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Biology

在仿真研究中使用复杂脂质混合物进行真实膜建模

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65712
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York at Buffalo, 2Department of Mathematics, State University of New York at Buffalo

Summary

膜脂质结构和组成的多样性是细胞过程的重要贡献者，可以成为疾病的标志物。分子动力学模拟使我们能够在原子分辨率下研究膜及其与生物分子的相互作用。在这里，我们提供了一个构建、运行和分析复杂膜系统的协议。

Abstract

脂质是细胞膜的结构组成部分;脂质种类因细胞器和生物体而异。这种多样性导致膜中不同的机械和结构特性，直接影响该界面上发生的分子和过程。脂质组成是动态的，可用于调节细胞信号转导过程。计算方法越来越多地用于预测生物分子之间的相互作用，并为实验可观察对象提供分子见解。分子动力学 （MD） 是一种基于统计力学的技术，它根据作用在原子上的力来预测原子的运动。MD模拟可用于表征生物分子的相互作用。在这里，我们简要介绍了该技术，概述了对模拟脂质双层感兴趣的初学者的实用步骤，使用适合初学者的软件演示了该方案，并讨论了该过程的替代方案、挑战和重要考虑因素。特别是，我们强调使用复杂的脂质混合物对感兴趣的细胞膜进行建模的相关性，以在模拟中捕获适当的疏水和机械环境。我们还讨论了一些膜组成和性质调节双层与其他生物分子相互作用的例子。

Introduction

脂质是膜的主要成分，膜为细胞提供边界并实现细胞内区室化 1,2,3。脂质是两亲性的，具有极性头部基团和两个疏水性脂肪酸尾部;它们自组装成双层，以尽量减少疏水链与水的接触3,4。亲水性头部基团和疏水性尾部的各种组合导致生物膜中出现不同类别的脂质，例如甘油磷脂、鞘脂和甾醇（图 1）1,5,6。甘油磷脂是真核细胞膜的主要组成部分，由甘油磷酸盐、长链脂肪酸和低分子量7 的头基组成。脂质命名法基于头部基团的差异;实例包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）或未修饰的磷脂酸（PA）5,6。至于疏水尾部，长度和饱和度随骨架结构而变化。可能的组合很多，导致哺乳动物细胞中有数千种脂质物种6。膜脂质组成的变化导致不同的机械和结构膜特性，从而影响整合膜蛋白和外周蛋白的活性 2,6。

Figure 1
图 1.代表性脂质结构。 脂肪酸尾部以蓝色方框显示，常见脂质头部基团以橙色方框显示，样品骨架以紫色方框显示。 请点击这里查看此图的较大版本.

脂质是细胞过程、信号级联中的蛋白质激活和健康细胞稳态的活跃参与者 8,9。脂质动力学改变是感染的结果，也可能是疾病发病机制的标志物 10、11、12、13、14、15。作为细胞的屏障，膜脂质及其在小分子渗透中的作用的研究与药物递送系统和膜破坏机制有关16,17。细胞器、组织和生物体的化学多样性和脂质种类的不同比例产生了复杂的膜动力学2。因此，在脂质双层的建模研究中保留这些特性非常重要，特别是当研究的目标是检查其他生物分子与膜的相互作用时。在模型中要考虑的脂质种类取决于感兴趣的生物体和细胞区室。例如，PG 脂质对光合bateria 18 中的电子转移很重要，而磷酸化肌醇脂质 （PIP） 是哺乳动物细胞质膜 （PM） 动力学和信号级联的主要参与者19,20。在细胞内，PM、内质网 （ER）、高尔基体和线粒体膜含有影响其功能的独特脂质丰度。例如，内质网是脂质生物发生的枢纽，将胆固醇输送到PM和高尔基体;它含有高脂质多样性，富含 PC 和 PE，但甾醇含量低，可促进膜流动性21,22,23,24。相反，PM根据生物体25包含数百甚至数千种脂质，它含有高水平的鞘脂和胆固醇，与细胞24中的其他膜相比，使其具有特征性的刚性。对于像 PM 这样的膜，应考虑小叶不对称，PM的外小叶富含鞘磷脂、PC和胆固醇，而内小叶富含PE、PI和PS，这对信号级联反应很重要24。最后，脂质多样性还促进了在堆积和内部秩序上不同的微结构域的形成，称为脂筏24,26;它们表现出横向不对称性，据推测在细胞信号转导中起重要作用26，并且由于它们的瞬时性质而难以研究。

透视、光谱和模型膜系统（如巨型单层囊泡 （GUV））等实验技术已被用于研究生物分子与膜的相互作用。然而，仅靠实验方法很难捕捉到所涉及组件的复杂性和动态性。例如，在蛋白质跨膜结构域的成像、此类研究中使用的膜的复杂性以及感兴趣过程中中间或瞬态的鉴定方面存在局限性27,28,29。自 1980 年代脂质单层和双层分子模拟出现以来29，脂质-蛋白质系统及其相互作用现在可以在分子水平上进行量化。分子动力学 （MD） 模拟是一种常见的计算技术，它根据粒子的分子间作用力预测粒子的运动。加性相互作用电位描述了系统30的粒子之间的键合和非键合相互作用。用于模拟这些相互作用的参数集称为模拟力场 （FF）。这些参数是从从头开始计算、半经验和量子力学计算中获得的，并针对 X 射线和电子衍射实验、核磁共振、红外线、拉曼光谱和中子能谱等方法的再现数据进行了优化31.

