Summary
Здесь мы описываем простой протокол, который позволяет in vitro оценить обилие флуоресцентно меченных микроРНК для изучения динамики упаковки микроРНК и экспорта во внеклеточные везикулы (ВВ).
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) являются важными медиаторами клеточной коммуникации, которые секретируются различными клетками. Эти ВВ переносят биологически активные молекулы, включая белки, липиды и нуклеиновые кислоты (ДНК, мРНК, микроРНК и другие некодирующие РНК), из одной клетки в другую, что приводит к фенотипическим последствиям в клетках-реципиентах. МикроРНК (микроРНК) привлекли большое внимание из-за их роли в формировании микроокружения и в обучении клеток-реципиентов из-за их явной дисрегуляции и обилия в ВВ. Дополнительные данные указывают на то, что многие микроРНК активно загружаются в электромобили. Несмотря на эти четкие доказательства, исследования динамики экспорта и механизмов сортировки микроРНК ограничены. Здесь мы приводим протокол с использованием анализа EV-микроРНК методом проточной цитометрии, который может быть использован для понимания динамики загрузки EV-микроРНК и выявления механизмов, участвующих в экспорте микроРНК. В этом протоколе микроРНК, предварительно определенные для обогащения в ВВ и обедненные из донорских клеток, конъюгируются с флуорофором и трансфицируются в донорские клетки. Затем флуоресцентно меченные микроРНК проверяются на загрузку в ВВ и истощение клеток с помощью кОТ-ПЦР. В качестве средства контроля трансфекции и инструмента для стробирования трансфицированной популяции клеток используется флуоресцентно меченная клеточная РНК (с сохранением клеток и с истощением EV). Клетки, трансфицированные как EV-микроРНК, так и клеточной миРНК, оцениваются на флуоресцентные сигналы в течение 72 часов. Интенсивность флуоресцентного сигнала, специфичная для EV-микроРНК, быстро уменьшается по сравнению с клеточной микроРНК. Используя этот простой протокол, теперь можно оценить динамику загрузки микроРНК и определить различные факторы, ответственные за загрузку микроРНК в ВВ.
Introduction
МикроРНК (микроРНК) являются одним из наиболее хорошо охарактеризованных подмножеств малых некодирующих РНК, которые известны своей важнейшей ролью в посттранскрипционной регуляции генов. Экспрессия и биогенез большинства микроРНК следуют скоординированной серии событий, которые начинаются с транскрипции первичных микроРНК (при-миРНК) в ядре. После ядерной обработки микропроцессорным комплексом в микроРНК-предшественники (пре-микроРНК) пре-микроРНК экспортируются в цитоплазму, где подвергаются дальнейшей обработке эндонуклеазой РНКазы III, разделенной на 21-23 нуклеотидные зрелые дуплексымикроРНК 1. Одна из цепей обработанной зрелой микроРНК связывается с матричными РНК-мишенями (мРНК), что приводит к деградации или трансляционному подавлению мишеней2. Основываясь на плейотропной роли микроРНК в одновременной регуляции нескольких различных мРНК-мишеней, неудивительно, что экспрессия микроРНКжестко регулируется. Действительно, неправильное выражение способствует возникновению различных болезненных состояний, особенно при раке. Аберрантная экспрессия микроРНК не только представляет собой специфическую для заболевания сигнатуру, но и стала мишенью для прогностического и терапевтического потенциала 4,5,6. В дополнение к своим внутриклеточным ролям, микроРНК также выполняют неавтономные функции. Например, микроРНК могут быть селективно упакованы в ВВ донорскими клетками и экспортированы в реципиенты, где они вызывают различные фенотипические реакции в норме и физиологии заболевания 7,8,9.
