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Chemistry

Microscopía de dos fotones sensible a la polarización para una caracterización estructural amiloide sin marcadores

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65670
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

Summary

Este artículo describe cómo se podría aplicar la microscopía de dos fotones sensible a la polarización para caracterizar la organización local dentro de las superestructuras de amiloide sin marcado-esferulitas. También describe cómo preparar y medir la muestra, ensamblar la configuración requerida y analizar los datos para obtener información sobre la organización local de las fibrillas amiloides.

Abstract

En comparación con su contraparte de un fotón, la excitación de dos fotones es beneficiosa para los experimentos de bioimagen debido a su menor fototoxicidad, penetración más profunda en los tejidos, operación eficiente en sistemas densamente empaquetados y fotoselección angular reducida de fluoróforos. Por lo tanto, la introducción del análisis de polarización en la microscopía de fluorescencia de dos fotones (2PFM) proporciona una determinación más precisa de la organización molecular en una muestra en comparación con los métodos de imagen estándar basados en procesos ópticos lineales. En este trabajo, nos centramos en el 2PFM sensible a la polarización (ps-2PFM) y su aplicación en la determinación del ordenamiento molecular dentro de bioestructuras complejas-esferulitas amiloides. Las enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer o el Parkinson, a menudo se diagnostican a través de la detección de agregados de proteínas amiloides formados debido a un proceso alterado de plegamiento incorrecto de proteínas. Explorar su estructura conduce a una mejor comprensión de su vía de creación y, en consecuencia, al desarrollo de métodos de diagnóstico más sensibles. En este trabajo se presenta el ps-2PFM adaptado para la determinación del ordenamiento local de las fibrillas dentro de las esferulitas de insulina bovina y agregados proteicos amiloidogénicos esféricos. Además, comprobamos que la técnica propuesta puede resolver la organización tridimensional de las fibrillas dentro de la esferulita.

Introduction

En las últimas décadas, aunque ha habido un desarrollo significativo de numerosas técnicas de microscopía de fluorescencia para la bioimagen de proteínas y sus agregados1, solo unas pocas se han utilizado para resolver su ordenamiento local dentro de la muestra 2,3. Se utilizó la microscopía de fluorescencia4 para estudiar la heterogeneidad estructural intrínseca de las superestructuras amiloides-esferulitas. Además, la determinación cuantitativa del ordenamiento local dentro de bioestructuras complejas y densamente empaquetadas, como las esferulitas, podría resolverse utilizando métodos sensibles a la polarización3. Sin embargo, las técnicas de fluorescencia estándar con penetración superficial en el tejido son limitadas, ya que el uso de longitudes de onda UV-VIS para excitar fluoróforos in vivo conduce a una alta dispersión de la luz tisular5. Además, este tipo de imágenes a menudo requiere el diseño y la unión de sondas fluorescentes específicas a una biomolécula específica, lo que aumenta el costo y la cantidad de trabajo necesario para realizar las imágenes.

Recientemente, para abordar estos problemas, nuestro equipo ha adaptado la microscopía de fluorescencia excitada por dos fotones sensible a la polarización (ps-2PFM) para obtener imágenes sin marcadores de estructuras biológicas 6,7. Ps-2PFM permite medir la dependencia de la intensidad de fluorescencia de dos fotones en la dirección de polarización lineal del haz de excitación y el análisis de la polarización de la fluorescencia emitida8. La implementación de esta técnica requiere la suplementación de la ruta de excitación estándar de configuración de microscopio multifotónico (Figura 1) con una placa de media onda para controlar el plano de polarización de la luz. A continuación, se crean gráficos polares, que representan la dependencia de la intensidad de la fluorescencia excitada por dos fotones en la polarización del rayo láser de excitación, a partir de las señales recogidas por dos fotodiodos de avalancha, recogiendo así los dos componentes mutuamente perpendiculares de la polarización de la fluorescencia.

El último paso es el proceso de análisis de datos, teniendo en cuenta el impacto de los elementos ópticos, como espejos dicroicos o un objetivo de alta apertura numérica, sobre la polarización. Debido a la naturaleza del proceso de dos fotones, este método proporciona una fotoselección angular reducida y una resolución axial mejorada, ya que la excitación de dos fotones de los fluoróforos fuera del plano focal está probabilísticamente limitada. También se demostró que se podían implementar con éxito métodos similares para la obtención de imágenes in vivo de sondas de infrarrojo cercano (NIR) para la obtención de imágenes de tejidos profundos9. Ps-2PFM se ha aplicado previamente para obtener imágenes de fluoróforos en membranas celulares10 y ADN11,12, así como marcadores fluorescentes no estándar de sistemas biológicos, como las nanopartículas de oro13. Sin embargo, en todos estos ejemplos, la información sobre la organización de las biomoléculas se obtenía de forma indirecta y requería una orientación mutua predefinida entre un fluoróforo y una biomolécula.

En uno de nuestros artículos recientes, hemos demostrado que ps-2PFM podría aplicarse con éxito para determinar la polarización local de la autofluorescencia de las superestructuras de amiloide y la fluorescencia de la tioflavina T, un colorante específico de amiloide, unido a las fibrillas de amiloide en las esferulitas6. Además, en otro, hemos demostrado que ps-2PFM podría utilizarse para detectar la orientación de las fibrillas amiloides dentro de las esferulitas amiloides en un régimen de tamaño submicrónico, lo que se confirmó al correlacionarlo con imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)7. El logro de este resultado fue posible gracias a i) la autofluorescencia intrínseca de esferulitas-amiloides, cuando se excitan con uno o dos fotones, exhiben autofluorescencia intrínseca con máximos de emisión ubicados en un rango de 450 a 500 nm y secciones transversales de absorción de dos fotones comparables con los colorantes fluorescentes estándar14, ii) modelos matemáticos introducidos anteriormente para describir cómo se podría aplicar el ps-2PEF de colorantes que marcan membranas biológicas y estructuras de ADN a fluorescencia exhibida por esferulitas y colorantes unidos a ellas 8,11,15. Por lo tanto, antes de continuar con el análisis, recomendamos encarecidamente revisar la teoría requerida descrita tanto en el texto principal como en la información de apoyo de nuestro primer artículo sobre este tema6. Aquí, presentamos el protocolo de cómo aplicar la técnica ps-2PFM para una caracterización estructural amiloide libre de etiquetas de esferulitos de insulina bovina.