MD仿真可用于研究分辨率为32,33,34的各种水平的系统。通过全原子 （AA） 模拟研究了旨在表征特定生物分子相互作用、氢键和其他高分辨率细节的系统。相比之下，粗粒度 （CG） 模拟将原子聚集成更大的官能团，以降低计算成本并检查更大规模的动力学33。介于这两者之间的是联合原子 （UA） 模拟，其中氢原子与它们各自的重原子结合以加速计算33,35。MD模拟是探索脂质膜动力学及其与其他分子相互作用的有力工具，可用于为膜界面感兴趣的过程提供分子水平机制。此外，MD模拟可用于缩小实验目标范围，并根据微观相互作用预测给定系统的大分子特性。

简而言之，给定一组初始坐标、速度和一组条件（如恒温和恒压），通过相互作用势和牛顿运动定律的数值积分来计算每个粒子的位置和速度。以迭代方式重复此操作，从而生成仿真轨迹30。这些计算是使用 MD 引擎执行的;在几个开源软件包中，GROMACS36 是最常用的引擎之一，也是我们在这里描述的引擎之一。它还包括用于分析和构建待模拟系统的初始坐标的工具37.其他 MD 发动机包括 NAMD38;CHARMM39 和 AMBER40，用户可以根据给定系统的计算性能自行选择。在仿真过程中可视化轨迹以及分析和解释结果至关重要。有多种工具可供选择;在这里，我们讨论了视觉分子动力学 （VMD），它提供了广泛的功能，包括具有扩展绘图和着色方法的三维 （3-D） 可视化、体积数据可视化、构建、准备和分析 MD 模拟系统的轨迹，以及对系统大小没有限制的轨迹电影制作，如果内存可用41,42,43。

系统组件之间预测动力学的准确性直接受到为轨迹传播选择的FF的影响。经验FF参数化工作由少数研究小组进行。MD 最成熟和最常见的 FF 包括 CHARMM39、AMBER 40、Martini44、OPLS 45 和 SIRAH 46。全原子加性CHARMM36（C36）力场47因其精确再现实验结构数据而广泛用于膜系统的AA MD。它最初由 CHARMM 社区开发，兼容 GROMACS 和 NAMD 等多个 MD 引擎。尽管在常见的FF中有所改进，但人们仍在不断努力改进参数集，以允许在对特定研究系统的兴趣的驱使下，密切再现实验可观察对象的预测48,49。

模拟脂质膜时的一个挑战是确定模拟轨迹的长度。这很大程度上取决于要分析的指标和旨在表征的过程。通常，复杂的脂质混合物需要更长的时间才能达到平衡，因为更多的物质必须有足够的时间在膜平面上扩散并达到稳定的横向组织。当感兴趣的属性达到一个平台并围绕一个常数值波动时，模拟被称为处于平衡状态。通常的做法是获得至少 100-200 ns 的平衡轨迹，以便对感兴趣的属性和相互作用进行适当的统计分析。通常在 200-500 ns 之间运行仅膜模拟，具体取决于脂质混合物的复杂性和研究问题。蛋白质-脂质相互作用通常需要更长的模拟时间，在 500-2000 ns 之间。使用膜系统加速采样和可观察动力学的一些方法是：（i）高度移动的膜模拟物（HMMM）模型，该模型用有机溶剂代替膜中脂质的末端碳以加速采样50;（ii）氢质量再分配（HMR），它将系统中重原子质量的一小部分与氢原子的质量结合起来，以允许使用更大的模拟时间步长51。

以下协议讨论了一种适合初学者的方法，用于使用 AA MD 构建、运行和分析真实的膜模型。鉴于 MD 模拟的性质，必须运行多个轨迹，以确保可重复性和对结果进行适当的统计分析。目前的做法是，每个感兴趣的系统至少运行三个副本。一旦为感兴趣的生物体和过程选择了脂质种类， 图2概述了构建、运行和分析纯膜系统模拟轨迹的基本步骤。

Figure 2
图2.运行 MD 仿真的原理图。 橙色框对应于协议中描述的三个主要步骤。下面是模拟过程的工作流程。在系统设置过程中，包含溶剂化膜系统初始坐标的系统是使用系统输入生成器（如 CHARMM-GUI Membrane Builder）构建的。将输入文件传输到高性能计算集群后，使用 MD 引擎（如 GROMACS）传播仿真轨迹。轨迹分析可以在计算机集群或本地工作站上进行，同时进行可视化。然后，使用带有内置分析代码（如 GROMACS 和 VMD）的包，或使用 Bash 脚本或各种 Python 库来执行分析。 请点击这里查看此图的较大版本.

