Summary
该协议描述并比较了将hiPSC分化为间充质基质细胞（MSCs）的两种代表性方法。单层法的特点是成本更低，操作更简单，更容易成骨分化。胚状体（EBs）方法的特点是时间消耗更短。
Abstract
间充质基质细胞（MSCs）是成体多能干细胞，在再生医学中得到了广泛的应用。由于体细胞组织来源的 MSC 受到有限捐赠、质量差异和生物安全性的限制，过去 10 年中，从人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 中产生 MSC 的努力大幅增加。过去和最近将hiPSCs分化为MSCs的努力都集中在两种培养方法上：（1）胚状体（EBs）的形成和（2）单层培养的使用。该协议描述了从hiPSCs中提取MSC的这两种代表性方法。每种方法都有其优点和缺点，包括时间、成本、细胞增殖能力、MSC标志物的表达及其 体外分化能力。该协议表明，这两种方法都可以从hiPSCs中获得成熟且功能性的MSC。单层法的特点是成本更低、操作更简单、更容易成骨分化，而EB法的特点是时间消耗更短。
Introduction
间充质基质细胞 （MSC） 是中胚层来源的成体多能干细胞1。间充质干细胞存在于几乎所有结缔组织中2.自 1970 年代首次发现 MSC 并于 1987 年由 Friedenstein 等人成功从骨髓中分离出来 3,4,5 以来，各种人类体细胞（包括胎儿和成人）组织已被用于分离 MSC，例如骨骼、软骨、肌腱、肌肉、脂肪组织和造血支持基质 1,2,6,7.间充质干细胞表现出高增殖能力和可塑性，可分化为许多体细胞谱系，并可迁移到受伤和发炎的组织 2,8,9。这些特性使间充质干细胞成为再生医学的潜在候选者10.然而，体细胞组织来源的 MSC （st-MSCs） 受到有限的捐赠、有限的细胞增殖能力、质量差异以及可能从捐赠者传播病原体（如果有的话）的生物安全问题的限制11,12。
人诱导多能干细胞 （hiPSC） 来源于具有转录因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）的成体细胞重编程，其功能与胚胎干细胞相似13,14。与st-MSCs相比，iPSC-MSCs具有无限供应、成本更低、纯度更高、质量控制方便、易于规模化生产和基因修饰等优点15,16,17。
由于 iPSC-MSC 的这些优势，已经报道了多种从 iPSC 驱动 MSC 的方法。这些分化方法以两种培养方法为中心：（1）胚状体（EBs）的形成和（2）使用单层培养物11,18,19,20。在此，对两种方法中的每一种都具有代表性的方法进行了表征。此外，还访问了两种基于时间、成本、增殖能力、MSC生物标志物表达和体外分化能力的代表性方法之间的比较。
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Protocol
1. hiPSCs维持
- hiPSC的解冻
- 从液氮中取出细胞，在37°C水浴中快速解冻细胞。将解冻细胞转移到用 3 mL iPSC 维持培养基制备的 15 mL 管中（材料表）。轻轻混合培养基。
- 以300 ×g 离心5分钟。除去上清液，轻轻将细胞重悬于含有 10 μM Y-27632 的 1 mL iPSC 维持培养基中（上下移液细胞 2-3 次）。
- 将细胞悬浮液转移到涂有生长因子降低 （GFR） -细胞外基质凝胶 （1：100） 和 2 mL iPSC 维持培养基的 6 孔组织培养板中，预先添加 10 μM Y-27632（约 4 x 104 个细胞/cm2）。
- 将细胞在37°C，5%CO2 下培养5-6天（80%-90%汇合度），每天更换iPSC维持培养基。
- hiPSC的通过
- 从 6 孔板中取出 iPSC 维持培养基。用DPBS洗涤hiPSC一次。
- 加入 700-800 μL 0.48 mM EDTA 溶液，在室温 （RT） 下孵育 1 分钟，然后取出消化溶液。继续在37°C温度下孵育3-5分钟。
