Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.
Abstract
A rede de microtúbulos é um componente essencial do sistema nervoso. Mutações em muitas proteínas reguladoras dos microtúbulos estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento e doenças neurológicas, tais como proteína Tau associada a microtúbulos a doenças neurodegenerativas, proteína cortadora de microtúbulos Spastin e Katanin 60 causam paraplegia espástica hereditária e anormalidades do neurodesenvolvimento, respectivamente. A detecção de redes de microtúbulos em neurônios é vantajosa para elucidar a patogênese de distúrbios neurológicos. No entanto, o pequeno tamanho dos neurônios e o arranjo denso dos feixes axonais de microtúbulos tornam a visualização das redes de microtúbulos um desafio. Neste estudo, descrevemos um método para dissecção da junção neuromuscular larval e células musculares, bem como imunomarcação de α-tubulina e proteína associada a microtúbulos Futsch para visualização de redes de microtúbulos em Drosophila melanogaster. A junção neuromuscular permite observar microtúbulos pré e pós-sinápticos, e o grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma clara visualização da rede de microtúbulos. Aqui, ao mutar e superexpressar Katanin 60 em Drosophila melanogaster, e então examinar as redes de microtúbulos na junção neuromuscular e células musculares, revelamos com precisão o papel regulatório de Katanin 60 no neurodesenvolvimento. Portanto, combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.
Introduction
Os microtúbulos (MTs), como um dos componentes estruturais do citoesqueleto, desempenham um papel importante em diversos processos biológicos, incluindo divisão celular, crescimento e motilidade celular, transporte intracelular e manutenção da forma celular. A dinâmica e a função dos microtúbulos são moduladas por interações com outras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin e Kinesin 1,2,3,4,5.
Nos neurônios, os microtúbulos são essenciais para o desenvolvimento e manutenção de axônios e dendritos. Anormalidades nos microtúbulos levam à disfunção e até mesmo à morte dos neurônios. Por exemplo, no cérebro de pacientes com Alzheimer, a hiperfosforilação da proteína Tau reduz a estabilidade da rede de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas6. Assim, o exame das redes de microtúbulos contribuirá para a compreensão do neurodesenvolvimento e da patogênese das doenças neurológicas.
A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse periférica formada entre um axônio terminal do neurônio motor e uma fibra muscular, que é um excelente e poderoso sistema modelo para o estudo da estrutura e funçõessinápticas7. Futsch é uma proteína de Drosophila homóloga à proteína de ligação a microtúbulos MAP1B encontrada em mamíferos8. É expressa apenas em neurônios e desempenha um papel no desenvolvimento dos botões sinápticos do NMJ 8,9. No tipo selvagem, feixes filamentosos que correm ao longo do centro dos processos NMJ são visualizados por imunomarcação com anti-Futsch. Ao atingir o final do NMJ, esse feixe tem a capacidade de formar uma alça constituída por microtúbulos ou de perder sua estrutura filamentosa, resultando em uma aparência difusa e puntiforme10. Alças de microtúbulos estão associadas a cones de crescimento pausados, o que sugere que a matriz de microtúbulos é estável11. Portanto, podemos determinar indiretamente o desenvolvimento de microtúbulos estáveis no NMJ pela coloração de Futsch. O grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma visualização clara da rede de microtúbulos. Os fatores que afetam a estabilidade da rede de microtúbulos podem ser encontrados através da análise da densidade e forma dos microtúbulos. Simultaneamente, o estado da rede de microtúbulos das células musculares pode ser verificado de forma cruzada com o resultado do NMJ para obter conclusões mais abrangentes.
Muitos protocolos têm sido empregados para investigar a rede e a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, essas pesquisas têm frequentemente se concentrado em estudos in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, alguns experimentos in vivo têm empregado microscopia eletrônica para detectar o citoesqueleto17. De acordo com a ligação específica de anticorpos fluorescentemente marcados ou corantes químicos a proteínas ou DNA, os métodos aqui apresentados permitem a detecção de redes de microtúbulos em NMJ em nível de neurônios individuais in vivo, com resultados corroborados por observações em células musculares. Este protocolo é simples, estável e repetível quando combinado com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila melanogaster, permitindo uma gama diversificada de exames fenotípicos e rastreios genéticos para o papel de proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso in vivo.