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Protocol

1. 构建系统坐标

  1. 使用 Web 浏览器导航到 CHARMM-GUI.org （C-GUI）。在顶部菜单上，导航到 Input Generator，然后从屏幕左侧的垂直选项中选择 Membrane Builder 。
  2. 要构建双层，请选择 “双层生成器”。
    注意：首次使用的用户必须在构建第一组坐标之前激活其免费帐户。
  3. 选择 仅膜系统。保存生成的 JOB ID 以检索系统，并根据需要从过程中中断的位置继续。
    1. 在构建过程的每个步骤中，通过单击页面顶部框中的 “查看结构 ”或下载生成的 PDB 文件来可视化系统。注意缺失的成分、所选输入脂质种类或贴片大小中的错误。
  4. 选择系统的组件。
    1. 选择 “非均相脂质 ”选项，即使构建单组分双层;，然后选择“ 矩形框 ”类型。
    2. 选择每种脂质 45 个水分子作为水合选项;这足以确保完全水合的双层。
    3. 根据脂质成分的数量设置XY的长度。 然后，为模型之前确定的每种脂质种类选择要包含的脂质数量。对于下一节讨论的案例研究，建立了一个膜模型，其中 600 个脂质对称分布在两个小叶中。为了模拟真核细胞的内质网，PI模型使用了336 DOPC、132 DPPE、60 CHOL、72 POPI脂质的混合物;PI-PS 模型的 330 DOPC、126 DPPE、54 CHOL、66 POPI 和 24 DOPS 脂质。
      注意：C-GUI提供了一个脂质结构库供您选择;点击物种名称旁边的图片查看其化学结构。
    4. 在脂质名称旁边的两个框中输入上部和下部小叶中所需的分子数。对于案例研究，需要对称的膜组成 - 确保上部小叶和下部小叶中脂质数量不匹配没有错误。如果需要不对称性，请确保每张小叶中的脂质总数正确。有关构建不对称双层的详细信息，请参阅 Park 等人的工作 52,53。
    5. 转到脂质种类列表的顶部，然后单击 “显示系统信息”按钮。组装组件并完成系统。
    6. 选择使用基于距离的算法包括中和离子的选项，以实现更快的收敛54。
    7. 将KCl的默认溶液浓度保留为0.15mM。这是典型的盐浓度，用于使膜双层的模拟盒中性。
      注意：如果要使用不同的浓度，请确保在编辑后单击“ 计算溶剂成分 ”按钮。
  5. 选择模拟条件和设置。
    1. 选择 CHARMM36m 作为 FF 选项;它通常用于脂质和蛋白质模拟，但用户可以选择引言中讨论的其他选项。
    2. 选择 GROMACS 作为 MD 引擎，获取相应格式的示例输入文件。
      注意：建议新用户使用 GROMACS，因为它具有多个在线资源、教程和论坛以获得支持。用户可以从多个 MD 引擎中进行选择，以探索仿真性能和代码语法方面的选项。
    3. 选择 恒定颗粒-压力-温度 （NPT） 系综，这是迄今为止脂质双层模拟中最常用的动态系综。
    4. 将开尔文和酒吧的温度和压力分别设置为 303 K 和 1 bar。通常将温度设置在 298 K 和 310 K 之间以研究生物过程，以确保双层处于液体无序状态。
      注意： 温度取决于要模拟的过程的条件，可以根据需要进行更改。根据模型中的脂质种类，在运行仿真之前将温度设置为高于纯脂质成分的转变温度。
  6. 下载生成的文件并传输到计算机群集。
    1. 在所选软件（如 VMD 或 PyMol）上可视化最终系统，并检查设置是否正确。
      注意：例如，最好检查膜周围是否有足够的水，以使脂质在模拟过程中不会与图像原子相互作用，以及正确的小叶设置（中间没有空间或水的双层）。

2. 运行 MD 模拟

  1. 从计算集群上的 C-GUI 上传和解压缩文件。导航到 Gromacs 目录。创建放宽提交脚本。
  2. 请遵循群集的提交脚本格式准则。
    1. 将列出的命令复制到 README 文件中的 # Production 注释上方，直到提交脚本中。
      注意：C-GUI 的默认值是运行系统 6 步放宽的循环。如果需要不同的、完善的协议，请对其进行编辑以读取刚刚构建并从 C-GUI 下载的坐标。
  3. 提交放宽脚本，并确认已下载所有步骤的所有输出文件，然后再进入生产运行。完成后，检查在 6 步运行期间从 GROMACS 生成的以下输出文件：*.log、*.tpr、*.gro、*.edr、*.trr / *.xtc
  4. 创建生产运行脚本。
    1. 使用任何放宽步骤中的示例 gmx grompp 和 gmx mdrun 命令之一作为模板。
    2. 在使用脚本之前，请确保创建一个 *.mdp 文件，其中包含与提供的 step7_production.mdp 文件类似的模拟选项。
      注： 提供的默认选项是膜模拟的标准选项;数字以 nm 为单位列出，时间以皮秒或步数（皮秒/积分时间步长）为单位给出。更新 nsteps 以运行到所需的仿真长度（这等于 dt * nsteps），并更新 nst[x，v，f]out 以更新数据保存频率（以积分步骤数表示）。对于案例研究，将 nsteps 设置为 250,000,000，仿真长度为 500ns（仿真时间/积分步长 = 500,000 ps / 0.002ps），将 nst[x，v，f]out 设置为 50,000，以每 100 ps 保存一次数据
  5. 在运行实际模拟之前，请运行基准研究以确定资源的最佳利用。
    1. 使用不同数量的计算节点运行系统 1-2 ns。
      注：ER 案例研究在 UB 计算研究中心 （CCR） 高性能计算集群55 上提交了 2 ns，其中针对 1-10 个节点进行了性能测试。
    2. 比较每个设置的性能（以秒/天为单位），以确定运行的最佳资源。通常的做法是选择能够实现 75%-80% 最大性能的节点数。
  6. 运行生产运行。
    1. 每个系统一式三份运行，以确保可重复性并对数据进行统计分析。
    2. 如果计算集群上允许的提交队列时间用完，则根据基准扩展轨迹。先使用 gmx convert-tpr 和 gmx mdrun 命令继续收集轨迹。
      注意：GROMACS 在线文档 （https://manual.gromacs.org/） 中描述了选项。
    3. 对于仅膜系统，通过计算每个脂质随时间变化的面积来检查系统是否达到平衡。如果没有，请扩展模拟轨迹。

3. 分析轨迹

  1. 在运行分析之前对系统进行可视化，以确定感兴趣的分子和用于表征的轨迹部分。
  2. 通过将文件格式更改为 *.xtc 和/或跳过帧来压缩原始轨迹文件 （*.trr），以减小文件大小并促进更有效地传输到本地站进行可视化和分析。
    注：对于大型膜系统，可以选择从轨迹中剥离水以进一步减小文件大小。这可以通过 GROMACS 上的索引文件、VMD 上的 TCL 脚本或 MDAnalysis 和 MDTraj 等 Python 库来完成。
  3. 在轨迹的平衡部分执行选定的分析，根据每脂质面积时间序列确定。
    注：有关典型膜分析以及如何运行它们的更多详细信息，请参阅讨论。

