Summary
Hier presenteren we een protocol voor een geautomatiseerd celkweeksysteem. Dit geautomatiseerde kweeksysteem vermindert arbeid en komt ten goede aan de gebruikers, waaronder onderzoekers die niet bekend zijn met het hanteren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS), van het onderhoud van iPS-cellen tot differentiatie in verschillende soorten cellen.
Abstract
Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) met een oneindig zelfprolifererend vermogen wordt verwacht dat ze toepassingen hebben op tal van gebieden, waaronder de opheldering van zeldzame ziektepathologieën, de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde die gericht is op het herstellen van beschadigde organen. Desondanks is de maatschappelijke implementatie van hiPSC's nog steeds beperkt. Dit is deels te wijten aan de moeilijkheid om differentiatie in cultuur te reproduceren, zelfs met geavanceerde kennis en geavanceerde technische vaardigheden, vanwege de hoge gevoeligheid van iPSC's voor minieme veranderingen in de omgeving. De toepassing van een geautomatiseerd kweeksysteem kan dit probleem oplossen. Experimenten met een hoge reproduceerbaarheid, onafhankelijk van de vaardigheden van een onderzoeker, kunnen worden verwacht volgens een gedeelde procedure tussen verschillende instituten. Hoewel er eerder verschillende geautomatiseerde kweeksystemen zijn ontwikkeld die iPSC-culturen kunnen handhaven en differentiatie kunnen induceren, zijn deze systemen zwaar, groot en kostbaar omdat ze gebruik maken van gehumaniseerde, meervoudig gearticuleerde robotarmen. Om de bovenstaande problemen te verbeteren, hebben we een nieuw systeem ontwikkeld met behulp van een eenvoudig x-y-z as schuifrailsysteem, waardoor het compacter, lichter en goedkoper kan zijn. Bovendien kan de gebruiker in het nieuwe systeem eenvoudig parameters wijzigen om nieuwe afhandelingstaken te ontwikkelen. Zodra een taak is vastgesteld, hoeft de gebruiker alleen nog maar de iPSC voor te bereiden, de reagentia en verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gewenste taak van tevoren te leveren, het taaknummer te selecteren en de tijd op te geven. We bevestigden dat het systeem iPSC's in een ongedifferentieerde toestand kon houden door verschillende passages zonder voedingscellen en differentiëren in verschillende celtypen, waaronder cardiomyocyten, hepatocyten, neurale voorlopercellen en keratinocyten. Het systeem zal zeer reproduceerbare experimenten tussen instellingen mogelijk maken zonder dat er geschoolde onderzoekers nodig zijn, en zal de sociale implementatie van hiPSC's in een breder scala van onderzoeksgebieden vergemakkelijken door de belemmeringen voor nieuwe inzendingen te verminderen.
Introduction
Dit artikel heeft tot doel actuele en gedetailleerde behandelingsprocedures te bieden voor een geautomatiseerd kweeksysteem voor door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), dat we hebben geproduceerd in samenwerking met een bedrijf, en om representatieve resultaten te laten zien.
Sinds de publicatie van het artikel in 2007 trekt iPSC wereldwijd de aandacht1. Vanwege de grootste eigenschap dat het in staat is om te differentiëren in elk type somatische cel, wordt verwacht dat het zal worden toegepast op verschillende gebieden, zoals regeneratieve geneeskunde, het ophelderen van de oorzaken van hardnekkige ziekten en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische geneesmiddelen 2,3. Bovendien zou het gebruik van menselijke iPSC-afgeleide somatische cellen dierproeven kunnen verminderen, die onderworpen zijn aan aanzienlijke ethische beperkingen. Hoewel er voortdurend tal van homogene iPSC's nodig zijn om nieuwe methoden met iPSC's te onderzoeken, is het te omslachtig om ze te beheren. Bovendien is het hanteren van iPSC moeilijk vanwege de hoge gevoeligheid, zelfs voor subtiele culturele en omgevingsveranderingen.
