용하여 광학 장치의 정렬 품질을 테스트합니다. 보정 검사를 수행하려면 섹션 3에 설명된 절차를 따르십시오 아밀로이드 샘플 대신 등방성 참조.
참고: 등방성 특성을 가진 샘플에 대해 현미경 설정이 이상적으로 조정된다고 가정할 때, 두 개의 APD로 검출된 두 2P 방출 성분(I X 및 IY)은 동일한 강도로 특성화되어야 합니다(그림 4C).
3. 소 인슐린 구형석의 측정
참고: 설명된 모든 ps-2PF 측정을 수행하기 위해 압전 스테이지와 반파장판의 위치를 제어하고 두 포토다이오드에서 신호를 수집하는 수기 소프트웨어가 사용되어 현미경 슬라이드의 선택한 영역에서 XY 스캔(래스터 스캔)을 플로팅하고 특정 샘플 좌표에서 극좌표를 그래프로 표시할 수 있습니다. 프로토콜에 추가 참고 사항도 추가되어 사용자가 반파장 플레이트를 회전시키는 데 사용되는 피에조 스테이지와 회전 스테이지 모두 자체 컨트롤러 또는 해당 소프트웨어를 사용하여 제어할 수 있기 때문에 사용자가 측정 없이 측정을 수행할 수 있습니다. 그러나 반파장판의 회전 각도와 두 포토다이오드로 수집된 2PEF 강도를 결합한 알고리즘을 작성하는 것이 강력히 권장되는데, 이 상관관계(극성 그래프)는 구조 정보를 생성하는 적절한 데이터 분석에 매우 중요하기 때문입니다.
- 압전 스테이지에 구형석으로 시편을 장착합니다(테이프로 유리 슬라이드를 고정). 높은 수치의 대물렌즈는 상대적으로 짧은 작동 거리가 특징이므로 얇은 유리 면(커버슬립)이 대물렌즈를 향하는 방식으로 장착해야 합니다.
알림: 오일 이멀젼을 사용하기 때문에 시편을 장착하고 초점을 맞추기 전에 대물렌즈에 약간의 미네랄 오일을 도포해야 합니다. - 현미경 손잡이를 사용하여 XY 및 Z 위치를 변경하여 용액에서 발견되는 구형석 중 하나에 대물렌즈의 초점을 맞추되, 구형석 직경은 일반적으로 수십 μm 범위이므로 전체 구조의 중앙 영역 내에 초점을 맞춥니다. 특정 구형석 주위의 흑백 후광을 각각 초점이 부족하고 위쪽에 있다는 신호로 찾습니다. "Z"축이 이러한 극단 사이에 오도록 조정합니다.
참고: 구조적 결함이 없는 분리된 샘플을 찾는 것이 중요합니다. 매우 작은 구형석은 대물렌즈에 의해 도입된 재료 응력으로 인해 표류할 수 있으며, 가장 큰 구조는 응집되거나 심하게 왜곡될 수 있습니다. - 관찰된 현미경 평면의 시야에서 구형석을 중앙에 놓고 전체 구조의 영역을 커버하는 데 필요한 X 및 Y 방향의 압전 단계 수(압전 스테이지 컨트롤러 또는 소프트웨어에 표시됨)를 확인하여 XY 스캔의 크기를 결정합니다.
알림: XY 스캔의 시작이 구형의 모서리 중 하나 근처에 있고 s의 영점 위치와 일치하도록 시스템을 설정하는 것이 좋습니다.tage(X 및 Y = 0) - 다음 스캔 매개변수를 조정합니다.
- 여기 빔의 편광을 조정하고 반파장 플레이트를 회전하여 현미경 샘플 평면의 "X" 및 "Y" 축에 해당하는 편광을 얻습니다.
참고: 이것은 fluorescein과 같은 등방성 형광 매체의 극성 그래프를 측정하여 수행할 수 있습니다. 이러한 물질의 경우, 최대 형광 강도는 여기 빔 편광과 평행합니다. 따라서 반파장 플레이트를 회전시키면 관찰 평면에서 X 및 Y 축으로 편광이 조정되며, 그림 4C와 같이 극 그래프에서 X 및 Y 축으로도 표시됩니다. 전체 극성 그래프는 반파장 플레이트의 180° 회전(여기광 편광의 360° 회전)에 대해 두 포토다이오드에서 측정된 2PEF 강도를 수집하고 강도를 여기광 편광 각도와 상관 관계를 지정하여 측정할 수 있습니다. 모든 반파장 플레이트 각도에 대한 방출 강도를 개별적으로 측정한 다음 데이터 분석 소프트웨어에서 극 그래프로 조립하거나 전용 또는 자체 작성 소프트웨어를 사용하여 자동으로 수동으로 수행할 수 있습니다. - 피에조스테이지 매개변수를 조정합니다: 스캐닝 속도, 단계 및 전체 구형석의 영역을 덮는 범위.