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Representative Results

为了说明方案的使用和可以获得的结果，讨论了内质网（ER）膜模型的比较研究。本研究中的两个模型是 （i） PI 模型，其中包含在 ER 中发现的前四种脂质物种，以及 （ii） PI-PS 模型，它添加了阴离子磷脂酰丝氨酸 （PS） 脂质物种。这些模型后来被用于病毒蛋白及其如何与膜相互作用的研究，对 PS 的兴趣被认为对病毒蛋白的透化活性很重要23。为了掺入脂质尾部结构的多样性，将膜组成设置为DOPC：DPPE：CHOL：POPI（56：22：10：12 mol%）和DOPC：DPPE：CHOL：POPI：DOPS（55：21：11：9：4 mol%）。

膜是用CHARMM-GUI膜生成器生成的。为了适应 4 种不同的脂质种类和后来的蛋白质，对称膜被设置为含有 600 个脂质/小叶。使用协议中推荐的设置，温度为303 K。为了确保独立的复制品，每个膜模型的构建过程重复了三次，每次产生不同的脂质随机混合物。构建系统后，将输入文件移动到 UB 计算研究中心 （CCR） 高性能计算集群55 ，以使用 GROMACS 版本 2020.5 运行 MD 模拟。完成 6 步松弛方案后，由于所有副本的原子数相似，因此每个模型仅在一个系统上执行基准测试（图 3）。最大性能的 75% 为 ~78 ns/天，因此，集群上最多请求 6 个节点进行生产运行。通过在 *.mdp 文件中设置 nstep = 25 x 107 并根据需要根据基准将扩展提交到群集，每个副本的运行时间长达 500 ns。

Figure 3
图3.示例基准测试运行。 用于确定 PI 模型（315,000 个原子）的性能。 请点击这里查看此图的较大版本.

每个副本的脂质面积 （APL） 如图 4 所示。这是使用能量内置程序从存储在 GROMACS 的 *edr 模拟输出文件中的模拟框的 XY 尺寸计算得出的。然后，将总表面积除以每张小叶的总脂质数，以提供每个模型中APL的估计值。对于所有系统，平衡被确定为APL达到平台期并围绕恒定值波动的点。在所有这些系统中，在轨迹的前100 ns内达到平衡（见 图4）。基于该指标，500 ns 的轨迹被认为足以满足这些系统的需求。对这些双层的所有其他分析都是在最后 400 ns 的轨迹上进行的，称为平衡或生产阶段。为了确定每个计算值的不确定性，建议每 10-20 ns 进行一次块平均。从 APL 分析来看，PI-PS 膜模型的表面积平均比 PI 模型大 0.7 Å2 。

Figure 4
图4.每脂质面积示例。 （A） PI 和 （B） PI-PS 型号。每个模型的复制 1、复制 2 和复制 3 以红色、蓝色和绿色显示。所有系统的平衡发生在前 100 ns 内。不确定度报告为均值的标准误差 （SEM）。 请点击这里查看此图的较大版本.

此外，还对膜结构进行了两种简单的分析。 图 5 显示了膜厚度，通过顶部和底部小叶中磷脂磷酸原子的质心 （COM） 之间的距离来估算。这是使用 GROMACS 中的距离程序计算的，该程序需要一个列出两个原子基团的索引文件，一个用于顶部小叶中的磷酸基团，另一个用于底部小叶中的磷酸基团。结果显示，两种膜模型的厚度之间存在统计学差异，说明了APL与膜厚度之间的反比关系。最后， 图6 显示了每种脂质种类的氘阶参数，该度量量化了双层疏水核56内脂质尾部的阶数。脂肪酸尾部分为 sn1 和 sn2，前者附着在甘油主链的末端氧上，后者附着在甘油基团的中心氧上。结果表明，除了 DPPE 在 PI 模型中显示 sn1 尾部的顺序略有增加外，模型之间的脂质尾部顺序几乎没有差异。

Figure 5
图5.膜厚度示例。 （A） PI 和 （B） PI-PS 型号。每个模型的复制 1、复制 2 和复制 3 以红色、蓝色和绿色显示。不确定度报告为均值的标准误差 （SEM）。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图6.氘阶参数示例。 （A） DOPC、（B） DPPE、（C） POPI 和 （D） DOPS 脂质种类。sn1 为实线，sn2 为虚线，PI 模型为红色，PI-PS 模型为蓝色。不确定度报告为均值的标准误差 （SEM）。 请点击这里查看此图的较大版本.

复杂的膜模型可用于研究特定脂质种类的相关性，以及这些脂质如何调节生物分子与膜的相互作用。实验室的样品研究表明：（1）膜组成调节蛋白质19的相互作用，以及（2）脂质尾饱和度和膜表面电荷影响小分子的渗透和横向组织17,57。使用上述方案和与前几段所述的类似分析，Li等人的工作提供了关于D112（一种潜在的光动力治疗剂）和不同脂质混合物之间相互作用的实验和模拟见解17。在实验中检查了具有 PC 和 PS 脂质的双层，以表征双层中的 D112 分配。我们模拟了不同比例的PC和PS脂质，具有不同的脂肪酸尾长和饱和度，即双键数，以确定表面电荷和疏水环境对D112-膜相互作用的影响。虽然静电相互作用驱动 D112 与阴离子 PS 脂质的初始结合，但疏水相互作用通过两种可能的机制将分子拉入膜芯（见图 7A-B）。在膜内，D112 优先定位于富含 PC 的结构域，无论是单体还是二聚体。