Om dit probleem op te lossen, wordt van geautomatiseerde kweeksystemen verwacht dat ze taken uitvoeren in plaats van mensen. Sommige groepen hebben een paar geautomatiseerde menselijke pluripotente stamcelkweeksystemen ontwikkeld voor celonderhoud en -differentiatie en hun prestaties gepubliceerd 4,5,6. Deze systemen zijn uitgerust met multi-gelede robotarm(en). Robotarmen hebben niet alleen de verdienste dat ze menselijke armbewegingen sterk nabootsen, maar ook omdat ze hogere kosten voor de arm(en), grotere en zwaardere systeemverpakkingen en tijdrovende onderwijsinspanningen van de ingenieurs vereisen om de beoogde bewegingente verkrijgen 7,8. Om het gemakkelijker te maken om het apparaat te introduceren in meer onderzoeksfaciliteiten op de punten van economisch, ruimte- en personeelsverbruik, hebben we een nieuw geautomatiseerd kweeksysteem ontwikkeld voor het onderhoud en de differentiatie van iPSC in verschillende celtypen9.
Onze reden voor het nieuwe systeem was om een X-Y-Z-asrailsysteem te gebruiken in plaats van meervoudig gelede robotarmen9. Om de complexe handachtige functies van robotarmen te vervangen, hebben we een nieuw idee toegepast op dit systeem, dat automatisch drie soorten specifieke functionele armuiteinden kan veranderen. Hier geven we ook aan hoe gebruikers gemakkelijk taakschema's kunnen maken met eenvoudige bestellingen op software vanwege het ontbreken van vereisten voor de bijdragen van ingenieurs gedurende het hele proces.
Een van de robotkweeksystemen heeft het maken van embryoïde lichamen gedemonstreerd met behulp van platen met 96 putjes als 3D-celaggregaten voor differentiatie4. Het hier gerapporteerde systeem kan geen platen met 96 putjes verwerken. Men bereikte de huidige good manufacturing practice (cGMP)-graad met behulp van een cellijn, hoewel het geen menselijke pluripotente stamcel was5. Het hier beschreven geautomatiseerde kweeksysteem is nu ontwikkeld met het specifieke doel om laboratoriumexperimenten te ondersteunen (figuur 1). Het heeft echter voldoende systemen om een schoon niveau te behouden dat gelijk is aan een veiligheidskast van niveau IV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De ethische commissie van de Kansai Medical University keurde de generatie en het gebruik goed van de gezonde, van vrijwilligers afgeleide iPSC's genaamd KMUR001 (goedkeuring nr. 2020197). De donor, die openlijk werd gerekruteerd, gaf formele geïnformeerde toestemming en stemde in met het wetenschappelijke gebruik van de cellen.
OPMERKING: De huidige interface (de speciale software met de naam "ccssHMI" die draait onder het Windows XP-besturingssysteem) is het fundamentele bedieningsscherm. Onder de bovengenoemde interface is een reeks tabbladen gerangschikt, waardoor gebruikers verschillende bewerkingen kunnen starten.
1. Laden
- Klik op de knop Laden op het bovenste scherm van de software. Klik op de knop Voorbereiding laden Start .
- Plaats de schaal(en) of bord(en) die in het apparaat moeten worden geplaatst in het apparaat.
NOTITIE: De nodige informatie voor de identificatie van het gerecht moet op elk deksel worden geschreven. - Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
- Selecteer het type en de hoeveelheid gerecht(en) of bord(en) in de software.
- Klik op de knop Voorbereiding laden voltooid . Klik op de knop Start laden .
- Nadat een schotel in het systeem is geüpload, selecteert u de informatie op de schotel, zoals met iPS-cellen of zonder iPS-cellen, in de software. Registreer notities over elk gerecht in de software.
- Klik op de knop Registratie aan het einde om het laden te voltooien.
2. Lossen
- Klik op de knop Verwijderen op het bovenste scherm van de software. Selecteer de schotel(s) die u wilt verwijderen in de software.
- Nadat u de schotel(s) hebt geselecteerd, klikt u op de knop Voorbereiding van het lossen Start . Klik op de knop Start lossen van het lossen .