- 当细胞消化成片状（不要将细胞消化成单细胞）时，加入 1 mL 含有 10 μM Y-27632 的 iPSC 维持培养基以终止消化。小心地上下移液细胞 2-3 次。
- 将细胞悬液转移到涂有生长因子减少 （GFR） -细胞外基质凝胶 （1：100） 和 2 mL iPSC 维持培养基的 6 孔组织培养板中，预先添加 10 μM Y-27632。
注：传代比范围为1：6至1：20（约4×104 个细胞/cm2），平均聚集大小约为50-200μm。 - 将细胞培养至80%-90%汇合（5-6天），在37°C，5%CO2 下每天更换iPSC维持培养基。
2. 通过EB形成从hiPSCs分化
注：该方法源自先前文献21,22,23,24。该方法的概述如图1所示。该方法的特点总结于表1。
- 培养基的制备
- 通过添加 1% （v/v） GlutaMAX、10% （v/v） FBS、10 ng/mL FGF2 和 5 ng/mL TGFβ 的 α-MEM 来制备 MSC 分化培养基。
- 通过向 α-MEM 补充 1% （v/v） GlutMAX、10% （v/v） FBS 和 1 ng/mL FGF2 来制备 MSC 维持培养基。
- hiPSCs的制备
- 在37°C，5%CO2 直至80%-90%汇合度的6孔组织培养板上，在涂有生长因子还原（GFR） - 细胞外基质凝胶（1：100）的iPSC维持培养基中培养hiPSCs系（解冻后至少传代2-3次）。
- 第 0 天：EB 形成
- 从 6 孔板中取出 iPSC 维持培养基。用DPBS洗涤hiPSC一次。
- 加入 700-800 μL 0.48 mM EDTA 溶液，在室温下孵育 1 分钟，然后取出消化溶液。继续在37°C温度下孵育3-5分钟。
- 当细胞消化成片状（不要将细胞消化成单细胞）时，加入 2 mL iPSCs 维持培养基（含有 10 μM Rock 抑制剂和 1：100 GFR-细胞外基质凝胶）以终止消化。
- 将细胞转移到 6 孔低附着板上。以 2 孔组织培养板与 1 孔低附着板的比例接种细胞。将细胞在37°C，5%CO2 的振荡器（60rpm / min）中孵育24小时以形成球形EB。
- 第 1 天至第 7 天：EB 分化
- 用巴斯德移液管将EB转移到离心管中（不破坏EB），并让EB在室温下自然沉淀5-10分钟。然后，除去上清液。
- 将 EB 转移到装有 2 mL MSC 分化培养基的 6 孔低连接板中。在37°C，5%CO2 的振荡器上培养EB7天，培养基更换一次。
- 第 8 天至第 17 天：EB 接种
- 用巴斯德移液管将EB转移到离心管中（不破坏EB），让EB自然沉淀5-10分钟。然后，除去上清液。
- 将 EB 转移到含有 2 mL MSC 维持培养基的 GFR-细胞外基质凝胶包被的 6 孔板中。培养至90%汇合（~10天），细胞粘附后定期更换培养基。
- 第 18 天至第 27 天：间充质干细胞的成熟和扩增
- 用37°C解离溶液处理EB衍生的培养物5-10分钟（消化时间因存在不同的细胞类型而变化）。
- 当部分细胞消化成单细胞时，加入 2 mL MSC 维持培养基以终止消化并将细胞悬液转移到离心管中。用DPBS洗涤剩余的未消化细胞一次，然后再次消化。重复几次，直到所有细胞都消化成单个细胞。将细胞悬浮液以250× g 离心5分钟，然后除去上清液。
- 将细胞接种在明胶包被的培养板（约2×105 个细胞/ cm2）上。在MSC维持培养基中培养至90%汇合，定期更换培养基。此时将这一代细胞指定为传代 0 （P0）。
- 为了使MSC纯度和成熟，在大约6天内继续以1：3的分裂比传代细胞两次。大多数细胞呈现成纤维细胞样形态（纺锤形）。
3. 通过单层培养从hiPSCs分化MSCss
注：该方法源自先前文献25,26,27,28。此方法的概述如图 1 所示。该方法的特点总结于表1。
- 培养基的制备
