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Biology

Modélisation membranaire réaliste à l’aide de mélanges lipidiques complexes dans des études de simulation

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65712
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York at Buffalo, 2Department of Mathematics, State University of New York at Buffalo

Summary

La diversité des lipides membranaires dans leur structure et leur composition est un contributeur important aux processus cellulaires et peut être un marqueur de maladie. Les simulations de dynamique moléculaire nous permettent d’étudier les membranes et leurs interactions avec les biomolécules à une résolution atomistique. Ici, nous fournissons un protocole pour construire, exécuter et analyser des systèmes membranaires complexes.

Abstract

Les lipides sont des éléments constitutifs structurels des membranes cellulaires ; Les espèces lipidiques varient d’un organite cellulaire à l’autre et d’un organisme à l’autre. Cette variété se traduit par différentes propriétés mécaniques et structurelles dans la membrane qui ont un impact direct sur les molécules et les processus qui se produisent à cette interface. La composition lipidique est dynamique et peut servir à moduler les processus de signalisation cellulaire. Les approches computationnelles sont de plus en plus utilisées pour prédire les interactions entre les biomolécules et fournir des informations moléculaires aux observables expérimentales. La dynamique moléculaire (MD) est une technique basée sur la mécanique statistique qui prédit le mouvement des atomes en fonction des forces qui agissent sur eux. Les simulations de DM peuvent être utilisées pour caractériser l’interaction des biomolécules. Ici, nous présentons brièvement la technique, décrivons les étapes pratiques pour les débutants qui s’intéressent à la simulation de bicouches lipidiques, démontrons le protocole avec un logiciel convivial pour les débutants et discutons des alternatives, des défis et des considérations importantes du processus. En particulier, nous soulignons la pertinence de l’utilisation de mélanges lipidiques complexes pour modéliser une membrane cellulaire d’intérêt afin de capturer les environnements hydrophobes et mécaniques appropriés en simulation. Nous discutons également de quelques exemples où la composition et les propriétés membranaires modulent les interactions des bicouches avec d’autres biomolécules.

Introduction

Les lipides sont des constituants majeurs des membranes, qui fournissent des limites aux cellules et permettent la compartimentation intracellulaire 1,2,3. Les lipides sont amphiphiles, avec un groupe de tête polaire et deux queues d’acides gras hydrophobes ; Ceux-ci s’auto-assemblent en une bicouche pour minimiser le contact des chaînes hydrophobes avec l’eau 3,4. Diverses combinaisons de groupes de têtes hydrophiles et de queues hydrophobes donnent lieu à différentes classes de lipides dans les membranes biologiques, telles que les glycérophospholipides, les sphingolipides et les stérols (Figure 1)1,5,6. Les glycérophospholipides sont les principaux éléments constitutifs des membranes cellulaires eucaryotes composées de glycérophosphate, d’acides gras à longue chaîne et de groupes de tête de faible poids moléculaire7. La nomenclature des lipides est basée sur les différences entre les groupes de têtes ; par exemple, la phosphatidyl-choline (PC), la phosphatidyl-éthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidyl-glycérol (PG), le phosphatidyl-inositol (PI) ou l’acide phosphatidique (PA) non modifié5,6. En ce qui concerne les queues hydrophobes, la longueur et le degré de saturation varient, ainsi que la structure de la colonne vertébrale. Les combinaisons possibles sont nombreuses, ce qui donne des milliers d’espèces lipidiques dans les cellules de mammifères6. Les changements dans la composition des lipides membranaires conduisent à différentes propriétés membranaires mécaniques et structurelles qui ont un impact sur l’activité des protéines membranaires intégrales et des protéines périphériques 2,6.

Figure 1
Graphique 1. Structures lipidiques représentatives. Les queues d’acides gras sont représentées dans des cases bleues, les groupes de têtes lipidiques communs en orange et les épines dorsales d’échantillons en violet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les lipides jouent un rôle actif dans les processus cellulaires, l’activation des protéines dans les cascades de signalisation et l’homéostasie des cellules saines 8,9. L’altération de la dynamique des lipides est le résultat d’une infection ou peut être un marqueur de pathogenèse de la maladie 10,11,12,13,14,15. En tant que barrières pour la cellule, l’étude des lipides membranaires et de leur rôle dans la perméation de petites molécules est pertinente pour les systèmes d’administration de médicaments et les mécanismes de perturbation membranaire16,17. La diversité chimique et les différents ratios d’espèces lipidiques entre les organites, les tissus et les organismes donnent lieu à une dynamique membranaire complexe2. Il est donc important de conserver ces caractéristiques dans les études de modélisation des bicouches lipidiques, en particulier lorsque l’objectif d’une étude est d’examiner les interactions d’autres biomolécules avec la membrane. Les espèces lipidiques à prendre en compte dans un modèle dépendent de l’organisme et du compartiment cellulaire d’intérêt. Par exemple, les lipides PG sont importants pour le transfert d’électrons dans les bactéries photosynthétiques18, tandis que les lipides d’inositol phosphorylés (PIP) sont des acteurs majeurs de la dynamique de la membrane plasmique (PM) et des cascades de signalisation dans les cellules de mammifères 19,20. À l’intérieur de la cellule, les membranes de PM, de réticulum endoplasmique (RE), de Golgi et mitochondriales contiennent des abondances lipidiques uniques qui influencent leur fonction. Par exemple, le RE est la plaque tournante de la biogenèse des lipides et transporte le cholestérol vers les PM et Golgi ; il contient une grande diversité lipidique avec une abondance de PC et de PE, mais une faible teneur en stérols, ce qui favorise la fluidité membranaire21,22,23,24. En revanche, le PM incorpore des centaines, voire des milliers d’espèces lipidiques selon lesorganismes25, il contient des niveaux élevés de sphingolipides et de cholestérol qui lui confèrent une rigidité caractéristique par rapport aux autres membranes de la cellule24. L’asymétrie des feuillets doit être envisagée pour les membranes comme le PM, qui a un feuillet externe riche en sphingomyéline, en PC et en cholestérol, et un feuillet interne riche en PE, PI et PS qui sont importants pour les cascades de signalisation24. Enfin, la diversité lipidique induit également la formation de micro-domaines qui diffèrent par leur empilement et leur ordre interne, connus sous le nom de radeaux lipidiques24,26 ; Ceux-ci présentent une asymétrie latérale, sont supposés jouer un rôle important dans la signalisation cellulaire26 et sont difficiles à étudier en raison de leur nature transitoire.