- Nadat de schaal(en) van de broedmachine naar de werkbank in het systeem zijn overgebracht, drukt u op de knop Schotel verwijderen .
- Open handmatig het schuifraam aan de voorkant en haal de schaal(en) eruit. Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
3. Aanvulling van verbruiksartikelen: pipetten, buisjes en medium
- Om verbruiksartikelen zoals pipetten, buisjes en medium bij te vullen, klikt u op de knop Verbruiksartikelen op het bovenste scherm van de software en selecteert u vervolgens het item dat moet worden bijgevuld.
- Pipettes
- Klik op de knop Pipet. Selecteer de knop Aanvullen.
- Selecteer een rek dat de gebruiker in de software wil aanvullen. Klik op de knop Start aanvullen .
- Nadat u hebt gecontroleerd of het deksel van de pipetopslag op de werkbank is geopend, opent u handmatig het schuifvenster aan de voorkant en vult u de pipetten indien nodig bij.
- Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop. Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Klik op de knop Aanvulling instellen en voer de informatie voor de aanvulling in en klik vervolgens op de knop Registratie .
- Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Buizen
- Klik op de knop Tube. Selecteer de knop Aanvullen.
- Selecteer een rek dat de gebruiker in de software wil aanvullen. Klik op de knop Start aanvullen .
- Nadat u hebt bevestigd dat het rek naar boven is verplaatst, klikt u op de knop Tube aanvullen .
- Open handmatig het schuifraam aan de voorkant en vul de buizen indien nodig bij.
- Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
- Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Klik op de knop Aanvulling instellen en voer de informatie voor de aanvulling in en klik vervolgens op de knop Registratie . Klik op de knop Sluiten .
- Gemiddeld
- Klik op de knop Gemiddeld . Selecteer de knop Aanvullen in de software.
- Selecteer een rek uit drie rekken die gebruikers willen aanvullen. Klik op de knop Start aanvullen .
- Nadat u hebt gecontroleerd of het deksel van de mediumopslagruimte is geopend, opent u handmatig het schuifvenster aan de voorkant en vult u het medium bij.
- Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
- Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Klik op de knop Aanvullen en voer de informatie voor het medium in, inclusief de naam en de hoeveelheid van het medium. Voer indien nodig aanvullende opmerkingen in.
- Klik op de knop Registratie .
- Klik op de knop Sluiten .
- Pipettes
4. Taak selectie
- Klik op de knop Taak op het bovenste scherm van de software.
- Selecteer de knop Taakinstelling . Selecteer de gewenste taak in de takenlijst en klik op de knop Volgende stap .
- Geef de datum en tijd op om de taak uit te voeren en klik vervolgens op de knop Registratie . Selecteer een gerecht of bord om de taak uit te voeren en klik vervolgens op de knop Registratie .
- Nadat u de geselecteerde taak opnieuw hebt bevestigd, klikt u op de knop Registratie . Bevestig op het volgende scherm dat de taak is geregistreerd.
- Stel indien nodig de volgende taak op dezelfde manier in.
- Klik op de Start-knop aan het einde. Vervolgens start de taak automatisch op de opgegeven datum en tijd.
NOTITIE: Onmiddellijk na het voltooien van elke taak gaan UV-lampen (die zich aan twee zijden van de kap bevinden) automatisch aan en na 5-30 minuten, in overeenstemming met de hulpinstelling, worden ze uitgeschakeld om de kap in aseptische toestand te houden. Om te stoppen, kunnen gebruikers op de knop Start klikken. - Als gebruikers een geplande taak van tevoren willen annuleren, klikt u op de knop Stoppen .
- Nadat u de taak hebt geselecteerd die u wilt afbreken, klikt u op de knop Taak bewerken .
- Klik op de knop Taak annuleren . Bevestig op het volgende scherm dat de taak is verwijderd.
5. Controleer mobiele afbeeldingen
- Elke taak omvat microscopische observaties (foto's maken) voor en na het taakwerk. Observeer de voortgang van celkweek fotografisch door voor of na elke taak een microscopische fotografietaak op te nemen.