Несмотря на четкие доказательства того, что ВВ-ассоциированные микроРНК являются функциональными биомолекулами, до конца не ясно, как определенные подмножества микроРНК нарушают регуляцию при таких болезненных состояниях, как рак, и как клеточные механизмы отбирают и сортируют микроРНК в Evs 10,11. Учитывая потенциальную роль EV-микроРНК в модуляции микроокружения, крайне важно определить механизмы, участвующие в экспорте отдельных микроРНК, чтобы полностью прояснить роль EV в межклеточной коммуникации и патогенезе заболевания. Понимание процесса высвобождения микроРНК в ВВ не только выявит важные медиаторы экспорта микроРНК, но и может дать представление о потенциальных терапевтических средствах. Чтобы достичь такого уровня знаний, необходимо адаптировать инструменты для точного ответа на эти новые экспериментальные вопросы. Действительно, количество исследований, в которых оцениваются электромобили, растет в геометрической прогрессии из-за внедрения новых методов и средств контроля12,13. Что касается оценки обилия экспортируемых микроРНК в ВВ, то в настоящее время стандартными инструментами являются секвенирование нового поколения и количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР). Несмотря на то, что эти инструменты полезны для оценки количества микроРНК в ВВ, существуют ограничения на их чувствительность и специфичность, и использование этих статических подходов для оценки динамики недостаточно. Определение динамики экспорта микроРНК в ВВ требует комбинации специализированных инструментов. Здесь мы представляем комплексный протокол с использованием флуоресцентно конъюгированных микроРНК для анализа динамики высвобождения микроРНК из донорских клеток и встраивания в ВВ. Мы также обсудим преимущества и ограничения метода и дадим рекомендации по оптимальному использованию. Универсальный метод, представленный в этой статье, будет полезен исследователям, заинтересованным в изучении высвобождения микроРНК в ВВ и их потенциальной роли в клеточной коммуникации и заболеваниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве предварительного условия для использования этого метода требуется идентификация и валидация селективно экспортируемых микроРНК. Поскольку различные клеточные линии различаются в зависимости от груза микроРНК, отсортированного по их ВВ, рекомендуется, чтобы интересующая клеточная линия и связанные с ней ВВ были оценены на наличие микроРНК перед использованием. Кроме того, трансфекция на основе липофектамина является одним из важнейших этапов протокола; Рекомендуется предварительно определить эффективность трансфекции до постановки эксперимента.
1. Выращивание клеток в культуре и трансфицирование клеток флуорофор-конъюгированной EV-микроРНК
- Планшет от 200 000 до 400 000 клеток в тройных лунках в 6-луночном планшете в соответствующей питательной среде. Аккуратно покрутите пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут слияния 70%-80%, примерно 24-48 ч.
- Для каждой лунки, подлежащей трансфицировке, разведите реагент для трансфекции в 100 мкл безсывороточной среды в пробирке микроцентрифуги в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация липидов должна быть определена для интересующей клеточной линии до этой настройки. - Для каждой лунки, подлежащей трансфицировке, разбавляют конъюгированную флуорофором EV-микроРНК (2 нМ) и клеточную микроРНК (2 нМ) отдельно в микроцентрифужной пробирке в 100 мкл среды, не содержащей сыворотки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем должен быть рассчитан на общее количество трансфицируемых скважин. В этом протоколе флуоресценцию оценивали в 7 временных точках; таким образом, общий объем составил 700 мкл для стадии 1.2 и 700 мкл для стадии 1.3. Кроме того, чтобы уверенно захватывать положительную флуоресцентную популяцию клеток, пользователь должен трансфицировать клетки нефлуоресцентной скремблированной микроРНК и установить ворота, исключающие эти клетки. - Добавьте разбавленную смесь РНК (с шага 1.3) к разбавленному реагенту для трансфекции (с шага 1.2) и осторожно перемешайте, перевернув пробирку 3-4 раза. Дайте комбинированной смеси липидов и РНК инкубироваться в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
- Извлеките обычную питательную среду из клеток и добавьте 800 мкл среды, не содержащей сыворотки, в каждую лунку. Аккуратно добавьте 200 мкл смеси липидов и РНК (с шага 1.4) по каплям в клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда Opti-MEM использовалась для трансфекции интересующей клеточной линии (клеток Calu6). Попробуйте добавить смесь липидов и РНК непосредственно в питательную среду, избегая добавления смеси к стенкам планшета.