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Protocol

1. Preparación de los portaobjetos del microscopio con esferulitas adultas

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo. Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada (18,2 MΩ·cm a 25 °C) obtenida del sistema de purificación de agua.

  1. Incubar las esferulitas amiloides según el protocolo descrito por Krebs et al16. con algunas modificaciones, como se describe a continuación.
    1. Pesar 10 mg de insulina en polvo en un tubo de 1,5 ml.
    2. Disolver el polvo con una alícuota de 1 mL de la solución desionizada deH2O/HCl (pH 1,5).
    3. Selle la muestra con la cinta y colóquela en un mezclador térmico para incubar durante 24 h a 70 °C (0 rpm).
      NOTA: Para realizar la obtención de imágenes de los amiloides en su entorno nativo (es decir, hidratado) y evitar la deformación de la muestra debido a la deshidratación, es necesario preparar los portaobjetos del microscopio de acuerdo con la siguiente descripción (esquema que se muestra en la Figura 2).
  2. Lave bien el portaobjetos de vidrio del microscopio con agua.
  3. Sumerja los portaobjetos en metanol y déjelos secar en condiciones ambientales con una toallita sin polvo.
  4. Tome una alícuota de 100 μL de la solución de esferulita del tubo con una pipeta automática (paso 1.1.2) y agréguela al pocillo ubicado en el área central del portaobjetos del microscopio.
  5. Cubra la solución con un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas de aire.
  6. Deposite el montante a lo largo de los bordes del cubreobjetos en el portaobjetos con una pipeta automática para sellar la solución nativa de las esferulitas.
    NOTA: Es de gran importancia depositar el soporte de portaobjetos tanto en el cubreobjetos como en las superficies de los portaobjetos. Haga esto bajo la campana humeante debido a la toxicidad del solvente volátil (xileno). Vea el recuadro en la Figura 2.
  7. Deje la muestra del microscopio en condiciones ambientales para que el montante se endurezca.
    NOTA: El proceso de endurecimiento depende de la temperatura y la humedad, pero debe completarse dentro de las 12 horas.
  8. Compruebe si las esferulitas de insulina se formaron correctamente utilizando un microscopio óptico polarizado (POM) con polarizadores cruzados. Escanee la muestra en busca de un patrón característico de áreas brillantes, llamado cruz de Malta, como se muestra en la Figura 3.
    NOTA: Las esferulitas amiloides se pueden definir como superestructuras esféricas caracterizadas por una morfología heterogénea con una estructura núcleo-caparazón. En detalle, están compuestos por un núcleo amorfo y fibrillas amiloides de crecimiento radial16. Debido al carácter anisotrópico de las estructuras de esferulita, pueden interactuar distintivamente con la luz polarizada (por ejemplo, por refracción) y alterar su fase, lo que se puede observar fácilmente bajo POM con polarizadores cruzados. Este método se utilizó para estudiar solo esferulitas completamente desarrolladas caracterizadas por un patrón cruzado de malta similar a un modelo. En consecuencia, los agregados o las esferulitas estructuralmente distorsionadas se excluyeron de las investigaciones posteriores.

2. Construcción y alineación del sistema

NOTA: En la Figura 1 se puede encontrar una representación esquemática de un microscopio de dos fotones sensible a la polarización.

  1. Instale un láser de femtosegundo con la capacidad de sintonización de la longitud de onda de salida en el rango de 690-1.080 nm, por ejemplo, operando en un láser Ti: Zafiro de modo bloqueado con pulsos de ~100 fs de tasa de repetición de 80 MHz.
  2. Agregue una placa de media onda montada en una etapa de rotación a la ruta de excitación de la configuración para controlar la polarización de la luz incidente en el plano de muestra del microscopio XY.
  3. Instale el espejo dicroico para cortar el haz de excitación de la óptica de detección.
    NOTA: Las características ópticas de un espejo dicroico deben permitir reflejar el haz de excitación (a la muestra) en el rango de longitudes de onda NIR y ser simultáneamente transparentes para el rango de longitud de onda correspondiente a la emisión de las muestras.
  4. Instale una etapa de escaneo piezoeléctrico para escaneos ráster dentro del plano XY para un Z elegido.
  5. Monte el objetivo de inmersión de alta NA, por ejemplo, un objetivo de inmersión de aceite apocromático 100x/1.4 NA.
    NOTA: Como toda la configuración funciona en modo de epifluorescencia, las señales incidentes y emitidas pasan por el mismo objetivo.
  6. En la ruta de emisión, agregue un divisor de haz polarizador que divida la emisión excitada por dos fotones en dos componentes polarizados ortogonalmente (IX e IY)
  7. Instale dos fotodiodos de avalancha (APD) de conteo de fotones en una configuración que les permita recolectar la luz transferida y reflejada usando el divisor de haz, respectivamente (Figura 1).
  8. Monte filtros de corte correctos dependientes de la longitud de onda en la ruta de excitación y emisión del sistema, por ejemplo, un filtro de paso largo de 800 nm directamente en la ruta óptica de excitación y un filtro de paso corto de 700 en la ruta de emisión.
    NOTA: Analice los espectros de emisión de la esferulita de modo que se pueda excluir cualquier contribución potencial de la generación de segundos armónicos (SHG) o de la luz láser utilizando los filtros de emisión correctos. También vale la pena señalar que este sistema también debería permitir mediciones de SHG sensibles a la polarización, que podrían usarse para resolver el orden de las biomoléculas dentro de las muestras. Sin embargo, el análisis de los datos de la señal SHG difiere de la fluorescencia, que, con más detalle, fue descrita por Aït-Belkacem et al.17.
  9. Alinee todo el sistema (utilizando el modo de alineación integrado en muchos láseres) hasta que se recojan intensidades de señal similares utilizando ambos fotodiodos.
  10. Compruebe si el haz de excitación enfocado por el objetivo de NA alto y fotografiado en una cámara tiene una forma circular concéntrica como se presenta en la Figura 4A.
  11. Ajuste el tiempo de escaneo y la potencia correspondiente para minimizar el daño inducido por el láser incidente en la muestra. En la Figura 4B se presenta un ejemplo de quema puntual. Mida la potencia nominal utilizando un medidor de potencia portátil digital conectado a un sensor de potencia de fotodiodo ubicado en la entrada del cuerpo del microscopio.
    NOTA: Las muestras biológicas se pueden quemar fácilmente debido a la iluminación láser. En este caso, se encontró que el rango de potencia de 100 -900 μW (en el punto focal de la lente del objetivo) era un excelente equilibrio entre la estabilidad de la muestra y la emisión intensa.
  12. Antes de la medición de la muestra, pruebe la calidad de la alineación de la óptica con una muestra de referencia isotrópica (por ejemplo, fluoresceína incorporada en el polímero amorfo). Para realizar la comprobación de calibración, siga el procedimiento descrito en la sección 3 utilizando una referencia isotrópica en lugar de una muestra de amiloide.
    NOTA: Suponiendo que la configuración de la microscopía se ajusta idealmente para la muestra con propiedades isotrópicas, los dos componentes de emisión 2P (IX e IY) detectados con dos APD deben caracterizarse con la misma intensidad (Figura 4C).