Figure 7
图7.按照所提出的方案进行额外的样品系统。 D112 的模拟模型膜确定了两种插入机制 （A） 鱼叉和 （B） 翻转;（C）D112二聚体的取向;（D）膜模型上D112分子（蓝色等高线图）相对于带电脂质（橙色簇）的横向分布。完整的研究可以在 17 中找到。 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

实验技术可以使用冷冻电子显微镜 （cryo-EM）58、荧光技术和原子力显微镜 （AFM）59 以高分辨率可视化生物分子。然而，在原子或氨基酸水平上捕捉分子相互作用的相互作用和动力学是具有挑战性的，这些相互作用是生物学途径、疾病发病机制和治疗递送的基础。本文讨论了MD模拟研究脂质膜的能力，以及设计、构建、运行和分析这些系统的主要步骤。这种计算方法的优点是原子细节和基础方程，可以模拟分子相互作用，以提出和表征膜界面的分子机制。

模拟细胞膜的一个关键步骤是对要研究的生物系统有扎实的了解。要包含的脂质种类取决于生物体、细胞区室，最重要的是，要研究的过程。对于MD初学者来说，使用对称膜进行模拟是一个很好的起点。不对称性虽然是PM等膜的已知特征，但增加了潜在的困难，因为它需要更长的模拟时间才能正确采样小叶之间的横向扩散和甾醇交换。不对称性还会导致每个小叶的 APL 不匹配，必须在模拟52,53 中仔细处理。另一个重要步骤是确定要模拟的膜贴片的大小，这取决于脂质混合物的复杂性和可用的计算资源;较大的膜贴需要更长的计算时间，这可能并不总是可行的。对于均质或二元系统，建议至少 150 个脂质/小叶的大小，对于更复杂的组合物，建议最多 600 个脂质/小叶的大小。如果膜模型用于蛋白质-膜研究，一个好的经验法则是制作一个膜贴片，该膜贴片可以容纳蛋白质最长尺寸的 2-3 倍。检查小分子时，贴片尺寸覆盖率应保持在30%-40%以下，以避免有限尺寸效应。根据确定平衡的指标，与纯脂质或二元混合物相比，复杂的脂质混合物可能需要至少 3 倍的模拟时间。

有多种选项可以设置生物分子模拟的初始坐标。常见的软件包包括 GROMACS36、VMD 42、PACKMOL60、Moltemplate 61 和 CHARMM-GUI 62。C-GUI是一个基于Web的平台，旨在促进这些系统的构建，其脂质库中有各种各样的分子。它提供了不同 MD 引擎和力场参数的输入文件，使其成为初学者的绝佳起点。在构建步骤中，C-GUI 提供单个脂质种类的每脂质面积的估计值。在构建复杂的脂质混合物（5+ 种）时，将此估计值提高 10%-15% 是有用的，尤其是在模型中使用甾醇时。如果在 C-GUI 库中找不到感兴趣的脂质，则可以使用紧密的脂质结构作为占位符，然后在构建和初始松弛系统后使用 VMD 或 Python 脚本修改结构。由于 C36m 是加性力场63，因此如果新分子中的所有原子类型都存在于力场中，则更新的脂质结构通常不需要重新参数化。应该注意的是，该协议并未涵盖 C-GUI 上可用的每个选项，但已经显示了与初学者相关的选项和符合该领域常见做法的选项;开发人员54、62、64 已解决并发布了高级选项。

热力学系综、温度和压力等模拟条件将取决于研究的性质。对于该协议，条件保留为C-GUI中的默认值，这是流体相中膜模拟的典型特征。凝胶相不适合模拟生物膜，它发生在脂质的转变温度以下，并且很容易通过脂质尾部以一定角度平行排列来识别。这可能会因不同的研究目标或根据合作者的实验（如果有的话）而改变。在 MD 运行期间，膜双层的典型设置包括：（1） AA MD 捕获氢氧键的最快振动运动65 的 1-4 fs 时间步长;通常 2 fs 用于生产，但在松弛和最小化步骤中使用 1 fs，如果使用 HMR51 ，则可以使用 4 fs;（2）数据保存频率在0.05-0.2 ns之间是常见的做法;（3） Verlet 截止方案66，范德华相互作用的软硬截止波长为 1.0 和 1.2 nm。设置较大的截止半径会降低仿真性能，因为原子对之间会计算更多的相互作用;然而，计算侧向压力分布需要更大的截止值，这通常需要 2.0-2.4 nm 的截止值;（4）截止波长为1.2 nm的粒子网格爱德华（PME）方案67 用于长距离静电相互作用;（5）GROMACS中使用LINCS算法68 来约束氢键;（6）常见的压力控制器是半各向同性应用于双层的Parrinello-Rahman压力控制器;（7）常见的温度控制器是Nose-Hoover恒温器。请注意，有多种类型的气压恒压器和恒温器可用于模拟，并取决于研究的性质69.

APL、膜厚度和甾醇触发器是确定系统是否达到热平衡的常用指标，其范围从纯双层的 50 ns 到复杂不对称混合物的 4000 ns，具体取决于所选的指标。双层的机械、结构和动力学特性的分析应在达到平衡后进行计算，即一旦感兴趣的特性达到平稳期并相对于平均值波动。轨迹的平衡部分，也称为生产阶段，应至少长 100 ns，以便进行适当的统计分析和不确定性估计。可以通过仿真计算的常见膜特性包括但不限于氘阶参数、电子密度分布、径向分布函数、脂质尾部或头部基团的倾斜角、压缩模量、脂质旋转的弛豫时间、弯曲模量、侧向压力分布、脂质聚集模式和膜界面附近的水动力学35,70，71个;Moradi 等人的一篇综述更详细地描述了其中的一些70。这些分析可以使用 GROMACS 和 VMD 的内置分析工具或使用 Python、Bash 或 TCL 脚本进行。还有许多开源 Python 库，例如 MDAnalysis 72,73、MDTraj74、Pysimm 75、Pyemma 76 和 PyLipID 77，它们有助于分析仿真轨迹。