2. Забор трансфицированных клеток в различные моменты времени для анализа флуоресценции
- Инкубируют трансфицированные клетки при 37 °C в течение 7 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки последовательной трансфекции обеих микроРНК (EV-miRNA и cell-miRNA) клетки отбирают из одной лунки через 3 ч после трансфекции для анализа флуоресценции с помощью проточного цитометра. - По истечении 7-часового инкубационного периода извлеките трансфекционный комплекс из лунок и замените его полной средой.
- Чтобы оценить 7-часовую временную точку, соберите клетки и промойте их три раза с помощью 1x PBS.
- При работе с адгезивными клетками добавьте 200 мкл трипсина в одну лунку и подождите, пока клетки отделятся от планшета. Переложите отделенные клетки в микроцентрифужную пробирку и гранулы путем центрифугирования при 200xg в течение 5 мин.
- Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, чтобы не повредить клеточную гранулу. Для первой промывки PBS повторно суспендируйте гранулы в ~500 мкл 1x PBS и повторите гранулирование, используя описанные выше этапы центрифугирования. Повторите промывку PBS еще два раза.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл 2% раствора параформальдегида (PFA) и оцените флуоресценцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления 2% PFA гранулы клеток можно хранить при температуре 4 °C в течение 3-4 дней.
- Соберите оставшиеся моменты времени, выполнив действия, описанные в разделе 2.3. Соберите все сохраненные гранулы клеток и выполните шаги, описанные в разделе 3.
3. Анализ сигналов клетки-микроРНК и EV-микроРНК в клетках методом проточной цитометрии
- Подготовьте клетки к анализу методом проточной цитометрии. Отфильтруйте суспензию ячейки от секции 2 до крышек сетчатого фильтра размером 35 мкм, которые являются частью трубок FACS из полистирола с круглым дном, чтобы удалить мусор и клеточные агрегаты, которые могут помешать анализу флуорофоров.
- Настройте прибор в соответствии с инструкциями по калибровке. Перед использованием включите проточный цитометр и дайте ему нагреться не менее 30 минут. Залейте жидкостную систему жидкостью для оболочки, проверьте и отрегулируйте лазерную юстировку.
- Запустите контроль качества для подтверждения жидкостей прибора. Загрузите сверхчистую фильтрованную воду в проточный цитометр и работайте с соответствующей скоростью потока в течение достаточного времени сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящий расход и время сбора данных будут зависеть от интересующего типа ячейки, сложности образца и желаемого качества данных. - Откройте программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии и проверьте работоспособность детектора и лазеров. Настройка параметров порога и напряжения для детектирования на основе интересующей клеточной линии и выбранных флуорофоров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех последующих экспериментов использовались ячейки Calu6.- Установите порог захвата сигнала для ячеек Calu6 на уровне FSC 5000. Выполните анализ для 1 x 104 ячеек для каждого повтора эксперимента.
- Чтобы учесть спектральное перекрытие между различными флуорофорами, используйте нетрансфицированные клетки и клетки, независимо трансфицированные только одним из флуорофоров, для настройки компенсационного контроля.
- Для обнаружения экспорта микроРНК используют кандидаты EV-микроРНК (miR-451a и miR-150), конъюгированные с Alexa-fluor 488, и контрольную клетку-микроРНК (cel-miR-67), конъюгированную с Cy3.
- Для каждой EV-микроРНК конъюгируйте флуорофор с 5'-концом 5p-цепи. Перед трансфекцией отжигают конъюгированную с флуорофором цепь до ее 100% комплементарной 3p-цепи.
- Для анализа экспрессии в трансфицированных клетках анализируйте образцы с использованием каналов FSC, SSC, FITC и PE, установленных на 258, 192, 269 и 423 единицы напряжения соответственно (рис. 1A, B).
- Введите отрицательный контрольный образец в проточный цитометр. Захват сигналов ячеек после определения интенсивностей прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) на пользовательском листе.