참고: 스캐닝 범위는 구형 직경보다 높아야 래스터 스캔 내에서 전체 상부 구조를 완전히 구성할 수 있습니다. 낮은 스캔 속도와 단계를 통해 사용자는 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이로 인해 샘플 연소가 발생할 수 있습니다. 따라서 구형 라이트 크기에 따라 절충이 필요합니다. 이러한 매개변수는 보편적으로 적용할 수 없습니다. 도 5A에 사용된 예시적인 파라미터들: 스캐닝 범위 45 x 45 μm, 스캐닝 단계 1 μm, 및 스캐닝 속도 2 μm/s.
- 여기 빔의 편광을 조정하고 반파장 플레이트를 회전하여 현미경 샘플 평면의 "X" 및 "Y" 축에 해당하는 편광을 얻습니다.
- 셔터를 열고, 포토다이오드를 켜고, 선택한 스캐닝 영역의 모든 단일 단계에 대해 X축과 Y축에 따라 편광된 여기 빔에 대해 2P 방출 성분을 수집
합니다. 인슐린 구형석의 예시적인 2광자 여기 자가형광(2PAF) 래스터 스캔이 그림 5A에 제시되어 있습니다.
참고: 래스터 스캔을 측정하려면 피에조 스테이지 좌표를 수집된 방출 구성 요소와 상호 연관시켜야 하며, 이는 선택한 영역의 모든 단일 지점에서 강도를 측정한 다음 2D 매트릭스로 조립하거나 자체 작성 소프트웨어를 통해 자동으로 수동으로 수행할 수 있습니다. 래스터 스캔은 방출 구성요소의 강도를 합산하거나 특정 배출 구성요소에 대해 고유하게 표시할 수 있습니다. 구조에 매우 의존적이기 때문에 구형 내의 구조적 왜곡을 쉽게 볼 수 있습니다. 그러나 현미경 스테이지의 움직임으로 인해 일부 샘플이 시야에서 벗어날 수 있습니다. 따라서 이미지에 아티팩트가 있는지 스크리닝해야 합니다. 스캔 전후에 구형석의 위치를 확인해야 합니다. - 샘플의 특정 지점에서 전체 편광 분석을 수행하려면 여기 빔을 끄십시오.
- 그런 다음 μm 미만의 분해능으로 분자 방향에 대한 정보가 필요한 구형석에서 선택한 위치에 해당하는 압전 단계의 특정 좌표를 선택합니다.
- 압전 조정 stage를 중앙에 두도록 view 표시된 (X, Y)에서.
- 여기 빔을 켜고 반파판의 회전(360° 회전)을 켜서 전체(180°) 편광 분석 및 방출을 수행합니다. 2PF Ix 및 Iy 구성 요소를 극좌표 그래프 형태로 표시합니다( 그림 5B 참조).
참고: 이 단계는 충분한 양의 데이터를 수집하기 위해 샘플의 다른 위치에서 반복할 수 있습니다.
4. 소 인슐린 구형 내부의 국소 섬유소 순서 결정
참고: 데이터 분석과 관련된 모든 수치 계산은 Python 프로그래밍 언어를 사용하여 수행되었으며 NumPy 및 SciPy 라이브러리에서 사용할 수 있는 기능을 기반으로 합니다. 데이터를 플로팅하려면 Matplotlib 라이브러리가 필요합니다. 모든 계산은 Obstarczyk et al.6의 논문 중 하나에 있는 지원 정보에 제시된 공식을 기반으로 합니다.
- 입사광 편광의 선택된 방향을 가진 분자의 지정된 분포에 대해 여기된 이광자 형광의 강도를 시뮬레이션합니다( α)
참고: 제시된 공식은 형광단의 병렬 흡수 및 방출 쌍극자 모멘트의 가정을 기반으로 합니다. 다른 경우(예: 흡수 및 방출 쌍극자 모멘트의 다른 방향, 형광단 간의 에너지 전달)에 대한 논의는 Le Floc'h et al.의 논문을 참조하십시오8.- 편광 혼합에 의한 전기장의 변화와 설정에 장착된 이색성 미러에 의해 발생하는 탈분극 효과를 설명하는 매개변수를 찾으십시오.
- γ 는 dichroic mirror의 반사광
과 
편광된 빛 사이의 진폭 계수를 나타냅니다. - δ는 편광과 편광된 빛 사이의 위상 변이(타원도)를 나타냅니다.