Des techniques expérimentales telles que la fluoroscopie, la spectroscopie et des systèmes membranaires modèles tels que les vésicules unilamellaires géantes (GUV) ont été utilisées pour étudier les interactions des biomolécules avec les membranes. Cependant, la nature complexe et dynamique des composants impliqués est difficile à saisir avec les seules méthodes expérimentales. Par exemple, il existe des limites à l’imagerie des domaines transmembranaires des protéines, à la complexité des membranes utilisées dans de telles études et à l’identification d’états intermédiaires ou transitoires au cours du processus d’intérêt27,28,29. Depuis l’avènement de la simulation moléculaire des monocouches et bicouches lipidiques dans les années 198029, les systèmes lipides-protéines et leurs interactions peuvent désormais être quantifiés au niveau moléculaire. La simulation de dynamique moléculaire (MD) est une technique de calcul courante qui prédit le mouvement des particules en fonction de leurs forces intermoléculaires. Un potentiel d’interaction additif décrit les interactions liées et non liées entre les particules du système30. L’ensemble des paramètres utilisés pour modéliser ces interactions est appelé champ de force de simulation (FF). Ces paramètres sont obtenus à partir de calculs ab initio, de calculs semi-empiriques et de mécanique quantique, et optimisés pour reproduire des données provenant d’expériences de diffraction des rayons X et des électrons, de la RMN, de l’infrarouge, de la spectroscopie Raman et de la spectroscopie neutronique, entre autres méthodes31.

Les simulations MD peuvent être utilisées pour étudier des systèmes à différents niveaux de résolution32,33,34. Les systèmes qui visent à caractériser des interactions biomoléculaires spécifiques, des liaisons hydrogène et d’autres détails à haute résolution sont étudiés avec des simulations de tous les atomes (AA). En revanche, les simulations à gros grain (CG) regroupent les atomes en groupes fonctionnels plus grands afin de réduire les coûts de calcul et d’examiner la dynamique à plus grande échelle33. Entre les deux se trouvent des simulations d’atomes unis (UA), où les atomes d’hydrogène sont combinés avec leurs atomes lourds respectifs pour accélérer le calcul33,35. Les simulations MD sont un outil puissant pour l’exploration de la dynamique des membranes lipidiques et de leurs interactions avec d’autres molécules et peuvent servir à fournir des mécanismes au niveau moléculaire pour les processus d’intérêt à l’interface membranaire. De plus, les simulations de DM peuvent servir à affiner les cibles expérimentales et à prédire les propriétés macromoléculaires d’un système donné sur la base d’interactions microscopiques.

En bref, étant donné un ensemble de coordonnées initiales, de vitesses et un ensemble de conditions telles qu’une température et une pression constantes, les positions et les vitesses de chaque particule sont calculées par intégration numérique du potentiel d’interaction et de la loi du mouvement de Newton. Ceci est répété de manière itérative, générant ainsi une trajectoire de simulation30. Ces calculs sont effectués à l’aide d’un moteur MD ; Parmi plusieurs paquets open-source, GROMACS36 est l’un des moteurs les plus couramment utilisés et celui que nous décrivons ici. Il comprend également des outils d’analyse et de construction des coordonnées initiales des systèmes à simuler37. Parmi les autres moteurs MD, citons le NAMD38 ; CHARMM39 et AMBER40, que l’utilisateur peut sélectionner à sa propre discrétion en fonction des performances de calcul d’un système donné. Il est essentiel de visualiser les trajectoires pendant la simulation ainsi que pour l’analyse et l’interprétation des résultats. Une variété d’outils sont disponibles ; Nous discutons ici de la dynamique moléculaire visuelle (VMD) qui offre un large éventail de fonctionnalités, y compris la visualisation tridimensionnelle (3D) avec des méthodes de dessin et de coloration étendues, la visualisation volumétrique des données, la construction, la préparation et l’analyse des trajectoires des systèmes de simulation MD, et la réalisation de films de trajectoire sans limite de taille du système, si la mémoire est disponible41,42,43.