- На графике выберите FSC для оси X, SSC для оси Y и gate для интересующей совокупности, нарисовав вокруг нее многоугольник (см. рис. 1B, нижняя панель).
- Создайте новый график, используя закрытую популяцию.
- Установите ось X на флуоресцентный сигнал 1 (FS1) для обнаружения клеточной микроРНК, а ось Y на флуоресцентный сигнал 2 (FS2) для обнаружения EV-микроРНК. Настройте параметры компенсации для отдельных флуорофоров с помощью клеток, независимо трансфицированных каждой из флуоресцентно меченных микроРНК. На новом участке ворота на интересующее население.
- Для детектирования EV-микроРНК используют канал FITC. Для оценки сигнала клетка-микроРНК используют ПЭ-канал. В программном обеспечении создайте вентиль вокруг ячеек, которые были положительными как для FITC, так и для PE, нарисовав многоугольник вокруг популяции двойной флуоресценции, когда FITC был выбран для оси X, а PE был выбран для оси Y.
- Запишите статистику по закрытой популяции.
- Запишите процент клеток в закрытой популяции, которые являются положительными как для FITC, так и для PE, а также для тех, которые положительны для FITC или PE.
- Повторите описанные выше действия для любых дополнительных образцов или контрольных элементов в эксперименте.
4. Изоляция ВВ от трансфицированных клеток
- Для клеток, культивируемых в сывороточных средах, следует удалить ВВ из сыворотки, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
- Чтобы получить сыворотку с обедненным ВВ, разбавьте сыворотку до 50% в питательной среде для клеток, чтобы снизить вязкость, и центрифугируйте полученную 50%-ную сыворотку при 110 000 x g в течение 18 ч.
- Тщательно соберите надосадочную жидкость (сыворотку без EV) и отфильтруйте ее с помощью фильтра 0,2 мкм. Используйте полученную сыворотку 50% без EV для создания полной среды, в данном случае RPMI плюс 10% сыворотки.
- Чтобы собрать EV, добавьте в клетки полностью обедненную EV среду и соберите EV через 48 ч после инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, изложенный ниже, был изменен по сравнению с Kowal et al.14.
- Выращивают клетки в 15-сантиметровых чашках для культивирования тканей до 80% слияния. Трансфицируют клетки по отдельности клеточными микроРНК и EV-микроРНК в 10 мл Opti-MEM в соответствии с протоколом трансфекции в разделе 1 протокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не все протоколы трансфекции масштабируются линейно. Возможно, сначала необходимо адаптировать и оценить условия трансфекции в 15-сантиметровых пластинах. - Через 7 ч аспирируйте среду для трансфекции и замените ее средой с обедненным EV (15 мл). Выращивайте клетки в среде, обедненной электроэнергией, в течение 48 ч.
- Удалите кондиционированную среду из клеток и распределите ее в центрифужную пробирку объемом 50 мл внутри шкафа биобезопасности. Центрифугируйте кондиционированную среду при 2000 x g в течение 10 мин при 4 °C для удаления мертвых клеток и клеточного мусора. Переложите полученную надосадочную жидкость в свежую пробирку.
- Центрифугируют надосадочную жидкость при 10 000 x g в течение 40 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее с помощью фильтра 0,2 мкм.
- Перенесите отфильтрованную среду для клеточных культур в стерильную ультрацентрифужную пробирку внутри шкафа биобезопасности. Взвесьте и уравновешивайте трубки относительно друг друга. Отжим образцы при 110 000 x g в течение 90 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте гранулы в соответствующем объеме 1x PBS для промывки и центрифугирования при 110 000 x g в течение 90 мин 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула EV была ресуспендирована в 60 мл 1x PBS на основе максимального объема, разрешенного для трубок ротора с фиксированным углом, используемых в этом исследовании. - Аспирируйте PBS и суспендируйте гранулу EV в соответствующем объеме (50-100 мкл) свежего 1x PBS и вихри. Храните электромобили при температуре -80 °C для последующего использования.