- Selecteer vooraf ingestelde taakprogramma's, waaronder het vooraf selecteren van meerdere specifieke locaties van de schotel of de putplaat voor observatie op een vast punt om dezelfde locatie in de loop van de tijd te bewaken.
6. Passeren en differentiatie
- Volg de stappen in secties 1-5 en stel het geautomatiseerde celkweeksysteem in om passaging en differentiatie uit te voeren. De instrumentinstellingen voor passaging, cardiomyocytendifferentiatie, hepatocytendifferentiatie, neurale voorloperceldifferentiatie en keratinocytendifferentiatie worden weergegeven in respectievelijk tabel 1, tabel 2, tabel 3, tabel 4 en tabel 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onderhoud van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen
We gebruikten drie hPSC-lijnen (RIKEN-2F, 253G1 en KMUR001). We hebben het onderhoudsprotocol geoptimaliseerd door middel van dagelijks handmatig uitgevoerde experimenten en de gedetailleerde programma's verder geoptimaliseerd door de zeven voorbereidende experimenten die door het systeem zijn uitgevoerd. Schuifspanningen die worden veroorzaakt door de vloeistofsnelheden van de spuugstroom van verschillende pipetten die door mensen worden gehanteerd en het systeem zijn bijvoorbeeld heel verschillend; Daarom hebben we de tijdsduur van de enzymatische vertering en het aantal pipetterijen geoptimaliseerd voor celdispersie door het systeem.
Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen werden bewaard op een schaal van 10 cm bedekt met 0,5 μg/cm2 celkweekmatrix met hiPSC-kweekmedium (bijv. Neutristem of StemFit AK02N). Voor doorgang werd het systeem geprogrammeerd om hiPSC driemaal te wassen met 5 ml fosfaatbufferzoutoplossing zonder calcium (PBS[-]), en vervolgens te behandelen met 3 ml TrypLE express-enzym aangevuld met 10 μM van de Rho-kinaseremmer (Y-27632) gedurende 15 minuten bij 37 °C. Daarna voegde het systeem 9 ml PBS(-) met 0,15% runderserumalbuminefractie V (BSA) toe aan de plaat en voerde twee bewegingsreeksen uit waarbij 10 ml celbevattende vloeistof werd opgezogen en de vloeistof uit de pipetpunt in een zigzagbeweging over de bovenkant van de plaat werd gedoseerd, die 20° dichter bij het plaatoppervlak was gekanteld, en herhaalde de bovenstaande reeks handelingen met de plaat aan de andere kant 20° gekanteld. Vervolgens verzamelde het systeem het celbevattende medium in een buis van 15 ml en sloot het af, waarna het gedurende 5 minuten bij 115 x g werd gecentrifugeerd om de cellen af te zetten. Daarna zoog het systeem het supernatans op en dispergeerde de celpellet in afzonderlijke cellen met behulp van 10 ml kweekmedium met 10 μM Y-27632 door 10 keer te pipetteren. Het systeem bracht 1 ml trypanblauwe oplossing over in een nieuwe buis van 15 ml, voegde vervolgens 1 ml van de celsuspensie toe en mengde ze vijf keer door te pipetteren. Daarna werd 100 μL van de Trypan blauwgekleurde celoplossing opgezogen en gedoseerd in het inlaatvenster van de wegwerphemocytometer in de houder. Het systeem verplaatste de hemocytometerhouder naar het microscopische observatiegebied en maakte een foto, die onmiddellijk door software werd geanalyseerd en de verkregen celconcentratie werd toegepast op de volgende stap. Voor iPSC-onderhoud zaaide het systeem de cellen met een celdichtheid van 15.000 cellen/cm2 in nieuwe plastic platen met een diameter van 10 cm, gecoat met een celcultuurmatrix van 0,5 μg/cm2 . Voor differentiatie-experimenten zaaide het systeem de cellen met de vereiste celdichtheid in het medium dat voor elk somatisch celtype was bereid in platen met 6 putjes bedekt met een celkweekmatrix verdund tot 1/100. Ten slotte voerde het systeem vijf keer kruisvergrendeling uit voordat de platen naar de couveuse werden overgebracht. Drie nieuwe platen van 10 cm met iPSC's en drie platen met celkweekmatrixcoating werden in het systeem geladen en andere noodzakelijke items werden ook voorbereid volgens de respectieve hierboven genoemde procedures. Een cyclus van onderhoudscultuur bestaat uit een passaging-taak op dag 1, gevolgd door een cultuurmediumverandering eenmaal per dag gedurende 3 dagen. Gedurende het hele experiment werd deze cyclus opgezet voor vijf cycli. Bovendien werden verbruiksartikelen op hun beurt aangevuld.