该协议侧重于全原子方法，如果研究的目标是表征与大膜贴片相互作用的大蛋白质的动力学，则计算要求很高。尽管如此，计算能力的提高和图形单元处理器 （GPU） 的使用有利于大型系统的模拟。MD 模拟需要对系统构象进行足够的采样，以计算准确再现实验值的属性平均值。逼真的膜建模旨在为感兴趣的细胞膜再现准确的机械和结构环境，这直接影响其他生物分子的相互作用，并促进罕见事件的采样78,79,80。在解释数据时，必须小心地用实验趋势或类似系统的实际值来验证观察结果，以验证模型系统不仅是模拟的产物或构成非生理事件78。总之，MD模拟是基于统计热力学检查分子相互作用的强大模型。MD模拟可用于检查脂质多样性对膜结构和机械性能的影响，进而导致在细胞过程中与生物分子的不同相互作用。该协议为设计、构建、运行和分析复杂的脂质膜系统提供了一种适合初学者的方法。这些步骤用于模拟仅膜系统以及膜界面附近的蛋白质或小分子。

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Disclosures

作者没有竞争利益可披露。

Acknowledgments

作者感谢 Jinhui Li 和 Ricardo X. Ramirez 在撰写本文期间的模拟轨迹和讨论。O.C. 得到了布法罗大学总统奖学金和美国国立卫生研究院最大化学生发展培训计划资助 1T32GM144920-01 的支持，授予 Margarita L. Dubocovich （PI）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaconda3 Anaconda Inc (Python & related libraries) N/A
CHARMM-GUI.org Im lab, Lehigh University N/A
GROMACS GROMACS development team N/A
Linux HPC Cluster UB CCR N/A
MATLAB MathWorks N/A
VMD Theoretical and Computational Biophysics Group N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vanni, S., Riccardi, L., Palermo, G., De Vivo, M. Structure and Dynamics of the Acyl Chains in the Membrane Trafficking and Enzymatic Processing of Lipids. Accounts of Chemical Research. 52 (11), 3087-3096 (2019).
  2. Harayama, T., Riezman, H. Understanding the diversity of membrane lipid composition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 281-296 (2018).
  3. Tanaka, M. Comprehensive Biophysics. Edward, H. . E. gelman , Elsevier. 261-272 (2012).
  4. Bruce Alberts, A. J., Julian Lewis,, Martin Raff,, Keith Roberts,, Peter Walter, Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. (2002).
  5. Watson, H. Biological membranes. Essays in Biochemistry. 59, 43-69 (2015).
  6. Coskun, Ü, Simons, K. Cell Membranes: The Lipid Perspective. Structure. 19 (11), 1543-1548 (2011).
  7. Biobased Surfactants (Second Edition) eds. Douglas G, H. ayes, Daniel, K. Y., Solaiman,, Richard, D. , AOCS Press. 515-529 (2019).
  8. González-Rubio, P., Gautier, R., Etchebest, C., Fuchs, P. F. J. Amphipathic-Lipid-Packing-Sensor interactions with lipids assessed by atomistic molecular dynamics. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1808, 2119-2127 (2011).
  9. Halbleib, K., et al. Activation of the Unfolded Protein Response by Lipid Bilayer Stress. Molecular Cell. 67, 673-684 (2017).
  10. Andreasen, M., Lorenzen, N., Otzen, D. Interactions between misfolded protein oligomers and membranes: A central topic in neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (9), 1897-1907 (2015).
  11. Calianese, D. C., Birge, R. B. Biology of phosphatidylserine (PS): basic physiology and implications in immunology, infectious disease, and cancer. Cell Commununication and Signaling. 18 (1), 41 (2020).
  12. Nieto-Garai, J. A., Contreras, F. X., Arboleya, A., Lorizate, M. Role of Protein-Lipid Interactions in Viral Entry. Advanced Biology. 6, 2101264 (2022).
  13. Mazzon, M., Mercer, J. Lipid interactions during virus entry and infection. Cell Microbiology. 16, 1493-1502 (2014).
  14. Colombelli, C., Aoun, M., Tiranti, V. Defective lipid metabolism in neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA) syndromes: not only a matter of iron. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38 (1), 123-136 (2015).
  15. Saini-Chohan, H. K., Mitchell, R. W., Vaz, F. M., Zelinski, T., Hatch, G. M. Delineating the role of alterations in lipid metabolism to the pathogenesis of inherited skeletal and cardiac muscle disorders: Thematic Review Series: Genetics of Human Lipid Diseases. Journal of Lipid Research. 53 (1), 4-27 (2012).
  16. Martinotti, C., Ruiz-Perez, L., Deplazes, E., Mancera, R. L. Molecular Dynamics Simulation of Small Molecules Interacting with Biological Membranes. ChemPhysChem. 21 (14), 1486-1514 (2020).
  17. Li, J., Kalyanram, P., Rozati, S., Monje-Galvan, V., Gupta, A. Interaction of Cyanine-D112 with Binary Lipid Mixtures: Molecular Dynamics Simulation and Differential Scanning Calorimetry Study. ACS Omega. 7 (11), 9765-9774 (2022).
  18. Nagy, L., et al. Protein/Lipid Interaction in the Bacterial Photosynthetic Reaction Center: Phosphatidylcholine and Phosphatidylglycerol Modify the Free Energy Levels of the Quinones. Biochemistry. 43 (40), 12913-12923 (2004).
  19. Ramirez, R. X., Campbell, O., Pradhan, A. J., Atilla-Gokcumen, G. E., Monje-Galvan, V. Modeling the molecular fingerprint of protein-lipid interactions of MLKL on complex bilayers. Frontiers in Chemistry. 10, (2023).
  20. Dondelinger, Y., et al. MLKL Compromises Plasma Membrane Integrity by Binding to Phosphatidylinositol Phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  21. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  22. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5 (2011).
  23. Lee, H. R., Lee, G. Y., You, D. G., Kim, H. K., Young, D. Y. Hepatitis C virus p7 induces membrane permeabilization by interacting with phosphatidylserine. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 897 (2020).