5. Анализ сигналов клеточной микроРНК и EV-микроРНК в ВВ методом проточной цитометрии
- Чтобы приготовить суспензию ВВ для анализа проточной цитометрии, разведите ВВ в соответствующем объеме ультрафильтрованного 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем загрузки для анализа ВВ методом проточной цитометрии следует определять исходя из количества ВВ в образцах. Грубо говоря, если в суспензии EV ~30 000 частиц, конечный объем должен составлять ~500-600 мкл в 1x PBS. Чистый образец содержит около 35-50 частиц/мкл. - Используйте нанопроточный цитометр или альтернативное оборудование, достаточно мощное для анализа наноразмерных частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался нанопроточный цитометр Attune NxT. - Откройте программное обеспечение и настройте прибор в соответствии с рекомендациями по калибровке. Выполните тест производительности с помощью наношариков производительности. Если наношарики обнаружены в стандартном диапазоне размеров, производительность является оптимальной. Определите подходящий расход для обнаружения частиц EV.
- Проведите контроль качества с использованием сверхчистой фильтрованной воды для подтверждения жидкости прибора и производительности детектора и лазеров.
- Используя калибровочные шарики, подходящие для эксперимента, настройте проточный цитометр на точное обнаружение шариков разного размера и измерение сигналов флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для постановки анализа ВВ методом проточной цитометрии использовались гранулы ApogeeMix. Эти шарики содержат смесь нефлуоресцентных шариков кремнезема и флуоресцентных гранул полистирола размером от 80 нм до 1300 нм.- Настройте параметры для оценки чувствительности и разрешения различных популяций в смеси шариков в соответствии с протоколом производителя. Используйте соответствующее стробирование, чтобы устранить заполнение валика по шуму прибора.
- Тщательно перемешайте образцы, чтобы равномерно распределить электромобили перед загрузкой для анализа.
- Откройте программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии и введите ультрафильтрованный PBS. Настройте стробирование для частиц EV с помощью ультрафильтрованного PBS, убедившись, что стробирование соответствует соответствующему размеру частиц на основе гранул в шаге 5.5.
- Загрузите отрицательный контрольный образец для анализа EV при их прохождении через проточный цитометр. Захват сигналов EV при построении FSC по оси X и SSC по оси Y.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение SSC для захвата электромобилей было установлено на уровне 300. Объем сбора данных был установлен на уровне 95 мкл из общего объема в 145 мкл. Расход был установлен на уровне 12,5 мкл/мин. Анализ проводили с частицами 1 x 106 EV. Популяция электромобилей неоднородна, что приведет к тому, что некоторые обломки будут изолированы вместе с электромобилями. Общее обнаружение частиц на графике FSC и SSC выделяет частицы в различных диапазонах, что ожидаемо при использовании сырых препаратов EV. - Создайте новый график, используя закрытую популяцию.
- На этот раз выберите флуоресцентный сигнал 1 (FS1) для детектирования клеточной микроРНК по оси X и флуоресцентный сигнал 2 (FS2) для обнаружения EV-микроРНК по оси Y.
- Настройка параметров компенсации для флуорофоров с помощью образцов ВВ, выделенных из клеток, трансфицированных одной микроРНК. На новом участке ворота на интересующую вас популяцию электромобилей.
- Для анализа экспрессии флуорофор-конъюгированных микроРНК в ВВ, выделенных из трансфицированных клеток, анализируют образцы ВВ, используя каналы FSC, SSC, BL1 и YL1, настроенные на 370, 370, 400 и 400 единиц напряжения соответственно (рис. 2A, B).
- Записывайте статистику по закрытой популяции и визуализируйте ее с помощью гистограмм и точечных диаграмм.
- Повторите описанные выше действия для любых дополнительных образцов или контрольных элементов в эксперименте.