- 通过在 α-MEM 中补充 1% （v/v） GlutMAX、10% （v/v） FBS 和 1 ng/mL FGF2 来制备 MSC 维持培养基。
- hiPSCs的制备
- 在6孔组织培养板上，在涂有生长因子减少（GFR）-细胞外基质凝胶（1：100）的6孔组织培养板上，在37°C，5%CO2 直至50%-60%汇合度的6孔组织培养板上培养hiPSCs系（解冻后至少传代2-3次）。
- 第 0 天至第 13 天：通过直接单层培养物进行分化
- 从 6 孔板中取出 iPSC 维持培养基。
- 直接加入2mLMSC维持培养基，并在37°C，5%CO 2下培养14天， 培养基每天更换。
- 第 14 天至第 35 天：间充质干细胞通过重复传代成熟
- 用解离溶液在37°C处理单层培养物5-10分钟（消化时间因存在不同的细胞类型而变化）。
- 当细胞消化成单细胞时，加入 2 mL MSC 维持培养基以终止消化并将细胞悬液转移到离心管中。用DPBS洗涤剩余的未消化细胞一次，然后再次消化。重复几次，直到所有细胞都消化成单个细胞。将细胞悬浮液以250× g 离心5分钟，然后除去上清液。
- 将细胞接种在明胶包被的培养皿（约2×105 个细胞/ cm2）上。在MSC维持培养基中培养至90%汇合，并定期更换培养基。此时将这一代细胞指定为传代 0 （P0）。
- 为了使MSC纯度和成熟，在大约18天内继续以1：3的分裂比传代细胞6次。大多数细胞呈现成纤维细胞样形态（纺锤形）。
4. 通过流式细胞术对hiPSC驱动的MSC进行表面抗原分析
注：与骨髓来源的 MSC 的表面抗原类似，hiPSC 驱动 MSC 表达 CD105、CD73 和 CD90，但不表达 CD45、CD3429。此外，hiPSCs可用作阴性对照细胞。通过流式细胞术对hiPSC驱动的MSC和hiPSCs进行表面抗原分析如 图2所示。
- 用37°C的解离溶液处理hiPSC驱动的MSC2-3分钟。用0.48mM EDTA解离试剂处理hiPSC，并在室温下孵育1分钟，然后取出解离试剂。继续在37°C温度下孵育3-5分钟。
- 当细胞消化成单细胞时，加入培养基（MSC维持培养基到MSCs，iPSC维持培养基到iPSCs）以终止消化。
- 将细胞悬浮液以350× g 离心5分钟，然后除去上清液。
- 用冷DPBS洗涤细胞一次，以350× g 离心5分钟，然后除去上清液。
- 以 10 x 106 个细胞/mL 的速度计数并重悬于冷的 10% FBS-DPBS （v/v） 溶液中，并将 100 μL/管的细胞悬液（1 x 106 个细胞/管）分配到 1.5 mL 离心管中。
- 将 5 μL 人 Fc 受体阻断溶液加入 100 μL 细胞悬液中。在室温下孵育 5-10 分钟以进行非特异性封闭。
- 以350× g 离心5分钟，除去上清液。用冷的2%FBS-DPBS（v / v）溶液洗涤细胞两次。
- 将细胞重悬于冷的 100 μL 2% FBS-DPBS （v/v） 溶液中。
- 向 100 μL 细胞中加入 5 μL（1 次测试）抗 CD34-FITC 和 5 μL（1 次测试）抗 CD45-APC
悬吊。向另一个 100 μL 细胞悬浮管中加入 5 μL（1 次测试）抗 CD73-APC、5 μL（1 次测试）抗 CD90-FITC 和 5 μL（1 次测试）抗 CD105-PE。向第三个 100 μL 细胞悬浮管中加入 5 μL 人 IgG1 同型对照 FITC、人 IgG1 同型对照 PE 和人 IgG1 同型对照 APC。在黑暗中在冰上孵育 15-20 分钟。同时，准备单染色珠。 - 用冷的2%FBS-DPBS（v / v）溶液洗涤细胞两次。
- 加入 300 μL 冷的 2% FBS-DPBS （v/v） 溶液以重悬细胞，并通过 200 目筛网过滤器过滤。
- 使用流式细胞术分析样品。分析用同种型对照抗体染色的细胞悬浮液并设置门。然后分析用靶抗体染色的细胞悬液。
5. hiPSC驱动间充质干细胞的成骨分化