3. Medición de las esferulitas de insulina bovina

NOTA: Para realizar todas las mediciones de ps-2PF descritas, se utilizó un software escrito a mano, que controla las posiciones de la platina piezoeléctrica y la placa de media onda y recoge la señal de ambos fotodiodos, lo que permite trazar los escaneos XY (escaneos de trama) de áreas seleccionadas en portaobjetos de microscopio, así como gráficos polares de coordenadas de muestra específicas. También se han añadido notas adicionales al protocolo, que permitirán a los usuarios realizar la medición sin él, ya que tanto la etapa piezoeléctrica como la etapa de rotación utilizadas para girar la placa de media onda podrían controlarse utilizando sus propios controladores o el software correspondiente. Aún así, se recomienda encarecidamente escribir un algoritmo que combine el ángulo de rotación de una placa de media onda con la intensidad de 2PEF recopilada con ambos fotodiodos, ya que esta correlación (gráficos polares) es crucial para un análisis adecuado de los datos que da como resultado información estructural.

  1. Monte la muestra con las esferulitas en la platina piezoeléctrica (inmovilice el portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva). Asegúrese de montarlo de manera que un lado delgado de vidrio (cubreobjetos) esté orientado hacia el objetivo, ya que los objetivos numéricos altos se caracterizan por distancias de trabajo relativamente cortas.
    NOTA: Como se utiliza la inmersión en aceite, se debe aplicar una pequeña gota de aceite mineral al objetivo antes de montar y enfocar la muestra.
  2. Al cambiar las posiciones XY y Z usando perillas de microscopio, enfoque el objetivo en una de las esferulitas que se encuentran en la solución, pero tenga en cuenta que debido a que los diámetros de las esferulitas suelen estar en el rango de decenas de μm, concéntrese dentro del área central de toda la estructura. Busque halos blancos y negros alrededor de la esferulita específica como signos de enfoque inferior y superior, respectivamente. Ajuste el eje "Z" para que esté entre estos extremos.
    NOTA: Es importante encontrar una muestra aislada sin defectos estructurales. Las esferulitas extremadamente pequeñas pueden desviarse debido a la tensión material introducida por el objetivo, mientras que las estructuras más grandes probablemente estén agregadas o altamente distorsionadas.
  3. Centre la esferulita en el campo de visión del plano microscópico observado y determine el tamaño del escaneo XY observando cuántos pasos de piezoetapa en las direcciones X e Y (que se muestran en el controlador de piezoetapa o en su software) se necesitan para cubrir el área de toda la estructura.
    NOTA: Se recomienda configurar el sistema de tal manera que el inicio del escaneo XY se ubique cerca de una de las esquinas de la esferulita y coincida con la posición cero de la platina (X e Y = 0)
  4. Ajuste los siguientes parámetros de escaneo:
    1. Ajuste la polarización del haz de excitación y gire la placa de media onda para obtener la polarización correspondiente a los ejes "X" e "Y" del plano de muestra del microscopio.
      NOTA: Esto se puede hacer midiendo los gráficos polares de un medio fluorescente isótropo como la fluoresceína. Para tales materiales, la intensidad máxima de fluorescencia es paralela a la polarización del haz de excitación; por lo tanto, al girar la placa de media onda se ajusta la polarización con los ejes X e Y en el plano de observación, también denotado como eje X e Y en los gráficos polares como en la Figura 4C. Los gráficos polares completos se pueden medir recopilando la intensidad medida de 2PEF en ambos fotodiodos para una rotación de 180° de la placa de media onda (rotación de 360° de la polarización de la luz de excitación) y correlacionando la intensidad con el ángulo de polarización de la luz de excitación. Podría hacerse manualmente, midiendo la intensidad de emisión para cada ángulo de media onda de la placa por separado y luego ensamblándolo en un gráfico polar en un software de análisis de datos o automáticamente, utilizando un software dedicado o autoescrito.
    2. Ajuste los parámetros de la piezoetapa: velocidad de escaneo, paso y rango para cubrir el área de toda la esferulita.
      NOTA: El rango de escaneo debe ser mayor que el diámetro de la esferulita para enmarcar completamente toda la superestructura dentro del escaneo ráster. La baja velocidad de escaneo y el paso permiten a los usuarios obtener imágenes de alta calidad; sin embargo, esto puede provocar la quema de la muestra. Por lo tanto, es necesario un compromiso que depende del tamaño de la esferulita. Estos parámetros no se pueden aplicar universalmente. Parámetros ejemplares utilizados en la Figura 5A: rango de escaneo 45 x 45 μm, paso de escaneo 1 μm y velocidad de escaneo 2 μm/s.
  5. Abra el obturador, encienda los fotodiodos y recoja Equation 1 Equation 2 los componentes de emisión 2P para cada paso del área de escaneo seleccionada, para el haz de excitación polarizado correspondientemente a los ejes X y luego a los ejes Y. En la Figura 5A se presentan ejemplos de escaneos ráster de autofluorescencia excitada por dos fotones (2PAF) de esferulitas de insulina.
    NOTA: La medición de escaneos ráster requiere correlacionar las coordenadas de la etapa piezoeléctrica con Equation 1 los Equation 2 componentes de emisión recopilados, lo que podría hacerse manualmente, midiendo la intensidad en cada punto del área seleccionada y luego ensamblándola en una matriz 2D, o automáticamente, a través de un software escrito por uno mismo. Los escaneos ráster se pueden presentar como una suma de la intensidad de los Equation 2 componentes de Equation 1 emisión o de forma distintiva para un componente de emisión específico. Como dependen en gran medida de la estructura, las distorsiones estructurales dentro de las esferulitas son fácilmente visibles. Sin embargo, debido al movimiento de la platina del microscopio, algunas muestras pueden desviarse del campo de visión. Por lo tanto, las imágenes deben examinarse en busca de artefactos. Es necesario verificar la posición de la esferulita antes y después de la exploración.
  6. Para realizar un análisis de polarización completo desde el punto específico de la muestra, apague el haz de excitación.
  7. Posteriormente, elija las coordenadas específicas de la piezoetapa correspondientes a la ubicación elegida en la esferulita donde se requiere la información sobre la orientación de las moléculas con la resolución inferior a μm.
  8. Ajuste la platina piezoeléctrica para centrar el campo de visión en el indicado (X, Y).
  9. Encienda el haz de excitación y realice un análisis completo (360°) de Equation 1 polarización y Equation 2 emisión encendiendo la rotación de la placa de media onda (rotación de 180°). Presente las componentes 2PF Ix e Iy en forma de gráfico polar (como se muestra en la Figura 5B).
    NOTA: Este paso se puede repetir en diferentes ubicaciones de la muestra para recopilar una cantidad suficiente de datos.