6. Валидация высвобождения микроРНК в ВВ с помощью кОТ-ПЦР
- Извлекайте РНК из электромобилей и родительских клеток с помощью набора для выделения РНК miRVana в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка РНК, выделенной из ВВ, невозможна, потому что общее количество РНК, выделенной из ВВ, обычно не превышает порог минимального количества стандартной нанокапли. Это связано с истощением рибосомной РНК в образцах EV, что может быть подтверждено с помощью биоанализатора Agilent. Таким образом, показатель целостности для количественной оценки EV-РНК обычно ненадежен и не является истинным представлением количества EV-РНК. Поэтому для количественного определения количественного определения EV-РНК и клеточной РНК методом кОТ-ПЦР использовали равные объемы изолятов РНК после выделения из равного количества клеток. Для нормализации кОТ-ПЦР использовали микроРНК, повсеместно присутствующие в нескольких образцах, что было определено по ранее полученным данным секвенирования РНК. - Преобразуйте выделенную РНК в кДНК с помощью набора обратной транскриптазы, специфичного для малых РНК.
- Настройте реакцию кОТ-ПЦР с использованием матрицы кДНК и микроРНК-специфичных праймеров в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для валидационных экспериментов для оценки экспрессии клеточной микроРНК и EV-микроРНК использовали набор для ПЦР с МНК и EV-микроРНК от производителя miRCURY LNA и соответствующие праймеры от производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы используем проточную цитометрию в качестве мощного инструмента для исследования высвобождения микроРНК из клеток в ВВ. С помощью этого протокола методом проточной цитометрии клеток, трансфицированных клеточными микроРНК и EV-микроРНК, выявлено последовательное снижение флуоресцентного сигнала, соответствующего EV-микроРНК, при этом сигнал, соответствующий клеточной микроРНК, сохранялся в клетках. Чтобы убедиться, что конъюгация флуорофора не влияет на высвобождение микроРНК в ВВ, miR-451a конъюгировали с двумя отдельными флуорофорами (т.е. Alexa fluor 488 и Alexa fluor 750) и оценивали удержание клеток. Результаты свидетельствуют о минимальной вариабельности между обнаружением отдельных сигналов флуорофора после трансфекции, что подтверждает надежность этого подхода (рис. 3A, B).
Поскольку потерю флуоресцентно меченого miR-451a из клеток можно объяснить различными причинами, включая деградацию РНК, было крайне важно убедиться, что клеточная потеря совпадает с численностью EV. С помощью проточной цитометрии накопление miR-451a, конъюгированного с Alexa fluor-488, наблюдалось в ВВ зависимым от времени образом, что свидетельствует об эффективной упаковке и возможном высвобождении микроРНК в ВВ. В отличие от этого, флуоресцентный сигнал, соответствующий клетке, сохранившей микроРНК, cel-miR-67, не был обнаружен в ВВ (рис. 4). Эти результаты с использованием этого нового подхода были подтверждены с помощью ОТ-ПЦР, которая выявила значительно более высокое соотношение экспрессии EV/клетки для miR-150, дополнительной EV-микроРНК, по сравнению с клеточной микроРНК, cel-miR-67 (рис. 5).
Рисунок 1: Настройка параметров проточного цитометра для детектирования сигналов в ячейках. (A) Для анализа флуоресценции клеток с помощью программного обеспечения были настроены выделенные напряжения для указанных параметров. Прибор был настроен на регистрацию 10 000 клеток на образец. Представление Inspector подтверждает параметры, настроенные для обнаружения и анализа. (B) Для анализа клеточной флуоресценции пороговое значение параметра FSC было установлено на уровне 5 000 на вкладке настроек цитометра программного обеспечения. На правой верхней панели отображаются настройки лазера для сбора данных. На нижних панелях отображается активный глобальный рабочий лист во время процесса обнаружения ячеек. Пробы были обработаны при среднем потоке и захвачены при установлении параметров FSC-A и SSC-A по осям X и Y соответственно. Стробирование было задано с помощью инструмента рисования полигона вокруг интересующей популяции. Стробирование может быть различным для другой интересующей клеточной линии в зависимости от разнообразия клеточной популяции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка параметров проточной цитометрии для детектирования сигналов в электромобилях. (A) Для обнаружения и последующего анализа ЭВ объем сбора данных был установлен на уровне 95 мкл при скорости потока 12,5 мкл/мин. Выбранный порог для обнаружения EV составил 0,3 x1000 на вкладке настроек прибора программного обеспечения на основе используемых калибровочных