La précision de la dynamique prédite entre les composants du système est directement influencée par le FF choisi pour la propagation de la trajectoire. Les efforts empiriques de paramétrisation de la FF sont poursuivis par quelques groupes de recherche. Les FF les plus établis et les plus courants pour la DM sont CHARMM39, AMBER 40, Martini44, OPLS 45 et SIRAH 46. Le champ de force47 de l’additif CHARMM36 tous les atomes (C36) est largement utilisé pour la MD AA des systèmes membranaires car il reproduit avec précision les données structurelles expérimentales. Il a été développé à l’origine par la communauté CHARMM, et il est compatible avec plusieurs moteurs MD comme GROMACS et NAMD. Malgré les améliorations apportées aux FF courants, il y a un effort continu pour améliorer les ensembles de paramètres afin de permettre des prédictions qui reproduisent fidèlement les observables expérimentales, motivées par l’intérêt pour des systèmes d’étude particuliers48,49.

L’un des défis de la simulation des membranes lipidiques est de déterminer la longueur de la trajectoire de simulation. Cela dépend en grande partie des métriques à analyser et du processus que l’on cherche à caractériser. En règle générale, les mélanges lipidiques complexes nécessitent plus de temps pour atteindre l’équilibre, car un plus grand nombre d’espèces doivent avoir suffisamment de temps pour diffuser sur le plan membranaire et atteindre une organisation latérale stable. On dit d’une simulation qu’elle est à l’équilibre lorsque la propriété d’intérêt a atteint un plateau et fluctue autour d’une valeur constante. Il est courant d’obtenir au moins 100 à 200 ns de trajectoire équilibrée pour effectuer une analyse statistique appropriée sur les propriétés et les interactions d’intérêt. Il est courant d’effectuer des simulations membranaires uniquement entre 200 et 500 ns, en fonction de la complexité du mélange lipidique et de la question de recherche. Les interactions protéine-lipide nécessitent généralement des temps de simulation plus longs, entre 500 et 2000 ns. Voici quelques approches permettant d’accélérer l’échantillonnage et la dynamique observable avec les systèmes membranaires : (i) le modèle mimétique membranaire hautement mobile (HMMM), qui remplace les carbones finaux des lipides dans la membrane par un solvant organique pour accélérer l’échantillonnage50 ; et (ii) le repartitionnement de la masse de l’hydrogène (HMR), qui combine une fraction des masses d’atomes lourds au sein d’un système avec celles des atomes d’hydrogène pour permettre l’utilisation d’un pas de temps de simulation plus grand51.

Le protocole suivant traite d’une approche conviviale pour les débutants afin de créer, d’exécuter et d’analyser des modèles de membrane réalistes à l’aide d’AA MD. Compte tenu de la nature des simulations de DM, plusieurs trajectoires doivent être exécutées pour tenir compte de la reproductibilité et de l’analyse statistique appropriée des résultats. Il est d’usage d’exécuter au moins trois réplicas par système d’intérêt. Une fois que les espèces lipidiques ont été sélectionnées pour l’organisme et le processus d’intérêt, les étapes de base pour construire, exécuter et analyser une trajectoire de simulation d’un système membranaire seul sont décrites et résumées dans la figure 2.

Figure 2
Graphique 2. Schéma permettant d’exécuter des simulations MD. Les cases orange correspondent aux trois étapes principales décrites dans le protocole. En dessous se trouve le flux de travail du processus de simulation. Lors de la configuration du système, le système contenant les coordonnées initiales d’un système à membrane solvatée est construit à l’aide d’un générateur d’entrée système tel que CHARMM-GUI Membrane Builder. Après avoir transféré les fichiers d’entrée vers un cluster de calcul haute performance, la trajectoire de simulation est propagée à l’aide d’un moteur MD, tel que GROMACS. L’analyse de trajectoire peut être effectuée sur le cluster informatique ou sur un poste de travail local avec visualisation. L’analyse est ensuite effectuée, soit à l’aide de packages avec du code d’analyse intégré tels que GROMACS et VMD, soit à l’aide de scripts Bash ou de diverses bibliothèques Python. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