참고: 이 두 파라미터를 올바르게 정의하는 것은 측정된 극좌표 그래프(11,18)의 형상에 강한 영향을 미치기 때문에 성공적인 구조적 특성화를 위해 매우 중요하다. 제시된 시스템의 경우, 두 파라미터 모두 시스템에 적용된 이색성 거울의 타원체 측정 중에 결정되었습니다.
- γ 는 dichroic mirror의 반사광
- 방정식 (1-5)를 사용하여 ps-TPFM 측정 중에 측정된 모든 각도의 X축과 Y축에서 전파되는 입사 전기장 벡터를 계산합니다.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
노트 360°를 사용하여 전체 1°에 걸쳐 강도를 측정하는 경우 모든 360°에 대한 전기장 벡터를 계산합니다. 모든 각도는 라디안 단위여야 합니다. ρ 매개변수는 시뮬레이션된 전기장의 광 주파수 ω 에 연결됩니다(ρ=ω·t)를 사용하고, ps-TPFM 측정 중에 측정된 모든 각도에 대해 X축 및 Y축으로 전파되는 입사 전기장 벡터 α 계산하는 동안 0에서 2π까지 적분하는 데 사용하였다. - 방정식 (6-8)에 따라 데카르트 시스템의 세 축 방향에서 전이 쌍극자 모멘트에 대한 함수를 정의합니다.
(6)
(7호)
(8호)
참고: φ는 XY 샘플 프레임에서 아밀로이드 피브릴 장축의 방향 각도입니다. θ 및 φ 각은 형광단의 전이 쌍극자 모멘트 방향을 정의하는 데 사용되는 극성 및 방위각입니다. - 4.1.3단계에서 정의된 함수를 사용합니다. 방정식 (9, 10)을 사용하여 X 및 Y 방향의 형광 편광 검출에 대한 높은 개구수 대물렌즈를 사용한 타이트한 광 초점의 기여도를 설명하는 Jx (Φ,θ,φ) 및 JY(Φ,θ,φ)에 대한 함수를 정의합니다.
(9호)
(10호)
참고: K1, K2, K3 계수는 ps-TPFM 측정 중에 사용되는 현미경 대물렌즈와 관련이 있습니다. 이 실험에서는 아포크로매틱 오일 이멀젼 대물렌즈 100x/1.4 NA를 사용하였고 K1, K2, K3 계수는 각각 2.945, 0.069 및 1.016이었습니다. - 가변 두께 ΔΨ를 갖는 형광단 원뿔 Ψ의 절반 조리개에 따라 분자 각도 분포인 f(Ω)에 대한 함수를 정의합니다. 수학식 (11)을 사용한다. 아밀로이드 피브릴에 관한 세 가지 각도 모두의 그래픽 표현은 그림 6에 나와 있습니다.
(11호)
참고 : 지수를 작성하는 동안주의하십시오 - 2의 거듭 제곱은 전체 함수가 아닌 함수 인수에서 작동합니다! - 방정식 (12-21)에 표시된 대로 모든 fWWIJKL 인수를 정의합니다.
(12호)
(13호)
(14호)
(15호)
(16호)
(17호)
(18호)
(19호)
(20호)
(21호) - 방정식 (22, 23)을 사용하여 측정된 모든 각도(포인트 4.1.2와 유사)에 대해 2광자 여기 형광 강도
를 계산합니다.
= 
(22)
= 
(23) - 다음 변수 값(그림 7의 범례에 배치됨)을 사용하여 시뮬레이션이 올바르게 작동하는지 확인하고 얻은 결과를 그림 7A-C와 비교합니다.
알림: 모든 도는 라디안으로 작성해야 합니다.
- 편광 혼합에 의한 전기장의 변화와 설정에 장착된 이색성 미러에 의해 발생하는 탈분극 효과를 설명하는 매개변수를 찾으십시오.
- 시뮬레이션된 강도를 ps-2PFM 측정 중에 수집된 소 인슐린 구형석의 이광자 여기 자가형광 강도에 맞춥니다.
참고: ps-2PFM 측정을 기반으로 구형석 구조를 분석하려면 프로토콜에 작성된 방정식을 사용하여 이광자 여기 형광의 이론적 강도를 시뮬레이션하고 분자 형광단의 순서에 연결된 모든 매개변수를 피팅해야 합니다. XY 현미경 샘플에서 피브릴의 회전을 설명하는 각도인 Φ와 측정 중에 수집된 정규화된 이광자 여기 형광 신호 강도와 에 따라 시뮬레이션된 정규화된 강도 사이의 가능한 가장 높은R2 계수에 도달할 때까지 고정 Ψ에 대한 필라멘트의 분자 회전으로 인한 방출 쌍극자 Ψ의 원뿔형 분포의 수차인 ΔΨ에 대해 여러 번 반복해야 합니다. 프로토콜의 4.1단계.- Ψ 반각을 결정합니다.