шариков. Напряжения для FSC, SSC, BL1 и YL1 составляли 370, 370, 400 и 400 В соответственно. (B) Настройка стробирования для захвата гетерогенной популяции EV и различения EV от фонового шума прибора. Пустой образец PBS (вверху) был использован в качестве отрицательного контроля для устранения фонового шума от популяции электромобилей. Выборка EV (внизу) показывает, что интересующая нас популяция составляет всего 1,8% от общей совокупности, поскольку выборка неоднородна с перекрывающимися частицами в диапазоне размеров. Тем не менее, было выбрано строгое стробирование, чтобы обеспечить обнаружение интересующей популяции электромобилей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Обнаружение сигнала в клетках с помощью проточной цитометрии. (A) Флуоресценция, соответствующая EV-микроРНК и клеточно-микроРНК, была обнаружена в клетках в период между 7 и 72 часами после трансфекции. Сигнал, соответствующий EV-miR-451a (Alexa fluor-488), со временем уменьшался по сравнению с сигналом от клеточной микроРНК cel-miR-67. (B) Флуоресценция, соответствующая EV-miR-451a, меченому Alexa fluor-750, показала ту же тенденцию, что и Alexa Fluro-488 с мечением miR-451a, что указывает на то, что флуорофор не влияет на удержание микроРНК клетками. В целом, репрезентативные результаты показывают, что трансфицированная микроРНК ведет себя аналогично эндогенной микроРНК на основе экспорта микроРНК в ВВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Детектирование сигналов в электромобилях с помощью проточной цитометрии. Флуоресценция, соответствующая EV-miR-451a и cell-cel-miR-67, была обнаружена в ВВ через 24 ч и 48 ч после трансфекции. Сигнал, соответствующий EV-miR-451a (Alexa fluor-488), был зафиксирован в EV через 48 ч после трансфекции. В отличие от этого, сигнал для cel-miR-67 не был обнаружен в электромобилях. Пустой образец PBS был использован для настройки стробирования для этого эксперимента, как показано на рисунке 2B. В качестве отрицательного контроля использовали образцы ВВ, выделенные из клеток, трансфицированных нефлуоресцентной скремблированной РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количественное определение EV-микроРНК и клеточно-микроРНК в клетках и ВВ с помощью ОТ-ПЦР. Клетки Calu6 трансфицировали 2 нМ miR-150 и cel-miR-67 каждая. ВВ собирали через 48 ч после трансфекции. Обогащение ВВ рассчитывали как отношение экспрессии ВВ, деленное на клеточную экспрессию в трансфицированных клетках Calu6 для miR-150 и cel-miR-67. Основываясь на результатах секвенирования РНК, сравнивающих экспрессию микроРНК в клетках Calu6 и соответствующих им EV, miR-30c был использован в качестве эндогенного контроля и нормализатора для расчета изменения складки. Представленные данные получены из одного биологического репликата, при этом каждая точка данных представляет собой тройную реакцию кОТ-ПЦР. Данные выражены в виде среднего ± SD, а p-значения вычислялись с помощью непарного t-критерия с поправкой Уэлча (**p < 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Сильные стороны | Слабые стороны |
| Позволяет одновременно оценивать селективный экспорт нескольких микроРНК в клетках и соответствующих ВВ | Требуют дополнительных процедур для дифференциации активного и пассивного экспорта |
| Оценка сырой гетерогенной популяции возможна и не требует предварительного разделения популяций ВВ. Может использоваться для анализа различных типов электромобилей ПРИМЕЧАНИЕ: Порог обнаружения различных типов частиц может варьироваться |
Низкая чувствительность не позволяет обнаружить ограниченные концентрации микроРНК в клетках или ВВ. Это можно преодолеть, включив последующий анализ qRT-PCR после выделения РНК из ВВ |
| Требует короткого времени на настройку и анализ по сравнению со стандартными методами, используемыми для количественного определения микроРНК | Отсутствие протоколов стандартизации для различных типов оборудования, клеточных линий и различных флуорофоров. |
Таблица 1: Основные сильные и слабые стороны протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Новый протокол позволяет фиксировать кинетику высвобождения микроРНК в ВВ после трансфекции ВВ-микроРНК. Подход позволяет проводить одновременный анализ нескольких EV-микроРНК и клеточных микроРНК при условии использования возможностей цитометра. Более того, несмотря на то, что анализ проточной цитометрии может дать ценную информацию о биологии микроРНК EV, он не лишен ограничений. Тем не менее, некоторые ограничения могут быть преодолены при использовании в сочетании с другими методами для более полного понимания.