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Protocol
1. Dissecção de larvas
OBS: A solução dissecante salina hemolinf-símile (HL3.1)18 e a solução fixadora paraformaldeído (PFA) a 4%19,20 são utilizadas à temperatura ambiente, pois os microtúbulos se despolimerizam quando a temperatura é muito baixa.
- Escolha uma larva errante de3º ínstar com pinças longas e rombas. Lave-o com HL3.1 e coloque-o na placa de dissecção sob o estereomicroscópio.
NOTA: Larva errante de3º ínstar é identificada por espiráculo anterior ramificado e rasteja ao redor do tubo a aproximadamente 96 h (25 °C)21. - Posicione a larva com o lado dorsal ou ventral para cima. Identificar o lado dorsal pelas duas traqueias longas e o ventral pelas cintas denticulares abdominais.
- Dependendo do tecido a ser observado, opte pela dissecção dorsal ou ventral. Isso permitirá uma visão mais precisa e detalhada da área específica de interesse. Para observação do NMJ e das células musculares, abrir as regiões dorsal e ventral da larva, respectivamente.
- Fixe os ganchos da boca e a cauda. Ajuste os pinos para manter a larva em um estado prolongado. Adicione uma gota de HL3.1 à larva para evitar que seque.
NOTA: Ca2+ - HL livre 3.1 pode ser usado para minimizar a contração dos músculos durante a dissecção. - Use a tesoura dissecante para fazer um pequeno corte transversal próximo à extremidade posterior, mas não corte a extremidade posterior. Em seguida, corte ao longo da linha média ventral em direção à extremidade anterior.
- Insira quatro pinos de insetos nos quatro cantos da larva. Reajuste os pinos do inseto de forma que a larva seja esticada ao máximo em todas as direções.
- Use a pinça para remover órgãos internos, sem danificar os músculos.
2. Fixação
- Adicionar 100 μL de PFA (4%) para imergir as carcaças por 40 min enquanto as carcaças ainda estão fixadas na placa dissecante.
CUIDADO: Medidas de proteção eficazes são tomadas para evitar o contato direto com a pele ou inalação, pois o PFA é um perigo. - Desmonte os pinos e transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Enxaguar o PFA com 1x solução salina tamponada com fosfato contendo Triton X-100 a 0,2% (0,2% PBST) para encher 2 mL de tubo de microcentrífuga por 10 min no agitador descolorante a 15 rpm. Repita o processo de lavagem 5x.
3. Imunocitoquímica
- Imergir as carcaças em bloqueador (5% de soro caprino em 0,2% de PBST) e bloquear por 40 min à temperatura ambiente.
- Remova o agente bloqueador e substitua-o por 200 μL do anticorpo primário (por exemplo, anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluído com PBST a 0,2% a 4 °C durante a noite. Visualize os microtúbulos musculares por imunomarcação com anti-α-tubulina monoclonal. Anti-Futsch pode refletir indiretamente a morfologia dos microtúbulos na JNM.
- Após a incubação do anticorpo primário, lavar as larvas com PBST a 0,2% por 10 min.
- Incubar as larvas com 200 μL de anticorpo secundário (por exemplo, cabra anti-Mouse-488, 1:1000) diluído com 0,2% PBST à temperatura ambiente por 1,5 h no escuro.
- Em seguida, adicionar um corante nuclear como o iodeto TO-PRO(R) 3 (T3605) na concentração de 1:1000 no tubo de incubação por 30 min ao corar os microtúbulos no escuro20,22.
- Enxaguar o anticorpo secundário e o corante nuclear com PBST a 0,2% por 10 min. Repita 5x no escuro.