注：驱动 hiPSC 的 MSC 具有成骨分化潜力（图 3A、B）。成骨分化的方案如下。
- 通过用 10% FBS、100 nM 地塞米松、10 mM β-甘油磷酸盐和 100 μM 抗坏血酸补充 α-MEM 来制备成骨诱导培养基。
- 将 1 x 105 个 MSC 接种到明胶包被的 48 孔板中并培养，直至其 60%-70% 汇合。
- 取出培养基并加入 0.3 mL 成骨诱导培养基。在37°C，5%CO 2下在成骨诱导培养基中培养细胞14天， 培养基每3天更换一次。
- 取出培养基并用 DPBS 洗涤一次。
- 加入 0.3 mL 4% PFA，并在室温下孵育 30 分钟。
- 去除 PFA。在室温下用 0.3 mL DPBS 冲洗细胞 10 分钟，并重复 3 次。
- 取出 DPBS，加入 0.2 mL 茜素红染色液，并在室温下孵育 30 分钟。
- 取出染色溶液，在室温下用0.3mL DPBS冲洗细胞10分钟，重复3次。
- 在光学显微镜下观察钙沉积的染色。
6. hiPSC驱动MSC的成脂分化
注：hiPSC驱动的MSC具有成脂分化潜力（图3C，D）。成脂分化的方案如下。
- 通过用 10% FBS、1 μM 地塞米松、1 μM IBMX、10 μg/mL 胰岛素和 100 μM 吲哚美辛补充 α-MEM 来制备成脂肪诱导培养基。通过用 10% FBS 和 10 μg/mL 胰岛素补充 α-MEM 来制备成脂肪维持培养基。
- 将 1 x 105 个 MSC 接种到明胶包被的 48 孔板中并培养，直到细胞密度达到 90%。
- 取出培养基并加入 0.3 mL 成脂诱导培养基。继续在37°C，5%CO2下在成脂诱导培养基中培养细胞4天。
- 取出培养基并加入 0.3 mL 成脂维持培养基。继续在成脂维持培养基中在37°C，5%CO2下培养细胞3天。
- 重复步骤6.3和6.4 2-3次，直到脂肪细胞分化和成熟。
- 取出培养基并用 DPBS 洗涤一次。
- 加入 0.3 mL 4% PFA，并在室温下孵育 10 分钟。取出 PFA 并用 DPBS 冲洗 2 次。
- 按照制造商的说明应用 Oli Red O 染色剂，并在光学显微镜下观察脂滴。
7. hiPSC驱动MSC的软骨分化
注：hiPSC驱动的MSC具有软骨生成分化潜力（图3E，F）。软骨分化的方案如下。
- 通过用 10% FBS、100 nM 地塞米松、1% 胰岛素-转铁蛋白硒 （ITS）、10 μM 抗坏血酸、1 mM 丙酮酸钠、50 μg/mL 脯氨酸、0.02 nM 转化生长因子 β3 （TGFβ3） 和 0.5 μg/mL 骨形态发生蛋白 6 （BMP-6） 补充 α-MEM 来制备软骨母细胞诱导培养基。
- 收集 2.5 x 105 个驱动 hiPSC 的 MSC，并以 150 x g 离心细胞 5 分钟，然后除去上清液。将细胞悬浮在 1 mL α-MEM 中，然后以 150 x g 离心 5 分钟。
- 除去上清液，将细胞悬浮在 0.5 mL 软骨诱导培养基中。将细胞以150× g 离心5分钟。
- 直接拧开盖子，在37°C，5%CO2下每3天更换一次软骨诱导培养基培养21天。在软骨分化期间，每天轻弹动离心管以悬浮软骨形成沉淀（不破坏软骨沉淀）。
- 取出上清液，用 0.5 mL PBS 洗涤两次。
- 加入 0.3 mL 4% PFA 并固定 24 小时。
- 石蜡包埋软骨形成颗粒，然后切片（3μm）。用甲苯胺蓝（1%）染色切片30分钟。
- 在光学显微镜下观察细胞外软骨细胞基质。
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Representative Results
按照方案（图1A），通过EB形成和单层培养方法将hiPSC分化为MSC。在分化过程中，细胞表现出不同的代表性形态（图1B，C）。