참고: 소 인슐린 구형체의 경우 Ψ = 29°6과 같아야 합니다. - 피팅 워크플로우:
- 0°에서 180° 사이의 Φ 값을 선택합니다( 그림 8A 및 8B Φ = 각각 16° 및 127°).
- 0°에서 90°까지 ΔΨ 값을 선택합니다(그림 8A,B, ΔΨ = 각각 24° 및 1°).
- (방정식 22) 및 (방정식 23)을 선택한 Φ 및 ΔΨ 값을 사용하여 측정된 θ 각도의 전체 범위에 대해 계산 합니다.
- 시뮬레이션 중에 계산된 강도를 비교합니다(둘 다 최대값으로 정규화됨).
- Calculate ) 정규화된 농도가 0.5 μA 미만인
- ps-2PFM 측정 중에 측정된 계산 및 (둘 다 최대 값으로 정규화됨).
참고: 제시된 실험에서 Pearson 곱 모멘트 상관 계수는 NumPy Python 라이브러리의 "corrcoef" 함수를 사용하여 계산되었습니다.
- 마지막으로 그림 8과 유사한 시뮬레이션된 강도와 측정된 신호 간의 수렴과 가장 높은 상관 계수로 이어지는 Φ 및 ΔΨ 값을 선택합니다.
- Ψ 반각을 결정합니다.
과 
편광된 빛 사이의 진폭 계수를 나타냅니다.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7호)
(8호)
(9호)
(10호)
(11호)
(12호)
(13호)
(14호)
(15호)
(16호)
(17호)
(18호)
(19호)
(20호)
(21호)
를 계산합니다.
= 
(22)
= 
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Representative Results
제시된 프로토콜은 ps-2PFM을 사용한 테스트를 위한 아밀로이드 상부 구조 준비, 현미경 시스템 구성 및 적절한 샘플 측정에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 그러나 최종 측정 세트 전에 APD를 등방성 기준과 적절하게 정렬하는 것이 중요하며, 이를 통해 두 검출기에서 유사한 모양과 강도의 대칭 신호를 수집할 수 있습니다(그림 4C). X축과 Y축의 검출기에서 측정된 강도 간의 최소한의 차이도 추가 측정, 특히 분석 중에 적절한 보정 계수로 고려해야 합니다. 장착 후, 단일 구형석을 포함하는 샘플은 그림 2B에서와 같이 POM에 특징적인 몰타 십자가를 제공하고, 2PFM 래스터 스캔을 수행한 후, 이미지는 그림 5A에 표시된 것과 유사하게 보여야 하며, 이는 구형 석공석 6,7 및 다른 조직화된 생체 분자11,12에 대해 보고된 2PFM 래스터 스캔과 일치합니다. 밝기가 가장 높은 축의 위치에서 약간의 변화가 관찰될 수 있으며, 이는 형광 신호 강도가 여기 빔의 편광에 크게 의존한다는 사실과 관련이 있습니다. 따라서 half-waveplate의 어느 위치가 X축(그림 5A, 상단)과 Y축(그림 5A, 하단)을 따라 샘플의 여기(excitation)에 해당하는지 확인해야 합니다. 또한 선택한 다른 지점에서 전체 편광 분석을 수행하는 동안 극좌표 그래프가 어떻게 변하는지 주목할 가치가 있습니다. 구형석 바깥쪽의 극좌표 그래프는 아티팩트와 무작위 신호 잡음 스파이크의 모음처럼 보입니다(그림 5B, I). 이러한 그래프는 또한 측정 사이의 구형석의 드리프트를 나타낼 수 있으며 또 다른 2PF 래스터 스캔을 통해 전체 구조의 새로운 좌표를 찾아야 합니다. X축과 Y축을 따라 고도로 정렬된 인슐린 구형석의 위치에서 적절하게 측정된 극좌표 그래프가 각각 그림 5B II 및 III에 나와 있습니다. 이들은 선택된 지점(7)에서 측정된 형광단의 국부적 방향과 조직에 따라 다른 모양과 형상을 가질 수 있다.