4. Montagem
- Colocar a carcaça da larva em PBST 0,2% sobre uma lâmina de vidro e ajustá-la sob o estereomicroscópio. Certifique-se de que a superfície interna da carcaça da larva esteja voltada para cima e que todas as carcaças das larvas estejam dispostas conforme desejado.
- Absorva o excesso de solução PBST com um lenço umedecido e adicione suavemente uma gota de meio de montagem antifade.
- Coloque uma lamínula na lâmina para cobrir as larvas dissecadas lenta e suavemente para evitar bolhas.
- Aplique o esmalte de unha ao redor da tampa. Coloque a lâmina no espaço escuro para reduzir a atenuação fluorescente.
5. Aquisição de imagens
- Para a aquisição das imagens, utilizar microscópio confocal de varredura a laser, selecionar a objetiva de imersão em óleo 60x (abertura numérica 1,42) ou similar e ajustar a potência e o comprimento de onda do laser com base no experimento.
- Para identificar o NMJ, captar imagens no músculo 4 no segmento A3 (como mostra a localização na Figura 1F). Selecione um laser de 488 nm para ativar a α-tubulina ou Futsch e 543 nm para ativar a trilha de imagem HRP. Ajuste os parâmetros para um tamanho de quadro de 800 pixels x 800 pixels, um zoom digital de 2,0 e um intervalo de imagem de 0,8 μm em NMJs (Figura 2).
- Para identificar os microtúbulos no músculo, capture imagens do músculo 2 no segmento A3-A5 (como mostrado no local na Figura 1G) por apresentar menor número de ramos traqueais. Escolha um laser de 488 nm para ativar a α-tubulina e um laser de 635 nm para ativar a trilha de imagem T3605. Ajuste os parâmetros para um tamanho de quadro de 1024 pixels x 1024 pixels, um zoom digital de 3,0 e um intervalo de imagem de 0,4 μm nas células musculares (Figura 3).
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Representative Results
Demonstramos um procedimento passo a passo para visualizar a rede de microtúbulos nas junções neuromusculares (NMJs) e nas células musculares. Após a dissecção de acordo com o diagrama esquemático (Figura 1A-E), a imunomarcação é realizada e, posteriormente, as imagens são observadas e coletadas em microscópio confocal a laser ou microscópio de fluorescência estereoscópica (Figura 1F,G).
A organização dos microtúbulos pré e pós-sinápticos do NMJ poderia ser marcada com anti-α-tubulina e, selecionando a espessura da camada do microscópio confocal de varredura a laser, a morfologia dos microtúbulos dos diferentes cortes seria exibida (Figura 2A-C). Futsch também tem sido usado para traçado neural, revelando a organização dos microtúbulos nos axônios dos neurônios. O anti-HRP é utilizado para marcar a membrana neuronal 10,23,24. A cocoloração com anticorpos anti-Futsch e anti-HRP é realizada para detectar o estado dos microtúbulos nos axônios dos neurônios. A coloração de Futsch pode refletir a abundância de microtúbulos estáveis nos neurônios pré-sinápticos do NMJ9. A chaperona E específica da tubulina (TBCE) desempenha um papel crucial no desenvolvimento do citoesqueleto da MT. Quando a TBCE é derrubada em neurônios pré-sinápticos, o sinal de anti-Futsch torna-se mais fraco e fino, e a coloração nos boutons terminais é não óbvia ou ausente23. A Tau é uma proteína associada a microtúbulos que tem importante papel na montagem e estabilização dos microtúbulos25,26. Em Drosophila com expressão ectópica da proteína Tau humana selvagem e mutante, uma diminuição na intensidade do sinal de Futsch nos terminais NMJ é revelada20. De acordo com os resultados da coloração de Futsch, a intensidade de coloração do tronco axonal foi mais forte que a dos ramos (Figura 2D-F). Os microtúbulos no final dos ramos são menos estáveis e mais propensos a alterações morfológicas, de modo que a dinâmica dos microtúbulos pode ser refletida pela coloração dos microtúbulos terminais.