如 图1B所示，hiPSCs菌落在分化前表现出典型的致密形态，具有由紧密堆积的细胞组成的清晰边界。hiPSCs在振荡器上解离和培养24小时后形成的均匀球形EB。在MSCs分化培养基中培养的第1天至第7天，EB的光滑边缘变得粗糙，EB的体积变大。从第 8 天到第 17 天，将 EB 转移到 GFR-细胞外基质凝胶包被的 6 孔板后，EB 逐渐粘附在板上，许多贴壁单层细胞在 EB 周围扩散。当细胞在第 18 天达到 90% 汇合度时，将细胞消化并接种在明胶包被的培养板上。在第 19 天，细胞粘附并呈现多边形形状。连续，当细胞汇合90%时，它们被传代两次。衍生的间充质干细胞逐渐成熟，呈现典型的纺锤体形状，菌落呈漩涡状生长。
如 图1C所示，在用MSC维持培养基替换iPSC维持培养基24小时后，细胞体积增加并扩散到菌落周围。在 MSC 维持培养基中培养时，细胞逐渐增殖并形成多层贴壁细胞。在第 14 天，将细胞消化并接种在明胶包被的培养板上。在第 15 天，细胞粘附并呈现多边形形状。连续，当细胞汇合度达到 90% 时，细胞传代 6 次。衍生的间充质干细胞逐渐成熟，呈现典型的纺锤体形状，菌落呈漩涡状生长。
通过流式细胞术分析hiPSCs和hiPSC驱动的MSCs的表面抗原（图2）。如图 2C 所示，hiPSC 对 CD90 呈阳性，对 CD34、CD45、CD73 和 CD105 呈阴性。通过两种方法将 hiPSC 分化为 MSC 后，驱动 MSC 对 CD90、CD73 和 CD105 呈阳性，对 CD34 和 CD45 呈阴性（图 2A，B）。
通过成骨、成脂和软骨分化研究了hiPSC驱动MSCs的分化能力。如图3所示，两种方法的hiPSC驱动间充质干细胞均分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。单层法的hiPSC驱动MSC比EB法形成更多的钙沉积物（图3B）。两种方法在成脂分化和软骨分化能力方面无显著差异（图3D，F）。
通过连续传代培养检测hiPSC驱动MSCs的增殖能力。如 图3G所示，两种方法的hiPSC驱动MSCs均可传代20次以上，且仍能保持快速增殖能力。
表1所示的两种方法之间的比较基于分化时间、成本、细胞增殖能力、MSC标志物的表达及其体外分化能力。
图 1：通过 EB 形成法和单层培养法将 hiPSC 分化为 MSC。 （A） 示意图显示了通过 EB 形成和单层培养将 hiPSC 分化为 MSC。通过 （B） EB 形成和 （C） 单层培养从 hiPSC 衍生 MSC 期间关键噬菌体细胞的代表性形态。比例尺：300 μm 和 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：通过流式细胞术分析驱动 hiPSC 的 MSCs 表面抗原。 通过 （A） EB 形成和 （B） 单层培养的 iPSC 驱动 MSC 中 MSC 表面抗原的表达百分比。（C）以hiPSCs为阴性对照。间充质干细胞阴性标志物：CD34、CD45;间充质干细胞阳性标志物：CD73、CD90 和 CD105。hiPSCs阴性标志物：CD34、CD45、CD73和CD105;hiPSCs阳性标志物：CD90。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：hiPSC 驱动 MSC 的三线分化和增殖能力。 （A） 在成骨分化培养基中对驱动 hiPSC 的 MSC 的钙沉积物进行茜素红染色 2 周。比例尺：300μm。 （B） 通过 ImageJ 分析定量茜素红 S 染色。（C） 在成脂分化培养基中对驱动 hiPSC 的 MSC 脂滴进行 Oli 红 O 染色 2 周。比例尺：300μm。 （D） 通过 ImageJ 分析定量 Oli Red O 染色。（E） 细胞外软骨细胞基质的甲苯胺蓝染色。比例尺：300 μm 和 150 μm。 （F） 通过 ImageJ 分析定量甲苯胺蓝染色。（G） hiPSC驱动MSCs群体倍增时间计算。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 比较 | EB形成法 | 单层培养法 |