프로토콜의 마지막 단계는 XY 평면 Φ에서 아밀로이드 섬유의 방향, 관련 형광단 과도 쌍극자 모멘트 Ψ 및 수차 ΔΨ(그림 6)를 강도 
및 
이광자 유도 형광과 결합하는 수학적 모델을 기반으로 하는 알고리즘을 사용하여 얻은 데이터를 분석하는 데 중점을 둡니다. 프로토콜에 표시된 올바르게 구현된 기능은 적절한 입력 데이터(프로토콜 단계 4.9)를 입력한 후 그림 7에 표시된 것과 동일한 극좌표 그래프를 생성해야 합니다. 모든 편차 - 다른 데이터 방향, 강도 또는 시뮬레이션 
된 및 
-의 모양은 코드의 오류를 나타냅니다. 모델이 작동하면 시뮬레이션된 데이터를 ps-2PFM 측정에서 얻은 실제 데이터에 프로토콜 피팅의 마지막 단계로 진행할 수 있습니다. 상관 계수가 가장 높은 Φ 및 ΔΨ 값을 선택하고 시뮬레이션된 강도와 측정된 신호 간의 수렴을 통해 그림 8과 같이 유사한 이미지를 얻을 수 있습니다. 및 의 전체 방향과 모양 에 가장 잘 맞 고 기능이 있어야 하며, Φ 및 ΔΨ 값은 구형석의 측정된 지점에서 피브릴 및 형광단의 국부 방향과 일치해야 합니다. 유사한 모형 및 적당한 방법은 또한 DNA11 같이 다른 생체 분자의 국부적으로 조직의 결심을 위해 이용될 수 있었습니다.
그림 1: 2광자 편광에 민감한 현미경 설정. 소 인슐린 구형석의 편광에 민감한 이광자 여기 형광 측정에 사용되는 이광자 현미경 설정을 보여주는 계획도. 수평 및 수직 편광(현미경 샘플 평면으로) 구성 요소는 각각 IX 및 IY로 표시됩니다. 약어: SP = 샘플 평면; O = 목표; DM = 이색성 거울; λ/2 = 반파장판; LPF = 장역 통과 필터; BE = 빔 익스팬더; P = 글랜 편광판; Ti : Sa = Titan : 사파이어 레이저 광원; M = 거울; SPF = 단거리 통과 필터; PBS = 편광 빔 스플리터; L = 광학 렌즈; APD = 애벌랜치 포토다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 슬라이드 준비/사진을 보여주는 구성표. (A) 밀봉된 샘플 전처리를 보여주는 계획; (B) 샘플 밀봉을 위한 후속 단계의 사진. I: 우물이 있는 현미경 슬라이드에 있는 구형석 용액의 100μL 부분 표본, II: 용액 위에 떨어진 커버슬립; III: 증착된 폴리머(마운턴트)로 형성된 단단한 밀봉. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 편광 현미경을 사용한 인슐린 구형석의 품질 관리. (A1,B1) 명시야 모드와 (A2,B2) 교차 편광판 아래. 특징적인 몰타 크로스 패턴은 crossed polarizers로 촬영한 해당 이미지에서 관찰할 수 있습니다. (A) 구조적 왜곡이 있는 구형 응집체, (B) 고품질 분리 구형 구형 응집체. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ps-2PFM 시스템의 정렬 테스트. (A) (A1) 이색성 거울이 없는 경우와 (A2) 이색성 거울이 있는 형광 형광의 동심 초점이 흐려진 이미지, (B) x 및 y 방향을 따라 선택된 지점에서 길쭉한 편광 분석으로 인해 발생한 탄 구멍이 있는 광손상 구형암, (C) 등방성 샘플(플루오레세인 용액)에 대해 등록된 입사광 편광 각도에 따라 달라지는 2광자 여기 방출 성분. 각각 X 및 Y 방출 편광 축을 측정하는 애벌랜치 포토다이오드로 측정된 방출 성분을 나타냅니다. 스케일 바 = 5 μm(A1,A2), 10 μm(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비표지 인슐린 스페룰라이트의 예시적인 2PFM 래스터 스캔 및 극좌표 그래프. (A) label-free 인슐린 구형체의 2PF 강도 래스터 스캔: 여기광의 편광: (A1) 수평 편광, (A2) 수직 편광 및 방출은 흰색 화살표로 표시되며, 삽입물은 교차 편광판이 있는 표준 편광 광학 현미경으로 이미지화한 동일한 구형석을 보여줍니다. (B) A1 스캔에 표시된 세 개의 지점에서 파생된 극좌표 그래프(B1, I; 나2, II; B3, III)를 참조하십시오. Ix및 Iy는 각각 X 및 Y 방출 편광 축을 측정하는 애벌랜치 포토다이오드에 의해 측정된 방출 성분을 나타냅니다. 