Volgens het bestelde schema werden vijf cycli van onderhoudscultuur met succes uitgevoerd zoals gepland door het systeem. Aan de hand van de celfoto's die tijdens elke taak automatisch werden gemaakt, werd bevestigd dat de cellen zich in de loop van de tijd soepel verspreidden. De celexpansie (n = 3) werd berekend en weergegeven in figuur 2. Om te bevestigen of de ongedifferentieerde toestand van iPSC's onveranderd blijft, zelfs na onderhoudskweek in het geautomatiseerde kweeksysteem, werd immunocytometorische analyse (Oct3/4 en SSEA4) uitgevoerd met behulp van de resterende monsters bij elke passaging (Figuur 3A). Bovendien werden na vijf cycli de drie schotels uit het systeem gelost en werd ook immunohistochemische analyse (Oct3/4, SSEA4 en Tra1-81) uitgevoerd (Figuur 3B). Beide analyses met fluorescerende immunokleuring toonden aan dat de ongedifferentieerde toestand van iPS-cellen behouden bleef. Karyotypering van iPSC's werd ook uitgevoerd voor en na de onderhoudscultuur in een geautomatiseerd kweeksysteem. Hoewel er een afwijking werd waargenomen in een allel van chromosoom 17 vóór de start van de onderhoudscultuur, werd er geen specifieke verandering waargenomen door het systeem na 5 onderhoudsculturen, inclusief de afwijking (Figuur 3C). De instellingen die worden gebruikt voor het onderhoud van iPSC's zijn samengevat in tabel 1.
Differentiatie
Cardiomyocyten
Het differentiatieprotocol uit een eerdere publicatie werd hier gevolgd10. Het systeem zaaide ongedifferentieerde hiPSC's (KMUR001) met een dichtheid van 30.000 cellen/cm2 op celkweekmatrix-gecoate 6-putplaten in hiPSC-kweekmedium aangevuld met 10 μM Y-27632. Het systeem veranderde het medium in humaan pluripotent stamcelmedium met 6 μM van de GSK-3ß-remmer CHIR-99021, 20 ng/ml Activine A en 10 ng/ml BMP4 na 3 dagen (differentiatiedag 1). Op differentiatiedag 3 schakelde het systeem over op CDM3-medium: RPMI 1640, 500 μg/ml recombinant humaan albumine en 213 μg/ml L-ascorbinezuur-2-fosfaat met 2 μM Wnt-C59. Op differentiatiedag 5 is het systeem overgestapt op vers CDM3-medium; daarna werd om de dag herhaald dat het overstapte op vers CDM3-medium. De instellingen die worden gebruikt voor de differentiatie van cardiomyocyten van iPSC's zijn samengevat in tabel 2.