| 分化时间 | 27天 | 35天 |
| 成本 | 高 | 低 |
| 扩散速度 | 快 | 快 |
| 增殖能力 | ≥20通道 | ≥20通道 |
| MSC标志物的表达 | CD73/CD90/CD105阳性，CD34/CD45阳性 | CD73/CD90/CD105阳性，CD34/CD45阳性 |
| 差异化能力 | 成脂分化、软骨分化和成骨分化能力 | 成脂分化、软骨分化和更强的成骨分化能力 |
| 操作 | 复杂 | 简单 |
表1：将hiPSCs分化为MSCs的两种方法的特点。
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Discussion
在该协议中，检查了将hiPSCs分化为MSCs的两种代表性方法20,21,22,23,24,25,26,27,28,30。两种方法都能够从hiPSCs中衍生MSCs。通过细胞形态（图1）、表面抗原（图2）及其分化能力（图3）确认了hiPSC衍生的MSCs。
两种方法共享相同的 MSC 维持培养基，而 EB 方法还需要含有 TGF-β 和 FGF2 的 MSC 分化培养基。此外，EB 方法需要 6 个孔板的低附着力和一个可以放置在二氧化碳培养箱中的特殊振荡器。因此，EB法的成本高于单层法18,20。EB方法似乎比单层方法更复杂。然而，EB方法的分化时间较短，避免了多次传代富集MSCs。
我们发现EB法对环境条件的耐受性比单层法强。两种方法都受到 iPSC 状态、人为干扰和培养环境的影响11,20。然而，我们发现EB方法的成功率远高于单层方法。EB方法的关键阶段是从第1天到第7天的EB分化阶段。在第 1-7 天，如果 EB 逐渐变小或破裂，培养基中出现大量漂浮死细胞或形成空泡状 EB，则这些不合格的 EB 难以粘附在明胶板上，并且几乎没有贴壁细胞从 EB 中爬出。从第 1 天到第 7 天，合格的 EB 均匀且会略微扩大，其光滑的边缘逐渐变得粗糙，细胞突出。转移到明胶板上后，EBs迅速粘附在板上，许多贴壁单层细胞在EB周围扩散。如果 EB 在第 1-7 天合格，则很容易实现后续的分化。相比之下，单层方法在任何阶段都可能失败。从第 1 天到第 14 天，贴壁细胞可能会成片脱落，表明分化失败。正常情况下，贴壁细胞增殖并形成多层贴壁细胞。第14天后，单层方法仍然会失败，因为很少有细胞附着在培养皿上。在单层方法的第 0-13 天，我们在培养皿中观察到各种细胞形态。然而，EB方法在第8-17天的细胞形态是均匀的。与单层法相比，我们怀疑EB法更类似于胚胎发育过程，是一种更可控的程序化分化方法。
这两种方法都可以用于20多次传代，并且仍然保持快速增殖能力11。单层法的成骨分化钙沉积量多于EB法。必须使用干细胞特异性血清，以避免血清中的细胞因子对分化的影响。我们观察到，如果细胞密度太低，细胞会停止增殖。因此，在达到汇合后，细胞必须以 1：3 的分裂比传代。分化过程中未使用抗生素;因此，该实验装置必须严格遵守良好实验室规范 （GLP）。
总之，在该协议中测试的每种方法都有优点和缺点。这两种方法都可以从hiPSCs中产生MSC，选择取决于用户的要求。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们非常感谢毛和胡实验室的所有成员，无论是过去还是现在，都为这个项目进行了有趣的讨论和巨大的贡献。我们感谢国家儿童健康临床医学研究中心的大力支持。本研究得到了国家自然科学基金（U20A20351毛建华，82200784立丹胡）、浙江省自然科学基金（No.LQ22C070004 Lidan 胡）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
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