약어: 2PF = 이광자 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 긴 피브릴 축에 대한 염료 방출 쌍극자의 원뿔형 분포(반각, Ψ). 점선은 긴 피브릴 축을 나타냅니다. XY 현미경 샘플 평면에서 피브릴의 회전은 각도로 설명됩니다. 필라멘트의 분자 회전으로 인한 Ψ의 수차는 ΔΨ로 설명됩니다. 이 그림은 Obstarczyk et al6에서 가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 편광된 이광자 여기 형광의 시뮬레이션된 강도. (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°에 대해 계산된 형광; (b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°; (c) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 60°. 빨간색, 파란색, 노란색 선은 각각 , , + 에 해당합니다 . Φ 각도는 XY 현미경 샘플 평면에서 피브릴의 회전을 나타내고, Ψ - 방출 쌍극자의 원뿔형 분포를 나타내고, ΔΨ- 필라멘트의 분자 회전으로 인한 Ψ의 수차를 나타냅니다. K1 = 2.945, K2 = 0.069, K3 = 1.016, γ = 0.01, δ = 0.98845 등 다른 모든 매개변수는 모든 경우에 동일했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 실험 데이터 세트의 극좌표 그래프. (A,B) 소 인슐린 구형석의 ps-TPFM 측정 중에 수집된 두 개의 실험 데이터 세트를 피팅한 후의 예시적인 극좌표 그래프. X 및 Y 방출 편광 축에 대한 측정 된 2 광자 여기 방출 성분은 각각 빨간색 및 파란색 점으로 표시되며, 한편, 실선은 X 및 Y 방출 편광 축 에 대한 해당 시뮬레이션된 2광자 여기 형광 방출 성분을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
편광에 민감한 이광자 현미경은 아밀로이드 상부구조 내부의 원섬유의 국부적 순서를 연구하는 데 유용한 도구로, 표준 다광자 설정을 약간만 수정하면 됩니다. 비선형 광학 현상에서 작동하기 때문에 단광자 여기 형광 현미경 방법에 비해 각도 광선택을 줄이고 축 분해능을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 단일 광자 여기 형광 현미경 기술19,20과 비교할 때 더 낮은 광 산란, 더 낮은 광독성 및 더 깊은 샘플 침투로 이어집니다. 우리가 이미 증명한 바와 같이, 이는 무표지 방식으로 수행될 수 있는 구형석(spherulites)과 같은 단백질의 조밀하게 충전된 응집체의 측정에 매우 적합하다21.
그러나 여기에 설명된 방법을 효과적으로 사용하려면 몇 가지 주요 문제에 주의를 기울여야 합니다. 시료 전처리와 그 품질, 즉 배양부터 시작하여 항상 아밀로이드 상부구조가 올바르게 성장했는지 확인합니다. 구형석의 경우, 교차 편광판이 있는 편광 광학 현미경을 사용하여 특징적인 몰타 십자 패턴을 제공하고 반경이 ~5μm16인 성숙한 구형석의 위치를 파악했습니다. 그러나 구형석은 이질적이며 샘플 내에서 독특한 구조를 관찰할 수 있습니다. 따라서 분리되고 왜곡되지 않은 종을 선택하는 것이 중요합니다. 측정 시스템 자체의 경우, 입사광의 편광을 제어하여 현미경 본체 입구에서 빔의 편광을 정밀하게 측정하고 사용된 광학 소자에 의해 도입되는 탈분극을 최소화하는 것이 중요합니다22. 최상의 성능을 보장하려면 excitation 및 fluorescence emission 파장에 맞는 고품질 silver mirror와 optical filter를 사용하는 것이 좋습니다. 방출 경로에서도 광 편광의 중요한 역할로 인해 실제 측정 전에 등방성 기준 샘플을 측정하는 것이 필수적입니다. 여기 경로와 APD 검출기가 올바르게 정렬되면 그림 4C와 같이 두 검출기 모두에서 동일한 강도의 신호를 볼 수 있습니다. 참조는 광표백을 피하기 위해 상대적으로 낮은 레이저 출력에서 강력한 이광자 여기 형광을 생성해야 합니다. 우리는 플루오레세인을 사용했는데, 다른 파장에 대한 이광자 흡수 단면이 이미 문헌23에 보고되었기 때문입니다.