1. Construire les coordonnées du système

  1. Accédez à CHARMM-GUI.org (C-GUI) à l’aide d’un navigateur Web. Dans le menu supérieur, accédez à Générateur d’entrées, puis sélectionnez Membrane Builder dans les options verticales sur le côté gauche de l’écran.
  2. Pour créer un bicalque, sélectionnez Générateur de bicalques.
    REMARQUE : Les nouveaux utilisateurs doivent activer leur compte gratuit avant de créer leur premier ensemble de coordonnées.
  3. Sélectionnez Système à membrane uniquement. Enregistrez l’ID de JOB généré pour récupérer le système et reprendre là où vous vous êtes arrêté pendant le processus si nécessaire.
    1. Visualisez les systèmes à chaque étape du processus de construction en cliquant sur Afficher la structure dans la zone située en haut de la page, ou en téléchargeant le fichier PDB résultant. Recherchez les composants manquants, les erreurs dans l’espèce lipidique d’entrée sélectionnée ou la taille du patch.
  4. Sélectionnez les composants du système.
    1. Choisissez l’option Lipide hétérogène , même si vous construisez une bicouche à un seul composant ; puis sélectionnez un type de boîte rectangulaire .
    2. Sélectionnez 45 molécules d’eau par lipide pour l’option d’hydratation ; C’est suffisant pour assurer une bicouche complètement hydratée.
    3. Définissez la longueur de XY en fonction du nombre de composants lipidiques. Ensuite, sélectionnez le nombre de lipides à inclure pour chaque espèce lipidique déterminé en amont du modèle. Pour l’étude de cas discutée dans la section suivante, un modèle membranaire avec 600 lipides répartis symétriquement dans deux feuillets a été construit. Pour modéliser le RE des cellules eucaryotes, un mélange de 336 lipides DOPC, 132 DPPE, 60 CHOL, 72 POPI a été utilisé pour le modèle PI ; et 330 lipides DOPC, 126 DPPE, 54 CHOL, 66 POPI et 24 DOPS pour le modèle PI-PS.
      REMARQUE : C-GUI fournit une bibliothèque de structures lipidiques parmi lesquelles choisir ; Cliquez sur les images à côté du nom de l’espèce pour connaître sa structure chimique.
    4. Tapez le nombre souhaité de molécules dans la foliole supérieure et inférieure dans les deux cases à côté du nom du lipide. Pour l’étude de cas, une composition membranaire symétrique est souhaitée - assurez-vous qu’il n’y a pas d’erreurs sur le nombre inégalé de lipides dans la foliole supérieure et la foliole inférieure. Si une asymétrie est souhaitée, assurez-vous que le nombre total de lipides dans chaque feuillet est correct. Pour plus de détails sur la construction de bicouches asymétriques, reportez-vous aux travaux de Park et al.52,53.
    5. Allez en haut de la liste des espèces lipidiques et cliquez sur le bouton Afficher les informations système. Assemblez les composants et complétez le système.
    6. Sélectionnez l’option permettant d’inclure des ions neutralisants à l’aide de l’algorithme basé sur la distance pour une convergence plus rapide54.
    7. Laisser la concentration par défaut de la solution de KCl à 0,15 mM. Il s’agit d’une concentration de sel typique pour rendre neutre la boîte de simulation pour les bicouches membranaires.
      REMARQUE : Si une concentration différente doit être utilisée, assurez-vous de cliquer sur le bouton Calculer la composition du solvant après l’avoir modifié.
  5. Sélectionnez les conditions et les paramètres de simulation.
    1. Sélectionnez CHARMM36m comme option FF ; Il est couramment utilisé pour les simulations de lipides et de protéines, mais l’utilisateur peut sélectionner d’autres options discutées dans l’introduction.
    2. Sélectionnez GROMACS comme moteur MD pour obtenir des exemples de fichiers d’entrée dans le format correspondant.
      REMARQUE : GROMACS est recommandé pour les nouveaux utilisateurs car il dispose de plusieurs ressources en ligne, tutoriels et forums d’assistance. L’utilisateur peut choisir parmi plusieurs moteurs MD pour explorer les options en termes de performances de simulation et de syntaxe du code.
    3. Sélectionnez l’ensemble Particule-Pression-Température (NPT), de loin l’ensemble dynamique le plus utilisé dans la simulation des bicouches lipidiques.
    4. Réglez la température et la pression en Kelvin et en bars sur 303 K et 1 bar, respectivement. Il est typique de régler la température entre 298 K et 310 K pour l’étude des processus biologiques afin d’assurer une bicouche à l’état de désordre liquide.
      REMARQUE : La température dépend des conditions du processus à simuler et peut être modifiée si nécessaire. En fonction de l’espèce lipidique dans le modèle, définissez la température au-dessus de la température de transition des composants lipidiques purs avant d’exécuter la simulation.
  6. Téléchargez les fichiers résultants et transférez-les vers le cluster d’ordinateurs.
    1. Visualisez le système final sur un logiciel de votre choix, tel que VMD ou PyMol, et vérifiez qu’il est correctement configuré.
      REMARQUE : Il est bon de vérifier, par exemple, qu’il y a suffisamment d’eau autour de la membrane pour que les lipides n’interagissent pas avec les atomes de l’image pendant la simulation, et une configuration correcte du feuillet (une bicouche sans espace ni eau entre les deux).