  24. Casares, D., Escribá, P. V., Rosselló, C. A. Membrane Lipid Composition: Effect on Membrane and Organelle Structure, Function and Compartmentalization and Therapeutic Avenues. International Journal of Molecular Sciences. 20 (9), 2167 (2019).
  25. Marrink, S. J., et al. Computational Modeling of Realistic Cell Membranes. Chemical Reviews. 119 (9), 6184-6226 (2019).
  26. Janmey, P. A., Kinnunen, P. K. J. Biophysical properties of lipids and dynamic membranes. Trends in Cell Biology. 16 (10), 538-546 (2006).
  27. Brémaud, E., Favard, C., Muriaux, D. Deciphering the Assembly of Enveloped Viruses Using Model Lipid Membranes. Membranes. 12, 441 (2022).
  28. Campbell, O., Monje-Galvan, V. Protein-driven membrane remodeling: Molecular perspectives from Flaviviridae infections. Biophysical Journal. 122 (11), 1890-1899 (2022).
  29. Loschwitz, J., Olubiyi, O. O., Hub, J. S., Strodel, B., Poojari, C. S. Computer simulations of protein-membrane systems. Progress in molecular biology and translational science. 170, 273-403 (2020).
  30. Shell, M. S. Thermodynamics and Statistical Mechanics: An Integrated ApproachCambridge Series in Chemical Engineering. Scott Shell, M. , Cambridge University Press. 21-49 (2015).
  31. Yang, J., et al. Molecular Dynamic Simulation of Ni-Al Alloy-H2O Reactions Using the ReaxFF Reactive Force Field. ACS Omega. 8 (11), 9807-9814 (2023).
  32. Ingólfsson, H. I., Arnarez, C., Periole, X., Marrink, S. J. Computational 'microscopy' of cellular membranes. Journal of Cell Science. 129 (2), 257-268 (2016).
  33. Klauda, J. B. Perspective: Computational modeling of accurate cellular membranes with molecular resolution. The Journal of Chemical Physics. 149 (22), 220901 (2018).
  34. Chavent, M., Duncan, A. L., Sansom, M. S. P. Molecular dynamics simulations of membrane proteins and their interactions: from nanoscale to mesoscale. Current Opinion in Structural Biology. 40, 8-16 (2016).
  35. Khakbaz, P., Monje-Galvan, V., Zhuang, X., Klauda, J. B. Biogenesis of Fatty Acids, Lipids and Membranes. Otto Geiger, , Springer International Publishing. 1-19 (2017).
  36. Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
  37. Lemkul, J. A. From Proteins to Perturbed Hamiltonians: A Suite of Tutorials for the GROMACS-2018 Molecular Simulation Package. Living Journal of Computational Molecular Science. 1 (1), 5068 (2018).
  38. Phillips, J. C., et al. Scalable molecular dynamics on CPU and GPU architectures with NAMD. The Journal of Chemical Physics. 153 (4), 044130 (2020).
  39. Klauda, J. B., et al. Update of the CHARMM All-Atom Additive Force Field for Lipids: Validation on Six Lipid Types. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7830-7843 (2010).
  40. Wang, J., Wolf, R. M., Caldwell, J. W., Kollman, P. A., Case, D. A. Development and testing of a general amber force field. Journal of Computational Chemistry. 25 (9), 1157-1174 (2004).
  41. John Stone, A. A., et al. Using VMD. , http://csbmb.beckman.illinois.edu/BIOP586C/vmd-tutorial-2011.pdf (2011).
  42. Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).
  43. Hsin, J., Arkhipov, A., Yin, Y., Stone, J. E., Schulten, K. Using VMD: An Introductory Tutorial. Current Protocols in Bioinformatics. 24 (1), 5.7.1-5.7.48 (2008).
  44. Souza, P. C. T., et al. Martini 3: a general purpose force field for coarse-grained molecular dynamics. Nature Methods. 18 (4), 382-388 (2021).
  45. Jorgensen, W. L., Maxwell, D. S., Tirado-Rives, J. Development and Testing of the OPLS All-Atom Force Field on Conformational Energetics and Properties of Organic Liquids. Journal of the American Chemical Society. 118 (45), 11225-11236 (1996).
  46. Machado, M. R., et al. The SIRAH 2.0 Force Field: Altius, Fortius, Citius. Journal of Chemical Theory and Computation. 15 (4), 2719-2733 (2019).
  47. Huang, J., et al. CHARMM36m: an improved force field for folded and intrinsically disordered proteins. Nature Methods. 14 (1), 71-73 (2017).
  48. Mu, J., Liu, H., Zhang, J., Luo, R., Chen, H. F. Recent Force Field Strategies for Intrinsically Disordered Proteins. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (3), 1037-1047 (2021).
  49. Inakollu, V. S. S., Geerke, D. P., Rowley, C. N., Yu, H. Polarisable force fields: what do they add in biomolecular simulations. Current Opinion in Structural Biology. 61, 182-190 (2020).
  50. Ohkubo, Y. Z., et al. Accelerating Membrane Insertion of Peripheral Proteins with a Novel Membrane Mimetic Model. Biophysical Journal. 102 (9), 2130-2139 (2012).
  51. Hopkins, C. W., Le Grand, S., Walker, R. C., Roitberg, A. E. Long-Time-Step Molecular Dynamics through Hydrogen Mass Repartitioning. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (4), 1864-1874 (2015).
  52. Park, S., Beaven, A. H., Klauda, J. B., Im, W. How Tolerant are Membrane Simulations with Mismatch in Area per Lipid between Leaflets. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (7), 3466-3477 (2015).