구형 석체 내부의 구조 배열을 올바르게 결정하려면 데이터 분석에도 많은 주의를 기울여야 합니다. 이 모델의 기본 가정은 빛 흡수 및 방출의 전이 쌍극자 모멘트의 공선성입니다. 이러한 가정 하에서 분자의 전이 쌍극자 모멘트를 입사광의 편광과 평행하게 정렬하면 테스트된 샘플의 내부 구조와 결합하여 가장 높은 방출 강도를 얻을 수 있습니다. 주어진 모델은 두 쌍극자 모멘트(8 ) 사이의 각도의 작은 차이에 대한 좋은 근사치로도 사용할 수 있지만 큰 편차에 대해서는 추가 수정이 필요합니다. 그러므로, 설명된 바와 같이, 샘플에 관한 몇 가지 가정은 이미징 및 데이터 분석에 대해 선험적으로 고려되어야 합니다. 이 방법에 사용된 시뮬레이션과 방정식의 기반이 되는 모델 사례에서 시스템에서 탈분극의 주요 원인은 이색성 거울입니다. 그러므로, 데이터 분석을 진행하기 전에, 수집된 극성 그래프의 형상에 미치는 영향으로 인해 이색성 거울에 의해 도입된 탈분극을 담당하는 파라미터를 결정하고, 결과적으로, 피팅18 동안 검사된 구조 내의 분자 조직의 정확한 결정을 결정할 필요가 있다. 이것은 특히 여러 파장에 대한 측정의 경우 중요한 문제가 되는데, 이는 이색성 거울의 타원도의 변화가 뚜렷하게 파장에 의존하기 때문이다12. 탈분극의 유도는 수집된 신호(11)의 특성에 큰 영향을 미칠 수 있다. 마지막으로, 데이터 분석을 위한 스크립트를 작성할 때 프로토콜의 마지막 부분에 제시된 수학적 함수와 변수를 도입할 때 주의를 기울여야 합니다. 오류를 방지하려면 여러 함수 호출 및 전역 파라미터와 같은 기능에 집중하면 분석 시간도 크게 단축됩니다.
또한 설명된 방법을 사용할 때 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제를 언급해야 합니다. 시료 전처리 시간은 마운트제 경화 속도에 따라 크게 달라집니다. 이 속도를 높이려면 샘플을 따뜻하고 건조한 장소에서 준비하고 구형 용액을 밀봉한 후 현미경에 장착하는 것이 좋습니다. 측정을 너무 일찍 수행하면 슬라이드의 밀봉이 풀리고 사용된 대물 렌즈가 파손될 수 있습니다. 또한 적절한 샘플 준비에도 불구하고 대물렌즈에 의해 도입된 재료 응력으로 인해 측정 중에 작은 구형석이 용액에 떠다닐 수 있습니다. 이를 방지하려면 가장 큰 구조물이 일반적으로 골재이기 때문에 고립된 중간 크기 구조물을 스캔하는 것이 좋습니다. 측정을 시작하기 전에 이미지와 비교하여 데이터 수집 후 스캔한 구형석이 움직였는지 확인하는 것이 좋습니다. 또한 ps-2PFM을 측정하는 데 사용되는 모든 광학 소자와 검출기가 올바르게 정렬되었음에도 불구하고 측정된 강도 와 등방성 기준의 강도는 여전히 약간 다를 수 있습니다. 이러한 경우, 샘플 측정의 데이터를 분석할 때 강도 중 하나에 기준 측정 중에 결정된 보정 계수를 곱하여 이를 고려해야 합니다. 마지막으로, 피팅 절차 중에 스크립트가 Φ 및 ΔΨ의 일치하는 값을 찾지 못할 수 있습니다. 이것은 몇 가지 요인 때문일 수 있습니다 - 데이터는 샘플의 무질서한 지점, 예를 들어 구형석의 코어에서 수집되었습니다. 연구된 구조는 배양 중에 완전히 형성되지 않았습니다. 및 의 잘못된 시뮬레이션, 잘못된 이색성 미러 파라미터 사용 γ 및 δ; 피팅 중 각 반복 사이의 Φ 및 ΔΨ 각도에 대해 너무 큰 스텝 세트. 무질서한 지점의 경우 검사된 구조물의 둘레에 더 가까운 지점에서 데이터를 수집하는 것이 좋습니다. 불완전하게 형성된 구조의 경우 배양을 반복하거나 슬라이드에서 다른 구조를 검색하십시오. 잘못된 시뮬레이션의 경우 파라미터 Φ, Ψ 및 ΔΨ를 변경하여 시뮬레이션된 강도 를 수동으로 확인하고 코드의 오류를 변경 및 수정합니다. 잘못된 dichroic mirror 파라미터의 경우, 측정 중에 사용된 dichroic mirror의 γ 및 δ 파라미터를 주의 깊게 확인하십시오. 피팅 중 각도에 대해 설정된 큰 스텝의 경우 연속 반복 사이의 스텝을 2º 또는 1º로 줄입니다. 또한 구조의 강한 국부적 무질서의 경우 R2 는 항상 더 낮으며 종종 0.5-0.6 범위에서 더 낮다는 것을 기억해야합니다. 이는 제시된 모델이 대부분의 과도 쌍극자 모멘트가 유사한 방향으로 정렬되는 고도로 정렬된 분자를 설명하기 때문입니다. 따라서 비정질 또는 매우 무질서한 구조를 일치시키면 상관 계수가 낮아집니다. 따라서 획득한 데이터를 올바르게 분석하기 위해서는 측정 전에 샘플에 대한 최소한의 구조 정보를 보유하는 것이 중요합니다.