2. Exécution de simulations MD

  1. Téléchargez et décompressez les fichiers de C-GUI sur votre cluster informatique. Accédez au répertoire Gromacs . Créez un script de soumission de relaxation.
  2. Suivez les instructions du cluster pour le format d’un script de soumission.
    1. Copiez les commandes répertoriées jusqu’à ce qu’elles se trouvent juste au-dessus du commentaire # Production dans le fichier README dans le script de soumission.
      REMARQUE : Cette valeur par défaut de C-GUI est une boucle qui exécute une relaxation en 6 étapes du système. Si vous souhaitez un protocole différent et bien établi, modifiez-le pour lire les coordonnées qui viennent d’être construites et téléchargées à partir de C-GUI.
  3. Envoyez le script de relaxation et vérifiez que tous les fichiers de sortie ont été téléchargés pour toutes les étapes avant de passer à l’exécution de production. Une fois l’opération terminée, recherchez les fichiers de sortie suivants de GROMACS, générés au cours de l’exécution en 6 étapes : *.log, *.tpr, *.gro, *.edr, *.trr / *.xtc
  4. Créez un script d’exécution de production.
    1. Utilisez l’un des exemples de commandes gmx grompp et gmx mdrun de l’une des étapes de relaxation comme modèle.
    2. Avant d’utiliser le script, assurez-vous de créer un fichier *.mdp contenant des options de simulation similaires à celles du fichier step7_production.mdp fourni.
      REMARQUE : Les options par défaut fournies sont standard pour les simulations de membranes ; Les durées sont indiquées en nm et le temps est donné en picosecondes ou nombre de pas (picosecondes / pas de temps d’intégration). Mettez à jour les nsteps pour qu’ils s’exécutent jusqu’à la longueur de simulation souhaitée (cela est égal à dt * nsteps) et nst[x,v,f]out pour mettre à jour la fréquence d’enregistrement des données en nombre d’étapes d’intégration. Pour l’étude de cas, définissez nsteps sur 250 000 000 pour une longueur de simulation de 500 ns (temps de simulation / pas d’intégration = 500 000 ps / 0,002 ps), et nst[x,v,f]out sur 50 000 pour enregistrer les données toutes les 100 ps
  5. Avant d’exécuter la simulation proprement dite, exécutez des études de référence pour déterminer la meilleure utilisation des ressources.
    1. Exécutez le système pendant 1 à 2 ns en utilisant un nombre différent de nœuds de calcul.
      REMARQUE : L’étude de cas ER a été soumise sur le cluster de calcul haute performance55 du centre de recherche computationnelle (CCR) de l’UB pour 2 ns, où les performances ont été testées pour 1 à 10 nœuds.
    2. Comparez les performances en ns/jour pour chaque paramètre afin de déterminer les ressources optimales pour l’exécution. Il est courant de sélectionner le nombre de nœuds qui permettent d’obtenir 75 à 80 % des performances maximales.
  6. Exécutez le cycle de production.
    1. Exécutez chaque système en trois exemplaires pour assurer la reproductibilité et effectuez une analyse statistique des données.
    2. Prolongez la trajectoire en fonction des benchmarks si le temps d’attente autorisé pour la soumission sur le cluster de calcul est écoulé. Utilisez les commandes gmx convert-tpr, puis gmx mdrun pour continuer la collecte de trajectoires.
      REMARQUE : Les options sont décrites dans la documentation GROMACS en ligne (https://manual.gromacs.org/).
    3. Dans le cas d’un système membranaire uniquement, vérifiez si le système a atteint l’équilibre en calculant l’aire par lipide au fil du temps. Si ce n’est pas le cas, prolongez la trajectoire de simulation.

3. Analyse de la trajectoire

  1. Visualisez le système avant d’effectuer l’analyse pour déterminer les molécules d’intérêt et la partie de la trajectoire destinée à la caractérisation.
  2. Compressez les fichiers de trajectoire bruts (*.trr) en changeant le format de fichier en *.xtc et/ou en sautant des images pour réduire la taille du fichier et faciliter un transfert plus efficace vers la station locale pour la visualisation et l’analyse.
    REMARQUE : Pour les grands systèmes à membrane, on peut choisir de retirer l’eau de la trajectoire pour réduire davantage la taille du fichier. Cela peut être fait avec des fichiers d’index sur GROMACS, des scripts TCL sur VMD ou des bibliothèques Python telles que MDAnalysis et MDTraj.
  3. Effectuez les analyses choisies pendant la partie équilibrée de la trajectoire, telle que déterminée à partir de la série chronologique de surface par lipide.
    REMARQUE : Reportez-vous à la discussion pour plus de détails sur les analyses membranaires typiques et sur la façon de les exécuter.

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Representative Results

Pour illustrer l’utilisation du protocole et les résultats qui peuvent être obtenus, une étude comparative pour des modèles membranaires pour le réticulum endoplasmique (RE) est discutée. Les deux modèles de cette étude étaient (i) le modèle PI, qui contient les quatre principales espèces lipidiques trouvées dans le RE, et (ii) le modèle PI-PS, qui a ajouté les espèces lipidiques anioniques phosphatidylsérine (PS). Ces modèles ont ensuite été utilisés dans une étude d’une protéine virale et de la façon dont elle interagit avec la membrane, l’intérêt sur la PS a été cité comme important pour l’activité de perméabilisation de la protéine virale23. Pour incorporer la variété dans les structures de queue lipidique, les compositions membranaires ont été définies comme DOPC :DPPE :CHOL :POPI (56 :22 :10 :12 mol%) et DOPC :DPPE :CHOL :POPI :DOPS (55 :21 :11 :9 :4 mol%).

Les membranes ont été générées avec CHARMM-GUI Membrane Builder. Pour accueillir les 4 espèces lipidiques différentes et plus tard la protéine, les membranes symétriques ont été réglées pour contenir 600 lipides/foliole. Les réglages recommandés dans le protocole ont été utilisés, avec une température de 303 K. Pour garantir l’indépendance des répliques, le processus de construction a été répété trois fois pour chaque modèle de membrane, ce qui a donné lieu à un mélange aléatoire différent de lipides à chaque fois. Après la construction des systèmes, les fichiers d’entrée ont été déplacés vers le cluster de calcul haute performance55 du centre de recherche computationnelle (CCR) de l’UB pour exécuter des simulations MD à l’aide de la version 2020.5 de GROMACS. Une fois le protocole de relaxation en 6 étapes terminé, l’analyse comparative n’a été effectuée que sur un seul système par modèle (Figure 3), car le nombre d’atomes est similaire pour toutes les répliques. Les 75 % de la performance maximale étaient de ~78 ns/jour, par conséquent, au maximum 6 nœuds ont été demandés sur le cluster pour les cycles de production. Chaque réplica a été exécuté jusqu’à 500 ns en définissant nstep = 25 x 107 dans le fichier *.mdp et en soumettant les extensions au cluster selon les besoins en fonction des benchmarks.