Alterações morfológicas dos microtúbulos também podem ser facilmente visualizadas22. As alças de microtúbulos podem ser coradas com anti-Futsch e anti-α-tubulina. Além disso, a forma de um único laço pode ser claramente exibida, o que facilita a análise quantitativa. Por exemplo, a katanina é uma proteína cortadora de microtúbulos que desempenha um papel importante na regulação da dinâmica dos microtúbulos. Foi relatado que a subunidade catalítica Katanin 60 tem um efeito sobre a morfologia dos microtúbulos22. Mao construiu o mutante Katanin 60 por excisão mediada por elemento P e uas-Katanin 60 inserindo pUAST-attB-Katanin 60 no segundo cromossomo em 51D. O aumento das alças dos microtúbulos causado pelas mutações de Katanin 6017A foi claramente demonstrado (Figura 2A,B,D,E). Além disso, na superexpressão de Katanin 60, fragmentos curtos de MT também puderam ser significativamente observados dentro dos boutons terminais (Figura 2C).
A rede de microtúbulos pode ser observada pela coloração com anticorpos α-tubulina em células musculares. Uma rede de microtúbulos estendendo-se ao redor do núcleo era claramente visível (Figura 3A). A proteína cortadora de microtúbulos Katanin regula a distribuição da rede de microtúbulos22. No mutante Katanin 6017A , as células musculares tiveram uma intensidade de MT perinuclear significativamente aumentada e exibiram feixes mais fortes em comparação com o tipo selvagem (Figura 3B). A fragmentação das fibras dos microtúbulos causada pela superexpressão de Katanin 60 foi representada (Figura 3C). Assim, o protocolo possibilita a visualização da rede de microtúbulos tanto em neurônios quanto em células musculares.
Gráfico 1. Procedimento de dissecção dorsal de larva de Drosophila . (A-E) O procedimento de preparação das carcaças de larvas (modificado de21). (A) Insira dois pinos cada um nos ganchos da boca e na cauda de uma larva. (B) Use a tesoura dissecante para fazer um pequeno corte transversal próximo à extremidade posterior. (C) Corte ao longo da linha média ventral em direção à extremidade anterior. (D) Insira quatro pinos de insetos nos quatro cantos da larva. (E) Use pinças para remover órgãos internos e reajuste a posição dos pinos para colocar a larva em uma posição apropriada para a fotografia. (F) A faloidina é usada para marcar o citoesqueleto para visualizar o músculo, e a HRP é usada para marcar a membrana celular dos neurônios. A região observada do NMJ é restrita ao músculo 4 no segmento A3, cocorado com anti-HRP (verde) e faloidina (magenta). O painel direito mostra uma representação esquemática da estrutura muscular local. O tamanho do quadro de 1024 pixels x 1024 pixels, zoom digital de 0,6 e um intervalo de imagem de aproximadamente 4 μm usando uma lente objetiva de 10x (abertura numérica de 0,45). (G) A região observada das células musculares é restrita ao músculo 2 nos segmentos A3 a A5, corados com faloidina (magenta). O corte único é capturado por um microscópio de fluorescência estereoscópica. Barra de escala: 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Imagens confocais de microtúbulos dentro do NMJ por anti-α-tubulina ou anti-Futsch. Terminais NMJ de w1118 controle (A), Katanin 60 17A mutante (B) e superexpressão neuronal de Katanin 60 (C), co-corados com anti-HRP (vermelho) e anti-α-tubulina (verde) são mostrados na coluna esquerda. As imagens são projeções de pilhas z completas através de todo o músculo 4 NMJ do segmento abdominal A3. A coluna do meio mostra uma imagem mais clara dos microtúbulos nos terminais do NMJ, removendo os microtúbulos do músculo. A coluna da direita mostra a morfologia dos microtúbulos em boutons sinápticos usando o software de análise. Barra de escala: 1 μm. Terminais NMJ de diferentes genótipos co-corados com anti-HRP (vermelho) e anti-Futsch (verde) (D-F). As alças de MT foram indicadas por setas. Barra de escala: 5 μm. Este número foi adaptado de22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Coloração da rede de microtúbulos perinucleares nas células musculares da larva de Drosophila. (A-C) Os músculos larvais são co-corados com anti-α-tubulina (verde) para mostrar a rede de microtúbulos e T3605 (azul) para mostrar o núcleo para w1118 controle (A), Katanin 60 17A mutante (B) e Katanin 60 superexpressão no sistema muscular (C). As imagens são projeções de pilhas z completas do aparecimento de microtúbulos para o centro do nuclear. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui é descrito um protocolo para a dissecção e imunomarcação de larvas de Drosophila , junções neuromusculares e células musculares. Há vários pontos essenciais a serem considerados. Em primeiro lugar, evitar a lesão dos músculos observados é crucial durante o processo de dissecção. Pode valer a pena fixar o filé antes de retirar os órgãos internos para evitar o contato direto entre a pinça e os músculos. Para evitar danos musculares ou separação da epiderme larval, é importante garantir que a velocidade do agitador não exceda 15 rpm durante a lavagem e incubação. Além disso, o controle preciso da extensão da pele é necessário para garantir uma fotografia clara e completa da morfologia do NMJ. É aconselhável realizar experimentos preliminares para otimizar a concentração de anticorpos, fixação, bloqueio e tempos de incubação. A duração fixa é limitada a cerca de 40 min. Muito curto ou muito longo não é propício para a imunomarcação da rede de microtúbulos.
Os microtúbulos nos neurônios são densamente compactados e difíceis de serem visualizados claramente usando microscopia convencional. Em comparação com os neurônios, as células musculares de Drosophila são notavelmente grandes, com o músculo 2 do segmento A3 medindo até 40 μm x 150 μm, tornando-o passível de imagens de alta resolução. Portanto, a utilização de células musculares Drosophila para investigar a regulação de proteínas associadas à rede de microtúbulos é uma abordagem intuitiva e lúcida que tem valor significativo na validação dos fenótipos do NMJ20,22,23. Em comparação com o métodoanterior27, alteramos a direção da dissecção do dorso para o abdome para obter um objeto desobstruído. O tampão de eluição do músculo com 0,2% PBST é relativamente suave e ajuda a preservar a integridade muscular.
Ainda existem algumas limitações nessa abordagem. Como uma proteína ligadora de microtúbulos, Futsch é expressa exclusivamente em neurônios e pode representar indiretamente microtúbulos polimerizados. No entanto, se apenas Futsch for usado para visualizar a rede de microtúbulos durante a triagem de interação, algumas proteínas candidatas podem ser perdidas. α-tubulina ou β-tubulina podem representar diretamente a rede de microtúbulos, no entanto, essas duas proteínas apresentam tanto pré-sináptica quanto pós-sináptica, e às vezes é difícil distingui-la. Além disso, um grande número de heterodímeros de α/β-tubulina está distribuído no citoplasma, o que significa que a marcação de α-tubulina ou β-tubulina pode não ser adequada para imagens vivas, já que tubulina polimerizada e não polimerizada podem ser observadas ao mesmo tempo.
A observação de microtúbulos desde neurônios motores até células musculares pode fornecer uma compreensão abrangente dos mecanismos de movimento sob a perspectiva dos circuitos neurais, facilitando o estudo dos processos de neurodesenvolvimento e a patogênese das doenças neurológicas. A visualização da rede de microtúbulos em diferentes sistemas modelo é benéfica para verificar a função gênica a partir de múltiplas perspectivas usando este protocolo. Este método também pode ser usado para observar os receptores pós-sinápticos do NMJ, o que é benéfico para o estudo da comunicação entre sinapses e plasticidade sináptica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Ying Xiong pelas discussões e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa da National Science Foundation of China (NSFC) para C. M. (31500839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J.
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R.
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