4. Determinación del ordenamiento local de las fibrillas en el interior de las esferulitas de insulina bovinas

NOTA: Todos los cálculos numéricos relacionados con el análisis de datos se realizaron utilizando el lenguaje de programación Python y se basaron en las funciones disponibles en las bibliotecas NumPy y SciPy. El trazado de los datos requiere la biblioteca Matplotlib. Todos los cálculos se basan en fórmulas presentadas en la información de apoyo en uno de los artículos de Obstarczyk et al.6.

  1. Simulando la intensidad de la fluorescencia de dos fotones excitada para la distribución especificada de moléculas con una dirección seleccionada de la polarización de la luz incidente (denotada por α)
    NOTA: Las fórmulas presentadas se basan en la suposición de momentos dipolares de absorción y emisión paralelos de un fluoróforo. Para una discusión de otros casos (por ejemplo, diferentes direcciones de los momentos dipolares de absorción y emisión, transferencia de energía entre los fluoróforos), véase el artículo de Le Floc'h et al8.
    1. Encuentre los parámetros que explican la variación del campo eléctrico por los efectos de mezcla de polarización y despolarización causados por el espejo dicroico montado en una configuración:
      1. γ representa el factor de amplitud entre la reflectividad Equation 3 y Equation 4 la luz polarizada de un espejo dicroico.
      2. δ representa el cambio de fase (elipticidad) entre Equation 3 la luz polarizada y Equation 4 la polarizada.
        NOTA: La definición correcta de estos dos parámetros es crucial para una caracterización estructural exitosa debido a su fuerte influencia en la forma de los gráficos polares medidos11,18. En el caso del sistema presentado, ambos parámetros se determinaron durante las mediciones elipsométricas de un espejo dicroico aplicado en un sistema.
    2. Calcule los vectores de campo eléctrico incidente que se propagan en los ejes X e Y de cada ángulo medido durante la medición ps-TPFM utilizando las ecuaciones (1-5).
      Equation 5 (1)
      Equation 6 (2)
      Equation 7 (3)
      Equation 8 (4)
      Equation 9 (5)
      NOTA Si la intensidad se mide en todo el 360° con el paso 1°, calcule los vectores de campo eléctrico para todos los 360°. Todos los ángulos deben estar en radianes. ρ está conectado a la frecuencia óptica ω del campo eléctrico simulado (ρ=ω·t) y se utiliza integrado de 0 a 2π durante los cálculos de los vectores de campo eléctrico incidente que se propagan en los ejes X e Y para cada ángulo α medido durante la medición ps-TPFM.
    3. Defina las funciones para los momentos dipolares de transición en direcciones de tres ejes de un sistema cartesiano de acuerdo con las ecuaciones (6-8):
      Equation 10 (6)
      Equation 11 (7)
      Equation 12 (8)
      NOTA: φ es el ángulo de orientación del eje largo de la fibrilla amiloide en el marco de muestra XY. Los ángulos θ y φ son los ángulos polares y acimutales utilizados para definir la orientación del momento dipolar de transición de un fluoróforo.
    4. Utilice las funciones definidas en el paso 4.1.3. definir funciones para Jx (Φ,θ,φ) y JY(Φ,θ,φ), que tienen en cuenta la contribución del enfoque de luz ajustada con un objetivo de apertura numérica alta a la detección de polarización de fluorescencia en las direcciones X e Y utilizando las ecuaciones (9, 10).
      Equation 13 (9)
      Equation 14 (10)
      NOTA: Los factores K1, K2, K3 están relacionados con el objetivo del microscopio utilizado durante la medición de ps-TPFM. En estos experimentos, se utilizó un objetivo de inmersión en aceite apocromático 100x/1.4 NA y los factores K1, K2, K3 fueron 2.945, 0.069 y 1.016, respectivamente.
    5. Defina una función para f(Ω), que es una distribución angular molecular, que depende de la mitad de la apertura de un cono de fluoróforo Ψ, con un espesor variable ΔΨ; Utilice la ecuación (11). La representación gráfica de los tres ángulos relativos a la fibrilla amiloide se presenta en la Figura 6.
      Equation 15(11)
      NOTA: Tenga cuidado al escribir el exponente: la potencia de 2 funciona en el argumento de la función, ¡no en toda la función!
    6. Defina todos los factores f WWIJKL como se muestra en las ecuaciones (12-21).
      Equation 16 (12)
      Equation 17 (13)
      Equation 18 (14)
      Equation 19 (15)
      Equation 20 (16)
      Equation 21 (17)
      Equation 22 (18)
      Equation 23 (19)
      Equation 24 (20)
      Equation 25 (21)
    7. Calcular las Equation 26 intensidades de fluorescencia excitada de dos fotones y Equation 27 para cada ángulo medido (de forma similar a como en el punto 4.1.2) utilizando las ecuaciones (22, 23).
      Equation 28Equation 29 = (22)
      Equation 30Equation 31 = (23)