Figure 3
Graphique 3. Exemples d’exécutions de référence. Utilisé pour déterminer les performances du modèle PI (315 000 atomes). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La surface par lipide (APL) de chaque réplique est illustrée à la figure 4. Celle-ci a été calculée à partir des dimensions XY de la boîte de simulation stockée dans le fichier de sortie de simulation *edr de GROMACS à l’aide du programme intégré d’énergie. Ensuite, la surface totale a été divisée par le nombre de lipides totaux par feuillet pour fournir une estimation de l’APL dans chaque modèle. Pour tous les systèmes, l’équilibration a été déterminée comme le point où l’APL atteint un plateau et fluctue autour d’une valeur constante. Dans tous ces systèmes, l’équilibre est atteint dans les 100 premiers ns de trajectoire (voir Figure 4). Sur la base de cette mesure, des trajectoires de 500 ns ont été jugées suffisantes pour ces systèmes. Toutes les autres analyses sur ces bicouches ont été effectuées sur les 400 dernières ns de trajectoire, connues sous le nom de phase d’équilibre ou de production. Pour déterminer l’incertitude de chaque valeur calculée, il est recommandé d’effectuer une moyenne de blocs tous les 10 à 20 ns. D’après l’analyse APL, le modèle membranaire PI-PS a, en moyenne, une surface supérieure de 0,7 Å2 à celle du modèle PI.

Figure 4
Graphique 4. Exemples de surface par lipide. (A) Modèles PI et (B) PI-PS. Les réplications 1, 2 et 3 de chaque modèle sont affichées en rouge, bleu et vert. L’équilibration pour tous les systèmes se produit dans les 100 premières ns. L’incertitude est exprimée comme l’erreur-type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

De plus, deux analyses simples sur la structure membranaire sont présentées. La figure 5 montre l’épaisseur de la membrane, estimée par la distance entre le centre de masse (COM) des atomes de phosphate des phospholipides dans les feuillets supérieur et inférieur. Ceci a été calculé à l’aide du programme de distance de GROMACS, qui nécessite un fichier d’index qui répertorie deux groupes d’atomes, un pour les groupes phosphate dans la foliole supérieure et un autre groupe pour ceux dans la foliole inférieure. Les résultats montrent une différence statistique entre les épaisseurs des deux modèles de membrane, illustrant une relation inverse entre l’APL et l’épaisseur de la membrane. Enfin, la figure 6 montre les paramètres d’ordre du deutérium de chaque espèce lipidique, une mesure qui quantifie l’ordre des queues lipidiques au sein du noyau hydrophobebicouche 56. Les queues d’acides gras sont classées en sn1, celui attaché à l’oxygène terminal du squelette glycérol, et sn2, attaché à l’oxygène central du groupe glycérol. Les résultats montrent qu’il n’y a que peu ou pas de différence entre l’ordre des queues lipidiques entre les modèles, à l’exception du DPPE qui montre une légère augmentation de l’ordre de la queue sn1 dans le modèle PI.

Figure 5
Graphique 5. Exemples d’épaisseur de membrane. (A) Modèles PI et (B) PI-PS. Les réplications 1, 2 et 3 de chaque modèle sont affichées en rouge, bleu et vert. L’incertitude est exprimée comme l’erreur-type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Graphique 6. Exemples de paramètres d’ordre du deutérium. (A) DOPC, (B) DPPE, (C) POPI, et (D) DOPS. Lignes pleines pour sn1, lignes pointillées pour sn2, modèle PI en rouge et modèle PI-PS en bleu. L’incertitude est exprimée comme l’erreur-type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des modèles membranaires complexes peuvent être utilisés pour étudier la pertinence d’espèces lipidiques spécifiques et la manière dont celles-ci modulent les interactions des biomolécules avec la membrane. Des études d’échantillons en laboratoire montrent : (1) que la composition membranaire module les interactions des protéines19, et (2) que la saturation de la queue lipidique et la charge de surface de la membrane ont un impact sur la perméation et l’organisation latérale des petites molécules17,57. En utilisant le protocole décrit ci-dessus et une analyse similaire à celle présentée dans les paragraphes précédents, les travaux de Li et al. fournissent des informations issues de l’expérience et de la simulation sur l’interaction entre le D112, un agent potentiel de thérapie photodynamique, et différents mélanges lipidiques17. Une bicouche avec des lipides PC et PS a été examinée dans une expérience pour caractériser la partition de D112 dans la bicouche. Nous avons effectué des simulations de différentes rations de lipides PC et PS, avec des longueurs de queue d’acides gras et une saturation variables, c’est-à-dire un nombre de doubles liaisons, afin de déterminer l’effet de la charge de surface et de l’environnement hydrophobe sur l’interaction D112-membrane. Alors que les interactions électrostatiques entraînent la liaison initiale de D112 aux lipides anioniques du PS, les interactions hydrophobes attirent la molécule dans le noyau de la membrane via deux mécanismes possibles (voir Figure 7A-B). À l’intérieur de la membrane, D112 se localise préférentiellement dans les domaines riches en PC, soit sous forme de monomère, soit sous forme de dimère.