  53. Park, S., Im, W., Pastor, R. W. Developing initial conditions for simulations of asymmetric membranes: a practical recommendation. Biophysical Journal. 120 (22), 5041-5059 (2021).
  54. Wu, E. L., et al. CHARMM-GUI Membrane Builder toward realistic biological membrane simulations. Journal of Computational Chemistry. 35 (27), 1997-2004 (2014).
  55. Center for Computational Research, U.a.B.. CCR Facility Description. , https://ubir.buffalo.edu/xmlui/handle/10477/79221 (2019).
  56. Piggot, T. J., Allison, J. R., Sessions, R. B., Essex, J. W. On the Calculation of Acyl Chain Order Parameters from Lipid Simulations. Journal of Chemical Theory and Computation. 13 (11), 5683-5696 (2017).
  57. Li, J., Monje-Galvan, V. Effect of Glycone Diversity on the Interaction of Triterpenoid Saponins and Lipid Bilayers. ACS Applied Bio Materials. , (2023).
  58. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  59. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).
  60. Martínez, L., Andrade, R., Birgin, E. G., Martínez, J. M. PACKMOL: A package for building initial configurations for molecular dynamics simulations. Journal of Computational Chemistry. 30 (13), 2157-2164 (2009).
  61. Jewett, A. I., et al. Moltemplate: A Tool for Coarse-Grained Modeling of Complex Biological Matter and Soft Condensed Matter Physics. Journal of Molecular Biology. 433 (11), 166841 (2021).
  62. Jo, S., Kim, T., Iyer, V. G., Im, W. CHARMM-GUI: A web-based graphical user interface for CHARMM. Journal of Computational Chemistry. 29 (11), 1859-1865 (2008).
  63. Polêto, M. D., Lemkul, J. A. Integration of experimental data and use of automated fitting methods in developing protein force fields. Communications Chemistry. 5 (1), 38 (2022).
  64. Hynninen, A. P., Crowley, M. F. New faster CHARMM molecular dynamics engine. Journal of Computational Chemistry. 35 (5), 406-413 (2014).
  65. Kim, S. Issues on the Choice of a Proper Time Step in Molecular Dynamics. Physics Procedia. 53, 60-62 (2014).
  66. Grubmüller, H., Heller, H., Windemuth, A., Schulten, K. Generalized Verlet Algorithm for Efficient Molecular Dynamics Simulations with Long-range Interactions. Molecular Simulation. 6 (1-3), 121-142 (1991).
  67. Darden, T., York, D., Pedersen, L. Particle mesh Ewald: An N·log(N) method for Ewald sums in large systems. Journal of Chemical Physics. 98 (12), 10089-10092 (1993).
  68. Hepatitis C. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-c (2021).
  69. Braun, E., et al. Best Practices for Foundations in Molecular Simulations [Article v1.0]. Living Journal of Computational Molecular Science. 1 (1), 5957 (2018).
  70. Moradi, S., Nowroozi, A., Shahlaei, M. Shedding light on the structural properties of lipid bilayers using molecular dynamics simulation: a review study. RSC Advances. 9 (8), 4644-4658 (2019).
  71. Monje-Galvan, V., Klauda, J. B. Modeling Yeast Organelle Membranes and How Lipid Diversity Influences Bilayer Properties. Biochemistry. 54 (45), 6852-6861 (2015).
  72. Michaud-Agrawal, N., Denning, E. J., Woolf, T. B., Beckstein, O. MDAnalysis: A toolkit for the analysis of molecular dynamics simulations. Journal of Computational Chemistry. 32 (10), 2319-2327 (2011).
  73. Gowers, R., et al. MDAnalysis: A Python Package for the Rapid Analysis of Molecular Dynamics Simulations. SciPy. , (2016).
  74. McGibbon, R. obert T., et al. MDTraj: A Modern Open Library for the Analysis of Molecular Dynamics Trajectories. Biophysical Journal. 109 (8), 1528-1532 (2015).
  75. Fortunato, M. E., Colina, C. M. pysimm: A python package for simulation of molecular systems. SoftwareX. 6, 7-12 (2017).
  76. Scherer, M. K., et al. PyEMMA 2: A Software Package for Estimation, Validation, and Analysis of Markov Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (11), 5525-5542 (2015).
  77. Song, W., et al. PyLipID: A Python Package for Analysis of Protein-Lipid Interactions from Molecular Dynamics Simulations. Journal of Chemical Theory and Computation. 18 (2), 1188-1201 (2022).
  78. Monje-Galvan, V., Klauda, J. B. Peripheral membrane proteins: Tying the knot between experiment and computation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (7, Part B), 1584-1593 (2016).
  79. Monje-Galvan, V., Voth, G. A. Binding mechanism of the matrix domain of HIV-1 gag on lipid membranes. eLife. 9, e58621 (2020).
  80. Wang, B., Guo, C. Concentration-Dependent Effects of Cholesterol on the Dimerization of Amyloid-β Peptides in Lipid Bilayers. ACS Chemical Neuroscience. 13 (18), 2709-2718 (2022).

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Campbell, O., Le, V., Aguirre, A., Monje-Galvan, V. Realistic Membrane Modeling Using Complex Lipid Mixtures in Simulation Studies. J. Vis. Exp. (199), e65712, doi:10.3791/65712 (2023).

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