    8. Compruebe si la simulación funciona correctamente utilizando los siguientes valores de variables (colocados en la leyenda de la Figura 7) y compare los resultados obtenidos con la Figura 7A-C.
      NOTA: Todos los grados deben escribirse en radianes.
  2. Ajuste las intensidades simuladas en la intensidad de la autofluorescencia excitada por dos fotones de las esferulitas de insulina bovinas recogidas durante las mediciones de ps-2PFM.
    NOTA: La resolución de la estructura de la esferulita basada en las mediciones de ps-2PFM requiere el uso de las ecuaciones escritas en el protocolo para simular la intensidad teórica de la fluorescencia excitada por dos fotones y el ajuste de todos los parámetros relacionados con el ordenamiento del fluoróforo molecular. Requiere múltiples iteraciones sobre los diversos valores de Φ, un ángulo que describe la rotación de la fibrilla en la muestra de microscopio XY, y ΔΨ, aberraciones de la distribución cónica del dipolo de emisión Ψ debido a las rotaciones moleculares en filamentos para Ψ fijo hasta alcanzar el coeficiente R2 más alto posible entre la intensidad de la señal de fluorescencia excitada de dos fotones normalizada recogida durante la medición y las intensidades normalizadas simuladas de acuerdo con Paso 4.1 del protocolo.
    1. Determina el semiángulo Ψ .
      NOTA: Para las esferulitas de insulina bovina, debe ser igual a Ψ = 29°6.
    2. Flujo de trabajo de ajuste:
      1. Elija el valor de Φ de 0° a 180° (en la Figura 8A y 8B Φ = 16° y 127°, respectivamente).
      2. Elija el valor de ΔΨ de 0° a 90° (en la Figura 8A, B, ΔΨ = 24° y 1°, respectivamente).
      3. Calcular Equation 28 (ecuación 22) y Equation 30(ecuación 23) para todo el rango medido de ángulos θ utilizando los valores elegidos de Φ y ΔΨ.
      4. Compare las intensidades calculadas durante las simulaciones (ambas normalizadas al valor máximo de
      5. Calcular Equation 28) con intensidades normalizadas de
      6. Calcule Equation 1 y Equation 2 (ambos normalizados al valor máximo de Equation 1) medido durante la medición de ps-2PFM.
        NOTA: En los experimentos presentados, los coeficientes de correlación producto-momento de Pearson se calcularon utilizando la función "corrcoef" de la biblioteca NumPy Python.
    3. Al final, elija los valores de Φ y ΔΨ que conduzcan a los coeficientes de correlación más altos y a la convergencia entre las intensidades simuladas y la señal medida, similar a lo que se muestra en la Figura 8.

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Representative Results

El protocolo presentado proporciona una guía paso a paso a través de la preparación de superestructuras amiloides para pruebas con ps-2PFM, la construcción del sistema microscópico y las mediciones de la muestra adecuada. Sin embargo, antes del conjunto final de mediciones, es vital alinear correctamente los APD con una referencia isotrópica, lo que debería dar como resultado la recopilación de una señal simétrica de forma e intensidad similares en ambos detectores (Figura 4C). Incluso las diferencias mínimas entre las intensidades medidas en los detectores en los ejes X e Y deben tenerse en cuenta en mediciones posteriores y, especialmente, durante el análisis como un factor de corrección apropiado. Después de montar, la muestra contiene esferulitas individuales, dando una cruz de Malta característica en el POM como en la Figura 2B, y después de realizar un escaneo de trama de 2PFM, la imagen debe verse similar a lo que se muestra en la Figura 5A, lo cual es consistente con los escaneos de trama de 2PFM reportados de esferulitas 6,7 y diferentes biomoléculas organizadas11,12. Se pueden observar algunos cambios en la ubicación del eje con el mayor brillo, lo que está relacionado con el hecho de que la intensidad de la señal de fluorescencia depende en gran medida de la polarización del haz de excitación. Por lo tanto, es necesario verificar qué posición de la placa de media onda corresponde a la excitación de la muestra a lo largo de los ejes X (Figura 5A, arriba) e Y (Figura 5A, abajo). También vale la pena señalar cómo cambian los gráficos polares al realizar un análisis completo de polarización desde diferentes puntos seleccionados. Fuera de la esferulita, el gráfico polar parece una colección de artefactos y picos de ruido de señal aleatorios (Figura 5B, I). Un gráfico de este tipo también puede indicar la deriva de la esferulita entre las mediciones y requerir la búsqueda de nuevas coordenadas de toda la estructura mediante otro escaneo ráster 2PF. En la Figura 5B II y III, respectivamente, se muestran gráficos polares medidos correctamente de ubicaciones altamente ordenadas de esferulita de insulina a lo largo de los ejes X e Y. Pueden tener diferentes formas y geometrías, dependiendo de la orientación local y la organización de los fluoróforos medidos desde el punto seleccionado7.