Figure 7
Graphique 7. Système d’échantillonnage supplémentaire suivant le protocole présenté. Simulations de D112 avec des membranes modèles identifiant deux mécanismes d’insertion (A) harpon et (B) retournement ; (C) l’orientation des dimères D112 ; et (D) la distribution latérale des molécules D112 (cartes de contour bleues) sur un modèle membranaire par rapport aux lipides chargés (amas orange). L’étude complète se trouve dans 17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les techniques expérimentales permettent de visualiser les biomolécules à haute résolution à l’aide de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM)58, des techniques de fluorescence et de la microscopie à force atomique (AFM)59. Cependant, il est difficile de saisir l’interaction et la dynamique des interactions moléculaires qui sous-tendent les voies biologiques, la pathogenèse de la maladie et l’administration thérapeutique au niveau atomique ou des acides aminés. Ici, les capacités des simulations de DM pour étudier les membranes lipidiques et les principales étapes de la conception, de la construction, de l’exécution et de l’analyse de ces systèmes ont été discutées. L’avantage de cette méthode de calcul réside dans le détail atomistique et les équations sous-jacentes qui modélisent les interactions moléculaires pour proposer et caractériser les mécanismes moléculaires à l’interface de la membrane.

Une étape cruciale lors de la simulation des membranes cellulaires est une solide compréhension du système biologique à étudier. Les espèces lipidiques à inclure dépendent de l’organisme, du compartiment cellulaire et, surtout, du processus à étudier. Les simulations avec des membranes symétriques sont un bon point de départ pour les utilisateurs débutants de MD. L’asymétrie, bien qu’il s’agisse d’une caractéristique connue des membranes telles que les PM, ajoute des difficultés potentielles car elle nécessite des temps de simulation plus longs pour échantillonner correctement la diffusion latérale et l’échange de stérols entre les feuillets. L’asymétrie introduit également un décalage dans l’APL de chaque feuillet qui doit être traité avec soin dans la simulation52,53. Une autre étape importante consiste à déterminer la taille du patch membranaire à simuler, qui dépend de la complexité du mélange lipidique et des ressources de calcul disponibles ; Les patchs de membrane plus grands prennent plus de temps de calcul, ce qui n’est pas toujours faisable. Une taille d’au moins 150 lipides/foliole pour les systèmes homogènes ou binaires, et jusqu’à 600 lipides/foliole pour les compositions plus complexes sont recommandées. Si le modèle membranaire est utilisé pour des études protéine-membrane, une bonne règle de base est de créer un patch membranaire qui peut accueillir entre 2 et 3 fois la dimension la plus longue de la protéine. Lors de l’examen de petites molécules, la couverture de la taille du patch doit rester inférieure à 30 % à 40 % pour éviter les effets de taille finie. Selon la métrique permettant de déterminer l’équilibre, les mélanges lipidiques complexes peuvent facilement nécessiter des temps de simulation au moins 3 fois plus longs que les mélanges lipidiques purs ou binaires.

Il existe plusieurs options pour configurer les coordonnées initiales pour les simulations biomoléculaires. Les progiciels les plus courants incluent GROMACS36, VMD 42, PACKMOL60, Moltemplate 61 et CHARMM-GUI 62. C-GUI est une plate-forme web conçue pour faciliter la construction de ces systèmes, avec une grande variété de molécules dans sa bibliothèque de lipides. Il fournit des fichiers d’entrée pour différents moteurs MD et paramètres de champ de force, ce qui en fait un excellent point de départ pour les débutants. Au cours des étapes de construction, C-GUI fournit des estimations de la surface par lipide pour les espèces lipidiques individuelles. Il est utile d’augmenter cette estimation de 10 à 15 % lors de la construction de mélanges lipidiques complexes (5+ espèces), en particulier si vous utilisez des stérols dans le modèle. Si un lipide d’intérêt n’est pas trouvé dans la bibliothèque C-GUI, on peut utiliser une structure lipidique proche comme espace réservé, puis modifier la structure à l’aide de scripts VMD ou Python après la construction et la relaxation initiale du système. Étant donné que C36m est un champ de force additif63, il n’y a généralement pas de reparamétrage nécessaire pour la structure lipidique mise à jour, à condition que tous les types d’atomes de la nouvelle molécule soient présents dans le champ de force. Il convient de noter que toutes les options disponibles sur C-GUI n’ont pas été couvertes dans ce protocole, mais celles qui sont pertinentes pour les débutants et celles qui sont conformes aux pratiques courantes dans le domaine ont été présentées ; Les options avancées ont été abordées et publiées par les développeurs54,62,64.

Les conditions de simulation telles que l’ensemble thermodynamique, la température et la pression dépendront de la nature de l’étude. Pour ce protocole, les conditions ont été conservées comme les conditions par défaut dans C-GUI, qui sont typiques pour les simulations membranaires en phase fluide. La phase gel n’est pas souhaitable pour modéliser les membranes biologiques, elle se produit en dessous de la température de transition des lipides, et elle est facile à reconnaître par l’alignement parallèle des queues lipidiques en biais. Cela peut changer selon les objectifs de l’étude ou selon les expériences des collaborateurs, le cas échéant. Au cours des essais MD, les paramètres typiques pour les bicouches membranaires sont les suivants : (1) pas de temps de 1 à 4 fs pour AA MD afin de capturer les mouvements vibrationnels les plus rapides des liaisons hydrogène-oxygène65 ; en règle générale, 2 fs sont utilisés pour la production, mais 1 fs est utilisé pendant les étapes de relaxation et de minimisation, et 4 fs peuvent être utilisés si HMR51 est utilisé ; (2) les fréquences d’enregistrement des données comprises entre 0,05 et 0,2 ns sont une pratique courante ; (3) Schéma de coupure de Verlet66, avec une coupure douce et dure de 1,0 et 1,2 nm pour les interactions de van der Waal. La définition d’un rayon de coupure plus grand réduit les performances de simulation, car davantage d’interactions sont calculées entre les paires d’atomes. cependant, une coupure plus grande est nécessaire pour calculer les profils de pression latérale, qui nécessitent généralement des coupures de 2,0 à 2,4 nm ; (4) le schéma67 de maillage de particules Edward (PME) avec une coupure de 1,2 nm est utilisé pour les interactions électrostatiques à longue portée ; (5) l’algorithme LINCS68 est utilisé dans GROMACS pour contraindre les liaisons hydrogène ; (6) un régulateur de pression courant est le barostat de Parrinello-Rahman appliqué de manière semi-isotrope pour les bicouches ; (7) un régulateur de température courant est le thermostat Nose-Hoover. Il est à noter qu’il existe plusieurs types de barostats et de thermostats qui peuvent être utilisés en simulation et qui dépendent de la nature de l’étude69.