Hepatocyten
Het differentiatieprotocol uit een eerdere publicatie werd hier gevolgd11. Het systeem zaaide ongedifferentieerde hiPSC's (RIKEN2F) met een dichtheid van 25.000 cellen/cm2 op celkweekmatrix-gecoate 6-putplaten in hiPSC-kweekmedium aangevuld met 10 μM Y-27632. Na 2 dagen (differentiatiedag 1) veranderde het systeem het medium in RPMI-1640 plus 2% B27 minus insuline (RPMI-B27) met 100 ng/ml Activine A, 6 μM CHIR-99021 en 1% glutaminesupplement (bijv. GlutaMAX) gedurende 24 uur. Op differentiatiedag 2 veranderden we het medium in RPMI-B27 met 50 ng/ml Activine A. Op differentiatiedag 5 veranderde het systeem het medium in RPMI-B27, met 1% glutaminesupplement en 10 ng/ml BMP-4. Op differentiatiedag 9 veranderde het systeem het medium in hepatocytrijpingsmedium: Leibovitz's L-15-medium met 8,3% tryptosefosfaatbouillon, 10 μM hydrocortison 21-hemisuccinaat, 50 μg/ml natrium-L-ascorbaat, 100 nM dexamethason, 0,58% insuline-transferrine-selenium, 2 mM glutaminesupplement, 8,3% foetaal runderserum en 100 nM rac-1,2-dihexadecylglycerol. Daarna herhaalde het systeem om de dag het medium te veranderen in een vers medium. De instellingen die worden gebruikt voor hepatocytdifferentiatie van iPSC's zijn samengevat in tabel 3.
Neuronale voorlopercellen
Het differentiatieprotocol uit een eerdere publicatie werd hier gevolgd12. Het systeem zaaide ongedifferentieerde hiPSC's (RIKEN2F) met een dichtheid van 25.000 cellen/cm2 op basaalmembraanmatrix-gecoate 6-wells platen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM)/F12 en neurobasaal medium (1:1) aangevuld met 10% knock-outserumvervanging, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM glutaminesupplement met 10 μM TGF-bètareceptorremmer (SB431542), 10 μM BMP-signaalremmer (dorsomorfine), en 10 μM Y-27632 (differentiatie dag 1). Op differentiatiedag 5 veranderde het systeem het medium in DMEM/F12 en Neurobasal medium 1:1 aangevuld met 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM glutaminesupplement, 1% N-2 supplement, 1% B-27 supplement, 50 μg/ml ascorbinezuur 2-fosfaat, 10 μM SB431542 en 10 μM dorsomorfine. Op differentiatiedag 9 veranderde het systeem het medium in DMEM/F12 en neurobasaal medium 1:1 aangevuld met 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM glutaminesupplement, 1% N-2-supplement, 1% B-27-supplement, 50 μg/ml ascorbinezuur-2-fosfaat en 1 μM all-trans-retinoïnezuur. Op differentiatiedag 13-16 veranderde het systeem het medium elke dag met DMEM/F12 en neurobasaal medium 1:1 aangevuld met 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM glutaminesupplement, 1% N-2-supplement, 1% B-27-supplement, 50 μg/ml ascorbinezuur-2-fosfaat en 10 ng/ml bFGF en 10 ng/ml EGF. De instellingen die worden gebruikt voor neurale voorloperceldifferentiatie van iPSC's zijn samengevat in tabel 4.
Keratinocyten
Het differentiatieprotocol uit een eerdere publicatie werd hier gevolgd13. Het systeem zaaide ongedifferentieerde hiPSC's (253G1) met een dichtheid van 15.000 cellen/cm2 in celkweekmatrix-gecoate 6-puts platen in hiPSC-kweekmedium met 10 μM Y-27632. Na 2 dagen later (differentiatiedag 1) veranderde het systeem het medium in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM)/F12 en Neurobasal-medium (1:1) met 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM glutamine, 55 μM 2-mercaptoethanol, 1% N-2-supplement, 2% B-27-supplement, 50 μg/ml ascorbinezuur-2-fosfaat, 0,05% runderserumalbumine en 100 ng/ml FGF-basisch. Op differentiatiedag 3, en daarna, werd het medium veranderd in humaan keratinocytenmedium (zonder supplement voor dag 3 en met een supplement op/na dag 5) met toevoeging van 0,5 μg/ml hydrocortison, 1 μM all-trans-retinoïnezuur, 25 ng/ml hBMP-4, 2,4 μg/ml adenine, 1,37 ng/ml triiodothyronine, 0,3 mM ascorbinezuur-2-fosfaat, en 2 μM forskoline, elke 2 dagen door het systeem. De instellingen die worden gebruikt voor keratinocytdifferentiatie van iPSC's zijn samengevat in tabel 5.