El último paso del protocolo se centra en el análisis de los datos obtenidos mediante un algoritmo basado en un modelo matemático que combina la orientación de las fibras amiloides en el plano XY Φ, los momentos dipolares transitorios de fluoróforos asociados Ψ y sus aberraciones ΔΨ (Figura 6) con intensidad Equation 1 y Equation 2 fluorescencia inducida por dos fotones. Las funciones correctamente implementadas presentadas en el protocolo deberían, después de introducir los datos de entrada apropiados (paso 4.9 del protocolo), producir gráficos polares idénticos a los presentados en la Figura 7. Cualquier desviación, diferente orientación de los datos, intensidades o formas de simulados Equation 26 e Equation 32indica errores en el código. Si el modelo funciona, se puede pasar al último paso del protocolo: ajustar los datos simulados a los datos reales obtenidos de la medición ps-2PFM. Los valores elegidos de Φ y ΔΨ con los coeficientes de correlación más altos y la convergencia entre las intensidades simuladas y la señal medida deben dar lugar a imágenes similares a las que se muestran en la Figura 8. Debe haber el mejor ajuste posible de Equation 26 y Equation 32 funciones a la orientación y forma general de Equation 1 y Equation 2 los valores de Φ y ΔΨ deben corresponder a la orientación local de las fibrillas y fluoróforos en el punto medido en la esferulita. También se podrían utilizar modelos y métodos de ajuste similares para la determinación de la organización local de otras biomoléculas como el ADN11.

Figure 1
Figura 1: Configuración de microscopía sensible a la polarización de dos fotones. Esquema que muestra la configuración del microscopio de dos fotones utilizada para las mediciones de fluorescencia excitada de dos fotones sensibles a la polarización de esferulitas de insulina bovina. Los componentes de emisión excitada de dos fotones polarizados horizontal y verticalmente (al plano de muestra del microscopio) se representan con IX e IY, respectivamente. Abreviaturas: SP = plano de muestra; O = objetivo; DM = espejo dicroico; λ/2 = placa de media onda; LPF = filtro de paso largo; BE = expansor de haz; P = polarizador gland; Ti: Sa = Titán: fuente de luz láser de zafiro; M = Espejo; SPF = filtro de paso corto; PBS = divisor de haz de polarización; L = lente óptica; APD = fotodiodo de avalancha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema que muestra la preparación de la diapositiva/foto. (A) Esquema que muestra la preparación de la muestra sellada; (B) fotografías de los pasos posteriores para el sellado de la muestra. I: una alícuota de 100 μL de la solución de esferulita en el portaobjetos de microscopía con un pocillo, II: cubreobjetos que se dejan caer sobre la solución; III: sello hermético formado a partir de polímero depositado (montante). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Control de calidad de las esferulitas de insulina bajo un microscopio de luz polarizada. (A1, B1) modo de campo claro, así como polarizadores cruzados (A2, B2). El patrón característico de la cruz de Malta se puede observar en las imágenes correspondientes tomadas con polarizadores cruzados. (A) Agregados de esferulitas con distorsiones estructurales, (B) esferulita aislada de alta calidad. Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Prueba de la alineación del sistema ps-2PFM. (A) Imagen concéntrica desenfocada de la fluorescencia de fluoresceína vista sin (A1) y con (A2) espejo dicroico, (B) esferulita fotodañada con agujeros quemados que surgen debido al análisis de polarización alargada en puntos seleccionados a lo largo de las direcciones x e y, (C) componentes de emisión excitados de dos fotones en función del ángulo de polarización de la luz incidente registrado para una muestra isótropa (solución de fluoresceína). y denotan los componentes de emisión medidos por fotodiodos de avalancha que miden los ejes de polarización de emisión X e Y, respectivamente. Barras de escala = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ejemplos de escaneos ráster 2PFM y gráficos polares de esferulita de insulina sin etiqueta. (A) Escaneos ráster de intensidad 2PF de esferulitas de insulina sin etiquetas: polarización de la luz de excitación: (A1) polarización horizontal, (A2) polarización vertical y emisión se indican con flechas blancas, y el recuadro muestra la misma esferulita fotografiada bajo un microscopio de luz polarizada estándar con polarizadores cruzados. (B) Gráficos polares derivados de tres puntos indicados en el escaneo A1 (B1, I; B2, II; B3, III). I, xe Iydenotan componentes de emisión medidos por fotodiodos de avalancha que miden los ejes de polarización de emisión X e Y, respectivamente. Abreviatura: 2PF = fluorescencia de dos fotones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Distribución cónica del dipolo de emisión del colorante (semiángulo, Ψ) con respecto al eje de fibrillas largas. La línea discontinua muestra el eje largo de las fibrillas. La rotación de la fibrilla en el plano de la muestra del microscopio XY se describe mediante el ángulo. Las aberraciones de Ψ debidas a las rotaciones moleculares en los filamentos se describen mediante ΔΨ. Esta figura es de Obstarczyk et al6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Intensidad simulada de fluorescencia excitada de dos fotones polarizados. Fluorescencia calculada para (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1°; b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Las líneas rojas, azules y amarillas corresponden a Equation 26, Equation 32, y Equation 26 + Equation 32, respectivamente. El ángulo Φ describe la rotación de la fibrilla en el plano de muestra del microscopio XY, la distribución cónica Ψ - del dipolo de emisión y las aberraciones ΔΨ de Ψ debidas a las rotaciones moleculares en los filamentos. Todos los demás parámetros fueron idénticos en todos los casos: K1 = 2,945, K2 = 0,069, K3 = 1,016, γ = 0,01 y δ = 0,98845. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Gráficos polares de conjuntos de datos experimentales. (A,B) Gráficos polares ejemplares después de ajustar dos conjuntos de datos experimentales recopilados durante las mediciones de ps-TPFM de esferulitas de insulina bovina. Los componentes de emisión excitados medidos Equation 1 y Equation 2 de dos fotones para los ejes de polarización de emisión X e Y se presentan con puntos rojos y azules, respectivamente; mientras que las líneas continuas presentan los componentes de emisión de fluorescencia excitada de dos fotones simulados correspondientes para los ejes Equation 26 de polarización de emisión X e Y y . Equation 32 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La microscopía de dos fotones sensible a la polarización es una herramienta valiosa para estudiar el orden local de las fibrillas dentro de las superestructuras amiloides, requiriendo solo pequeñas modificaciones de la configuración multifotónica estándar. Dado que opera en fenómenos ópticos no lineales, se puede lograr una fotoselección angular reducida y una resolución axial mejorada en comparación con los métodos de microscopía de fluorescencia excitada por un fotón. Además, conduce a una menor dispersión de la luz, menor fototoxicidad y una penetración más profunda de la muestra en comparación con las técnicas de microscopía de fluorescencia por excitación de un fotón19,20. Como ya hemos demostrado, es muy adecuado para mediciones de agregados densamente empaquetados de proteínas como las esferulitas, que se pueden realizar sin etiquetas21.