제시된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있다는 점도 주목할 가치가 있습니다. 데이터 분석은 충분히 높은 상관 계수를 가진 Φ 및 ΔΨ 각도의 여러 값을 생성할 수 있으므로 실험자는 적절한 값을 선택하기 위해 지식과 경험을 사용해야 합니다. 이 경우 형광단 원뿔 반각 Ψ 가 항상 수차 ΔΨ보다 커야 하는 것과 같은 경계 조건을 고려해야 합니다. 또한 데이터를 문헌과 비교할 때 일부 논문에서는 Ψ 를 전체 원뿔 각도로 설명하는 반면 우리는 반원뿔 각도로 작동한다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 또 다른 한계는 측정 분해능으로, 서브미크론 분해능으로 제한됩니다. 그 때문에 시스템의 광선택성과 그에 따른 국소 조직 결정은 단일 구조가 아닌 초점에서 여기된 피브릴의 평균 신호를 기반으로 합니다. 또한, fs 입사 레이저 출력(극지 그래프에 대한 데이터 획득에 필요)에서 장시간 노출되면 파괴적이고 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 샘플 자체가 충분한 형광 양자 수율을 가져야 합니다.
이러한 어려움에도 불구하고, 우리는 이 논문에 제시된 방법이 수화 및 복잡한 환경에서 생물 구조의 표지 기반 및 표지 없는 이미징을 위한 광범위한 응용 분야를 가지고 있다고 믿습니다. 우리는 이전에 ps-2PEF 데이터로부터 계산된 국소 피브릴 순서가 투과 전자 현미경7에서 파생된 정보와 상관관계가 있음을 보여주었다. 따라서 바이오 이미징에서 ps-2PEF의 타당성을 확인하고 아밀로이드 상부 구조의 구조적 순서에 대한 지식을 더욱 확장했습니다. 이 방법은 단백질 응집체(아밀로이드)의 자가형광과 같은 생물학적 시료의 다양한 구성 요소에서 관찰되는 고유 형광의 기원을 배우는 데 적용할 수 있습니다. 아밀로이드 피브릴의 장축에 대한 흡수/방출 쌍극자 모멘트 방향의 방향에 대한 관련 데이터가 주어지면, 피브릴의 광학적 특성은 구조와 상관될 수 있다6. 우리는 이미 결정된 Ψ 각도를 가진 구조의 경우, 이 기술을 통해 아밀로이드 상부구조의 뚜렷한 구조적 특징과 조직 수준에 따라 인슐린 상부구조의 다형체를 검출할 수 있음을 밝혔다7. 프로토콜에서 앞서 언급한 바와 같이, 제시된 설정은 편광에 민감한 2차 고조파 생성 측정에도 적용될 수 있으며, 이는 또한 표지가 없는 이광자 현미경 기술(24)이다. 이를 위해서는 상이한 광학 필터를 장착해야 할 뿐만 아니라 데이터 분석에 사용되는 공식을 변경해야한다 25. 더욱이, 적절하게 정렬된 쿼터 파장판을 추가하면, 원형 편광으로 샘플을 여기시키는 데 사용할 수 있으며, 이는 아밀로이드가 확인된 강한 카이르광학적 특성을 갖는 키랄 생체 고분자이기 때문에 아밀로이드의 키랄 비선형 광학 특성을 생성하도록 유도할 수 있다26. 그러나 이러한 경우 지속적으로 회전하는 전기 벡터는 여기 방출의 방향을 지속적으로 변화시키므로 이 원고에 제시된 방정식을 사용하여 구조 정보를 결정할 수 없습니다. 대체로 ps-2PEF는 단백질 응집체, DNA 또는 조직과 같은 비침습적 방식으로 정렬된 방출 쌍극자를 가진 수많은 복잡한 생물 구조 내에서 조직을 결정하기 위한 유망한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 폴란드 국립과학센터가 자금을 지원한 쏘나타 비스9 프로젝트(2019/34/E/ST5/00276)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
- Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
- Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
- Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
- De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
- Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
- Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
- Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
- Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
- Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
- Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
- Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
- Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
- Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
- Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
- Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
- Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
- de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
- Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
- Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
- Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).