Zoals hierboven vermeld, werd het hele proces uitgevoerd met alleen geautomatiseerde kweekapparatuur, van het zaaien van iPS-cellen tot de daaropvolgende reeks differentiatieprotocollen. De expressie van karakteristieke markers in elke cel werd geëvalueerd (figuur 4). Er werd aangetoond dat differentiatie alleen kon worden geïnduceerd met behulp van een geautomatiseerd kweeksysteem.
Figuur 1: Samenvatting van het geautomatiseerde kweeksysteem. (A) Afbeelding van het systeem met schets van grootte en lay-out 1. (B) Foto van de werkbank en lay-outschets 2. (C) Handgereedschap: schaal, buis en pipet. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Bando et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Passaging-taak en celgroei. (A) Het vierkant illustreert elk proces. (B) iPSC-expansie berekend met behulp van elk geautomatiseerd celgetal in de drie onafhankelijke experimenten. (C) Representatieve beelden die automatisch van doorgang tot doorgang worden vastgelegd. Schaalbalken = 400 μm en 100 μm (inzet). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Bando et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geautomatiseerd langetermijnonderhoud van iPSC. (A) Alle immunocytometrische analyses van de drie onafhankelijke experimenten voor Oct-3/4 en SSEA-4. Elk blauw histogram geeft aan dat er geen primaire antilichaamcontrole is. Elk rood histogram vertegenwoordigt het aangegeven antigeenspecifieke signaal. (B) Representatieve beelden van immunohistochemisch gekleurde cellen voor Oct-3/4, SSEA-4 en Tra 1-81. Schaalbalken = 50 μm. (C) Karyotype van de RIKEN2F-iPSC na de vijfde passage. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Bando et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunohistochemische kleuring. Immunohistochemische foto's van hepatocyten (schaalbalken = 100 μm), cardiomyocyten (schaalbalken = 100 μm), neuronale voorlopercellen (schaalbalken = 100 μm) en keratinocyten (schaalbalken = 200 μm). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Bando et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Doorgangsvoorbereidingen en systeeminstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Cardiomyocytendifferentiatiepreparaten en systeeminstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Preparaten voor hepatocytdifferentiatie en systeeminstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Neurale precursorceldifferentiatiepreparaten en systeeminstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: Preparaten voor differentiatie van keratinocyten en systeeminstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciale stap in het protocol is dat als een gebruiker fouten vindt, u op elk gewenst moment op de knop annuleren, stoppen of resetten klikt en opnieuw begint vanaf de eerste stap. De software kan menselijke fouten voorkomen, waaronder dubbele boekingen, het openen van deuren terwijl de systeemtaken actief zijn en een gebrek aan aanvulling. Een ander cruciaal punt voor succesvolle en efficiënte differentiatie naar de gewenste somatische cel is de juiste selectie van pluripotente stamcellijnen, omdat elke pluripotente stamcel een oncontroleerbare vertekening heeft in zijn differentiatie-eigenschappen14,15.
Dit geautomatiseerde kweeksysteem voor geïnduceerde pluripotente stamcellen kan ze onderhouden en differentiëren in verschillende somatische celtypen. De afmeting van dit systeem is 200 cm (breedte), 110 cm (diepte) en 233 cm (hoogte), met een totaal gewicht van 1,2 ton. De incubator die in het apparaat is ingebouwd, kan tegelijkertijd zesendertig schalen van 10 cm en negen multiwell-platen bevatten.
Verbeteringen ten opzichte van eerdere modellen zijn dat het X-Y-Z-asrailsysteem eerst als handlingarm is omgebouwd van een 6-assige knikarm, die werkt door het tipgereedschap van de arm te veranderen in drie verschillende onderdelen voor schalen, buizen en pipetten. De arm hangt aan het plafond van het systeem en beweegt langs de X-Y-Z-as. Ten tweede werd een celtelsysteem geïntroduceerd voor feedervrije onderhoudsculturen en differentiatie-inductieprotocollen die continu vanaf de passage worden uitgevoerd. Na het mengen van de eencellige suspensieoplossing met de trypanblauwe oplossing, werd deze overgebracht naar een wegwerphemocytometer voor microscopische observatie en beeldvorming. De software analyseert automatisch het verkregen beeld om het aantal levende cellen te tellen en het volume te berekenen dat nodig is om het vereiste aantal cellen te zaaien. De nauwkeurigheid van het aantal cellen dat door deze beeldanalyse werd verkregen, kwam overeen met de nauwkeurigheid die handmatig werd verkregen.