Sin embargo, para utilizar eficazmente el método descrito aquí, se debe prestar atención a varias cuestiones clave. Comenzando con la preparación de la muestra y su calidad, es decir, la incubación, asegúrese siempre de que las superestructuras de amiloide hayan crecido correctamente. En el caso de las esferulitas, utilizamos un microscopio óptico polarizado con polarizadores cruzados para localizar las esferulitas maduras, que dan un patrón de cruz maltés característico, y tienen un radio de ~5 μm16. Sin embargo, las esferulitas son heterogéneas y se pueden observar estructuras distintivas dentro de la muestra. Por lo tanto, es crucial elegir especies separadas y no distorsionadas. En cuanto al sistema de medición en sí, es crucial controlar la polarización de la luz incidente, de modo que se determine con precisión la polarización del haz a la entrada del cuerpo del microscopio y se minimice la despolarización introducida por los elementos ópticos utilizados22. Para garantizar el mejor rendimiento, recomendamos utilizar espejos plateados de alta calidad y filtros ópticos adaptados a las longitudes de onda de excitación y emisión de fluorescencia. Debido al papel clave de la polarización de la luz también en la trayectoria de emisión, es esencial medir una muestra de referencia isótropa antes de la medición real. Si la ruta de excitación y los detectores APD están alineados correctamente, se debería ver una señal igualmente intensa en ambos detectores, como se presenta en la Figura 4C. La referencia debe generar una fuerte fluorescencia excitada de dos fotones a una potencia láser relativamente baja para evitar el fotoblanqueo; Utilizamos fluoresceína, ya que sus secciones transversales de absorción de dos fotones para diferentes longitudes de onda ya estaban reportadas en la literatura23.

Para determinar correctamente la disposición de las estructuras dentro de las esferulitas, también se debe prestar mucha atención al análisis de datos. El supuesto básico de este modelo es la colinealidad del momento dipolar de transición de la absorción y emisión de luz. Bajo ese supuesto, alinear el momento dipolar de transición de la molécula paralelo a la polarización de la luz incidente permite su combinación con la estructura interna de la muestra analizada, produciendo la mayor intensidad de emisión. El modelo dado también se puede utilizar como una buena aproximación para pequeñas diferencias en el ángulo entre los dos momentos dipolares8 , pero requiere modificaciones adicionales para grandes desviaciones. Por lo tanto, como se ha descrito, algunos supuestos con respecto a la muestra deben tenerse en cuenta a priori para la obtención de imágenes y el análisis de datos. En el caso del modelo en el que se basan la simulación y las ecuaciones utilizadas en este método, la principal fuente de despolarización en el sistema es el espejo dicroico. Por lo tanto, antes de proceder con el análisis de los datos, es necesario determinar los parámetros responsables de la despolarización introducida por el espejo dicroico debido a su impacto en la forma de los gráficos polares recogidos y, en consecuencia, la correcta determinación de la organización de las moléculas dentro de la estructura examinada durante el ajuste18. Esto se convierte en un problema clave, especialmente en el caso de mediciones para varias longitudes de onda, ya que el cambio en la elipticidad del espejo dicroico es distintivamente dependiente de la longitud de onda12. La inducción de la despolarización puede afectar fuertemente las características de la señal recolectada11. Por último, pero no menos importante, al crear el script para el análisis de datos, se debe prestar atención al introducir funciones matemáticas y variables presentadas en la última parte del protocolo. Para evitar errores, concéntrese en características como la llamada a varias funciones y los parámetros globales, que también acelerarán significativamente el tiempo de análisis.