L’APL, l’épaisseur de la membrane et la bascule des stérols sont des mesures courantes pour déterminer si un système a atteint l’équilibre thermique, qui peut aller de 50 ns pour les bicouches pures à 4000 ns pour les mélanges asymétriques complexes en fonction de la métrique choisie. L’analyse des propriétés mécaniques, structurelles et dynamiques de la bicouche doit être calculée après que l’équilibre soit atteint, c’est-à-dire une fois que la propriété d’intérêt atteint un plateau et fluctue par rapport à une valeur moyenne. La partie équilibrée de la trajectoire, également connue sous le nom de phase de production, doit avoir une longueur d’au moins 100 ns pour permettre une analyse statistique et des estimations d’incertitude appropriées. Les propriétés membranaires courantes qui peuvent être calculées à partir de la simulation comprennent, sans s’y limiter, les paramètres d’ordre du deutérium, les profils de densité électronique, les fonctions de distribution radiale, les angles d’inclinaison des queues ou des groupes de tête lipidiques, le module de compressibilité, les temps de relaxation de la rotation des lipides, le module de flexion, les profils de pression latérale, les modèles d’agrégation des lipides et la dynamique de l’eau près de l’interface de la membrane35,70, n° 71 ; une revue de Moradi et al. décrit certains d’entre eux plus en détail70. Ces analyses peuvent être effectuées à l’aide d’outils d’analyse intégrés de GROMACS et VMD, ou à l’aide de scripts Python, Bash ou TCL. Il existe également de nombreuses bibliothèques Python open-source telles que MDAnalysis 72,73, MDTraj 74, Pysimm 75, Pyemma 76 et PyLipID 77 qui facilitent l’analyse des trajectoires de simulation.

Ce protocole est axé sur une approche entièrement atomique, ce qui est exigeant en termes de calcul si l’objectif d’une étude est de caractériser la dynamique de grandes protéines interagissant avec de grandes plaques membranaires. Néanmoins, l’augmentation de la puissance de calcul et l’utilisation de processeurs d’unités graphiques (GPU) ont favorisé les simulations de systèmes plus grands. Les simulations de DM nécessitent un échantillonnage suffisant des conformations du système pour calculer des moyennes de propriétés qui reproduisent avec précision les valeurs expérimentales. La modélisation membranaire réaliste vise à reproduire un environnement mécanique et structurel précis pour la membrane cellulaire d’intérêt, ce qui a un impact direct sur l’interaction d’autres biomolécules et facilite l’échantillonnage d’événements rares78,79,80. Lors de l’interprétation des données, il faut veiller à valider les observations avec des tendances expérimentales ou des valeurs réelles pour des systèmes similaires afin de vérifier que les systèmes modèles ne sont pas seulement un artefact de la simulation ou ne constituent pas des événements non physiologiques78. En conclusion, les simulations MD sont un modèle puissant pour examiner les interactions moléculaires basées sur la thermodynamique statistique. Les simulations de DM peuvent être utilisées pour examiner les effets de la diversité lipidique sur les propriétés structurelles et mécaniques des membranes, ce qui entraîne à son tour différentes interactions avec les biomolécules au cours des processus cellulaires. Le protocole offre une approche conviviale pour les débutants pour concevoir, construire, exécuter et analyser des systèmes complexes de membranes lipidiques. Ces étapes servent à simuler des systèmes membranaires uniquement ainsi que des protéines ou de petites molécules proches de l’interface membranaire.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts divergents à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Jinhui Li et Ricardo X. Ramirez pour leurs trajectoires de simulation et leurs discussions lors de la rédaction de ce manuscrit. O.C. a bénéficié du soutien de la bourse présidentielle de l’Université de Buffalo et de la subvention de formation 1T32GM144920-01 de l’Initiative for Maximizing Student Development de l’Institut national de la santé, attribuée à Margarita L. Dubocovich (PI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaconda3 Anaconda Inc (Python & related libraries) N/A
CHARMM-GUI.org Im lab, Lehigh University N/A
GROMACS GROMACS development team N/A
Linux HPC Cluster UB CCR N/A
MATLAB MathWorks N/A
VMD Theoretical and Computational Biophysics Group N/A

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Campbell, O., Le, V., Aguirre, A.,… More

Campbell, O., Le, V., Aguirre, A., Monje-Galvan, V. Realistic Membrane Modeling Using Complex Lipid Mixtures in Simulation Studies. J. Vis. Exp. (199), e65712, doi:10.3791/65712 (2023).

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