Het X-Y-Z-assen railsysteem werd toegepast om elke taak sneller uit te voeren dan de vorige versie (meerassige gelede arm). Met dit geautomatiseerde kweeksysteem werden gedurende 16 dagen vijf ononderbroken passages uitgevoerd en werden iPSC's 625 ± 93 keer uitgebreid. Hoewel het bewijs van uithoudingsvermogen voor de tijd van celonderhoud zonder feedercellen korter was dan onze vorige demonstratie met feedercellen, was de celexpansie efficiënter in vergelijking met de vorige demonstratie6. De verkorte taaktijd leek bij te dragen aan het voorkomen van celbeschadiging door uitdroging tijdens de taken.
Bovendien werden differentiatietaken van onderhoudskweek tot differentiatie in cardiomyocyten, hepatocyten, neuronale voorlopercellen en keratinocyten uitgevoerd zonder menselijke tussenkomst. Na een reeks van deze kuren werd door fluorescentie-immunokleuring bevestigd dat de cellen die alleen in het geautomatiseerde kweeksysteem waren verkregen, waren gedifferentieerd tot de gewenste cellen. Door een taakprogramma te delen en dit systeem te gebruiken, kunnen onderzoekers die niet bekend zijn met iPS-celbeheer daarom iPSC-afgeleide somatische cellen verkrijgen voor hun eigen onderzoek. Bovendien zouden verschillen in reproduceerbaarheid tussen onderzoekers of faciliteiten zoveel mogelijk kunnen worden geëlimineerd en zou het ervoor kunnen zorgen dat cellen van homogene kwaliteit elke keer worden verkregen.
Door een nieuw railsysteem te gebruiken, kon het materieel worden verkleind en in gewicht worden teruggebracht tot 1,2 ton, ~200 kg lichter dan voorheen. Bovendien kunnen de kosten voor onderdelen en programma's met ongeveer $ 10.000 US dollar worden verlaagd. De onderhouds- en programmeringskosten zouden naar schatting met 13% dalen. Om meer onderzoekers te motiveren om gemakkelijk in iPS-celgerelateerd onderzoek te stappen, is het ook belangrijk om de apparatuurkosten laag te houden6. We hopen dat de huidige en volgende generatie automatische kweeksystemen een van de bijdragen zullen zijn om iPSC's en iPSC-afgeleide gedifferentieerde cellen van meer uniforme kwaliteit te leveren.
De belangrijkste beperkingen van dit systeem zijn de beperkte capaciteit van de koelkast voor het voorlopig bewaren van culturen en de zwakte bij het verwerken van kleine hoeveelheden (<100 μL) vloeistof. Bovendien schakelt het ontbreken van geavanceerde kunstmatige intelligentie automatische optimalisatie uit op basis van de tijdige celconditie. De kleine beperking is de eis van speciale pipetpunten die door de systeemfabrikantenworden geleverd 4,5. We ontwikkelen de volgende generatie kweeksystemen die in staat zullen zijn om kleine hoeveelheden vloeistof voor middelgrote bereidingen te verwerken en een feedbackoptimalisatiesysteem te bevatten op basis van krachtige kunstmatige intelligentie (system learning). Onze samenwerkende fabrikant9 heeft voldoende knowhow om op maat gemaakte systemen te bouwen volgens de speciale behoeften van de gebruikers. Daarnaast zullen binnenkort systemen van de volgende generatie op de markt komen die zijn uitgerust met meer algemene en bredere functies. We overwegen ook een verhuursysteem op abonnementsbasis om up-to-date systemen aan alle gebruikers te leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van het New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