Новой областью интереса в биологии ВВ является изучение селективного экспорта микроРНК в ВВ15,16. Несмотря на то, что этот протокол является мощным инструментом, позволяющим изучать селективный экспорт микроРНК, одной из важнейших проблем является различение активного и пассивного экспорта. Необходимо соблюдать осторожность, так как чрезмерная экспрессия микроРНК в достаточно высокой концентрации может изменить экспорт микроРНК, что потенциально может привести к неадекватной пассивной нагрузке. Таким образом, эксперименты по определению оптимальных трансфекционных концентраций микроРНК имеют решающее значение при изучении селективного экспорта.
Более того, протокол в сочетании с дополнительными методами, такими как анализ отслеживания наночастиц (NTA), позволяет исследователю оценить количество частиц EV, а также оценить высвобождение микроРНК и потенциально позволяет различать изменения в путях биогенеза EV и механизмы экспорта микроРНК. Это особенно важно в связи с тем, что посредники этих процессов накладываются друг на друга17. Учитывая, что микроРНК могут влиять на различные фенотипы, в том числе на те, которые участвуют в биогенезе ВВ, было бы разумно оценить количество частиц после трансфекции микроРНК18. Чтобы преодолеть это препятствие, другим вариантом было бы включение EV-микроРНК, которая остается неизменной в экспериментальных условиях, тем самым исключая факторы, участвующие в биогенезе EV, и выделяя пути, участвующие в экспорте EV-микроРНК.
В нескольких исследованиях количественно определяли микроРНК с помощью ОТ-ПЦР, стандартного метода количественного определения эндогенных микроРНК 10,11,16. Однако ему не хватает возможности динамически фиксировать высвобождение микроРНК в ВВ. При сравнении проточной цитометрии с ОТ-ПЦР они сильно различаются в зависимости от чувствительности и дизайна анализа. Несмотря на то, что кОТ-ПЦР является высокочувствительным методом и теоретически способен количественно определить минимальное количество копий микроРНК, для различения двух образцов требуется как минимум 2-кратная (100%) разница в количестве копий интересующих микроРНК. Проточная цитометрия, с другой стороны, улавливает различия на основе сигналов, основанные на обилии флуоресцентно меченных микроРНК, и может дифференцировать небольшие процентные изменения сигналов. Тем не менее, его низкая чувствительность ограничивает обнаружение микроРНК с ограниченным числом копий. Эти два метода синергетически дополняют друг друга при совместном использовании, как указано в протоколе.
Таким образом, этот протокол предлагает ценный инструмент для исследования селективной динамики экспорта микроРНК. Несмотря на вышеупомянутые проблемы, сила этого протокола заключается в его способности анализировать несколько микроРНК одновременно, что способствует лучшему пониманию биологии микроРНК, их экспорта и их роли в биологии ВВ. Основные сильные и слабые стороны протокола, которые необходимо учитывать, перечислены в таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признательны за поддержку и советы д-ру Джилл Хатчкрофт (Jill Hutchcroft), директору центра проточной цитометрии в Университете Пердью. Эта работа была поддержана R01CA226259 и R01CA205420 для A.L.K., премией Американской ассоциации пульмонологов (ANALA2023) IA-1059916 для A.L.K., грантом Purdue Shared resource facility P30CA023168 и флагманской докторской стипендией Фулбрайта, присужденной Государственным департаментом, США Его Святейшеству.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