También debemos mencionar los problemas más comunes que se pueden encontrar al utilizar el método descrito. El tiempo de preparación de la muestra depende en gran medida de la velocidad de endurecimiento del montante. Para acelerar esto, recomendamos que las muestras se preparen en un lugar cálido y seco y que la solución de esferulita se selle antes de montarla en un microscopio. Las mediciones realizadas demasiado pronto pueden provocar el dessellado de la corredera y la destrucción de la lente del objetivo usada. Además, a pesar de la preparación adecuada de la muestra, las esferulitas pequeñas pueden flotar en la solución durante la medición debido a la tensión del material introducida por el objetivo. Para evitar esto, recomendamos escanear estructuras aisladas de tamaño medio, ya que las más grandes suelen ser agregados. Se recomienda comprobar si la esferulita escaneada se ha movido después de la adquisición de datos, en comparación con la imagen antes de comenzar la medición. Además, a pesar de la correcta alineación de todos los elementos ópticos y detectores utilizados para medir el ps-2PFM, las intensidades Equation 1 medidas y Equation 2 la referencia isotrópica pueden seguir difiriendo ligeramente en intensidad. En tal caso, es necesario tener esto en cuenta al analizar los datos de las mediciones de la muestra multiplicando una de las intensidades por el factor de corrección determinado durante las mediciones de referencia. Por último, pero no menos importante, es posible que durante el procedimiento de ajuste, el script no pueda encontrar ningún valor coincidente de Φ y ΔΨ. Esto puede deberse a varios factores: los datos se recopilaron de un punto desorganizado en una muestra, por ejemplo, el núcleo de una esferulita; la estructura estudiada no estaba completamente formada durante la incubación; simulación incorrecta de Equation 26 y Equation 32; uso de parámetros de espejo dicroico incorrectos γ y δ; Conjunto de pasos demasiado grande para los ángulos Φ y ΔΨ entre cada iteración durante el ajuste. En el caso de un punto desorganizado, recomendamos tratar de recopilar datos de puntos que se encuentran más cerca del perímetro de la estructura examinada. En el caso de una estructura incompleta, repita la incubación o busque otras estructuras en el portaobjetos. En el caso de simulaciones incorrectas, compruebe manualmente si cambiando los parámetros Φ, Ψ y ΔΨ, las intensidades Equation 26 simuladas y Equation 32 cambie y corrija cualquier error en el código. En el caso de que los parámetros del espejo dicroico sean incorrectos, compruebe cuidadosamente los parámetros γ y δ del espejo dicroico utilizado durante las mediciones. En el caso de un escalón grande establecido para los ángulos durante el ajuste, reduzca el paso entre iteraciones sucesivas a 2º o 1º. También debe recordarse que en el caso de una fuerte desorganización local de la estructura, R2 siempre será menor, a menudo en el rango de 0,5 a 0,6. Esto se debe a que el modelo presentado describe moléculas altamente ordenadas donde la mayoría de los momentos dipolares transitorios están alineados en una dirección similar; Por lo tanto, la coincidencia de estructuras amorfas o altamente desordenadas conduce a coeficientes de correlación más bajos. Por lo tanto, es crucial poseer al menos cierta información estructural de la muestra antes de la medición para analizar correctamente los datos obtenidos.

También vale la pena señalar que el método presentado posee varias limitaciones. El análisis de datos podría dar como resultado varios valores de ángulos Φ y ΔΨ con factores de correlación lo suficientemente altos, lo que requiere que el experimentador utilice su conocimiento y experiencia para seleccionar los valores apropiados. En este caso, se deben tener en cuenta las condiciones de contorno, como que el semiángulo del cono de fluoróforo Ψ siempre debe ser mayor que su aberración ΔΨ. Además, al comparar nuestros datos con la literatura, vale la pena señalar que algunos artículos describen Ψ como un ángulo de cono completo, mientras que nosotros operamos en un ángulo de medio cono. Otra limitación es la resolución de medición, limitada a una resolución submicrónica. Debido a eso, la fotoselectividad del sistema y la determinación de la organización local resultante se basan en la señal promediada de las fibrillas excitadas en el punto focal en lugar de estructuras individuales. Además, la muestra en sí debe poseer un rendimiento cuántico de fluorescencia suficiente, ya que una exposición prolongada bajo la potencia del láser incidente fs (necesaria para adquirir datos para gráficos polares) puede ser destructiva y afectar los resultados.

A pesar de estas dificultades, creemos que el método presentado en este trabajo tiene una amplia gama de aplicaciones, para la obtención de imágenes basadas en etiquetas y sin etiquetas de bioestructuras en entornos hidratados y complejos. Previamente habíamos demostrado que el ordenamiento local de las fibrillas calculado a partir de los datos de ps-2PEF se correlaciona con la información derivada de la microscopía electrónica de transmisión7. Por lo tanto, confirmamos la validez de ps-2PEF en bioimagen y ampliamos aún más el conocimiento sobre el ordenamiento estructural de las superestructuras amiloides. Este método se puede aplicar para conocer el origen de la fluorescencia intrínseca observada en el caso de varios componentes de muestras biológicas, como la autofluorescencia de agregados proteicos (amiloides). Dados los datos relevantes sobre la orientación de las direcciones del momento dipolar de absorción/emisión con respecto al eje largo de las fibrillas amiloides, las propiedades ópticas de las fibrillas pueden correlacionarse con su estructura6. Indicamos que para estructuras con un ángulo Ψ ya determinado, esta técnica permite la detección de características estructurales distintivas de las superestructuras amiloides y polimorfos de las superestructuras de insulina en función del nivel de su organización7. Como se señaló anteriormente en el protocolo, la configuración presentada también podría aplicarse para mediciones de generación de segundos armónicos sensibles a la polarización, que también es una técnica de microscopía de dos fotones sin etiquetas24. Esto requerirá no solo montar diferentes filtros ópticos, sino también cambiar las fórmulas utilizadas para el análisis de datos25. Además, con la adición de una placa de cuarto de onda correctamente alineada, podría utilizarse para excitar la muestra con luz polarizada circularmente, lo que podría conducir a la generación de propiedades ópticas quirales no lineales de los amiloides, ya que son biopolímeros quirales con fuertes propiedades quirópticas confirmadas26. Sin embargo, en tal caso, el vector eléctrico en constante rotación conduciría a la dirección constantemente cambiante de la emisión excitada, lo que haría imposible determinar cualquier información estructural utilizando las ecuaciones presentadas en este manuscrito. En definitiva, ps-2PEF es una herramienta prometedora para la determinación de la organización dentro de numerosas bioestructuras complejas con dipolos de emisión ordenados, como agregados de proteínas, ADN o tejidos, de forma no invasiva.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo del proyecto Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) financiado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm Chemland 04-298.202.04
DPX mountant for histology Sigma-Aldrich 6522 Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene Chemland 02-63102
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system Hydrolab Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), Sigma-Aldrich 30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) Sigma-Aldrich I5500
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm Chemland 04-296.202.09
Olympus BX60 Olympus Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 Chemland VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes  ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm  Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA Nikon
piezo 3D stage Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs
Software
LabView 2018 National Instruments Version 18.0.1f2
Matplotlib library Version 3.3.2
NumPy library Version 1.19.2
SciPy library Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE Version 4.1.5

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References

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