Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Использование нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы и мышечных клеток для визуализации сети микротрубочек

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1National & Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, School of life science, Hubei University

Summary

Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Abstract

Сеть микротрубочек является важным компонентом нервной системы. Мутации во многих регуляторных белках микротрубочек связаны с нарушениями развития нервной системы и неврологическими заболеваниями, например, микротрубочки-ассоциированный белок Tau с нейродегенеративными заболеваниями, расщепляющий микротрубочки белок Spastin и Katanin 60 вызывают наследственную спастическую параплегию и аномалии развития нервной системы, соответственно. Обнаружение сетей микротрубочек в нейронах полезно для выяснения патогенеза неврологических расстройств. Однако небольшой размер нейронов и плотное расположение пучков аксональных микротрубочек затрудняют визуализацию сетей микротрубочек. В данной работе мы описываем метод рассечения нервно-мышечного соединения личинок и мышечных клеток, а также иммуноокрашивание α-тубулина и микротрубочно-ассоциированного белка Futsch для визуализации сетей микротрубочек у Drosophila melanogaster. Нервно-мышечное соединение позволяет нам наблюдать как пре-, так и постсинаптические микротрубочки, а большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Здесь, мутируя и гиперэкспрессируя катанин 60 у Drosophila melanogaster, а затем исследуя сети микротрубочек в нервно-мышечном соединении и мышечных клетках, мы точно выявляем регуляторную роль катанина 60 в развитии нервной системы. Таким образом, в сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек на предмет роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Introduction

Микротрубочки (МТ), как один из структурных компонентов цитоскелета, играют важную роль в различных биологических процессах, включая деление клеток, рост и подвижность клеток, внутриклеточный транспорт и поддержание формы клеток. Динамика и функция микротрубочек модулируются взаимодействием с другими белками, такими как MAP1, MAP2, Tau, Katanin и Kinesin 1,2,3,4,5.

В нейронах микротрубочки необходимы для развития и поддержания аксонов и дендритов. Аномалии в микротрубочках приводят к дисфункции и даже гибели нейронов. Например, в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера гиперфосфорилирование тау-белка снижает стабильность сети микротрубочек, вызывая неврологическиенарушения. Таким образом, изучение сетей микротрубочек будет способствовать пониманию развития нервной системы и патогенеза неврологических заболеваний.

Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой периферический синапс, образованный между окончанием аксона двигательного нейрона и мышечным волокном, который является превосходной и мощной модельной системой для изучения синаптической структуры и функций7. Futsch — белок дрозофилы, гомологичный белку MAP1B, связывающему микротрубочки, обнаруженному у млекопитающих8. Он экспрессируется только в нейронах и играет роль в развитии синаптических кнопок NMJ 8,9. У дикого типа нитевидные пучки, проходящие вдоль центра NMJ, визуализируются путем иммуноокрашивания анти-Futsch. Достигнув конца NMJ, этот пучок имеет способность либо образовывать петлю, состоящую из микротрубочек, либо терять свою нитевидную структуру, что приводит к диффузному и точечному виду10. Петли микротрубочек связаны с приостановленными конусами роста, что позволяет предположить, что массив микротрубочек стабилен11. Таким образом, мы можем косвенно определить стабильное развитие микротрубочек в NMJ с помощью окрашивания по методу Футча. Большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Факторы, влияющие на стабильность сети микротрубочек, могут быть обнаружены путем анализа плотности и формы микротрубочек. В то же время, состояние сети микротрубочек мышечных клеток может быть перепроверено с результатом NMJ для получения более полных выводов.

Для исследования сети и динамики микротрубочек было использовано множество протоколов. Тем не менее, эти исследования часто сосредотачивались на исследованиях in vitro 12,13,14,15,16. Кроме того, в некоторых экспериментах in vivo использовалась электронная микроскопия для обнаружения цитоскелета17. В соответствии со специфическим связыванием флуоресцентно меченных антител или химических красителей с белками или ДНК, представленные здесь методы позволяют обнаруживать сети микротрубочек в NMJ на уровне отдельных нейронов in vivo, причем результаты подтверждаются наблюдениями в мышечных клетках. Этот протокол прост, стабилен и воспроизводим в сочетании с мощными генетическими инструментами, доступными у Drosophila melanogaster, что позволяет проводить широкий спектр фенотипических исследований и генетических скринингов на роль регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Вскрытие личинок

ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекающий раствор гемолимфоподобного физиологического раствора (HL3.1)18 и фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA)19,20 используются при комнатной температуре, поскольку микротрубочки деполимеризуются при слишком низкой температуре.

  1. Выберите блуждающую личинку3-го возраста длинными тупыми щипцами. Промойте его HL3.1 и поместите на чашку для препарирования под стереомикроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блуждающая личинка3-го возраста идентифицируется по разветвленному переднему дыхальцу и ползает по трубке примерно через 96 ч (25 °C)21.
  2. Расположите личинку спинной или брюшной стороной вверх. Определите дорсальную сторону по двум длинным трахеям, а вентральную — по брюшным зубным поясам.
    1. В зависимости от ткани, которую необходимо исследовать, выберите дорсальную или вентральную диссекцию. Это позволит получить более точное и детальное представление о конкретной интересующей области. Для наблюдения за NMJ и мышечными клетками разрезают спинную и вентральную области личинки соответственно.
  3. Приколите рот крючками и хвостиком. Отрегулируйте штифты, чтобы сохранить личинку в вытянутом состоянии. Добавьте в личинку каплю HL3.1, чтобы она не высохла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ca2+ -free HL 3.1 можно использовать для минимизации сокращения мышц во время рассечения.
  4. С помощью ножниц для рассечения сделайте небольшой поперечный надрез близко к заднему концу, но не отрезайте задний конец. Затем разрезают по вентральной средней линии по направлению к переднему концу.
  5. Вставьте четыре булавки в виде насекомых по четырем углам личинки. Отрегулируйте булавки насекомых таким образом, чтобы личинка максимально растянулась во все стороны.
  6. Используйте щипцы для удаления внутренних органов, не повреждая при этом мышцы.

2. Фиксация

  1. Добавьте 100 мкл PFA (4%), чтобы погрузить туши на 40 минут, пока туши все еще прикреплены к чашке для препарирования.
    ВНИМАНИЕ: Принимаются эффективные меры защиты, чтобы избежать прямого контакта с кожей или вдыхания, так как PFA представляет опасность.
  2. Снимите штифты и перенесите образец в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл. Смойте PFA 1x фосфатным буфером физиологического раствора, содержащим 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST), чтобы заполнить пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл в течение 10 минут на шейкере для обесцвечивания при 15 об/мин. Повторите процесс стирки 5 раз.

3. Иммуноцитохимия

  1. Погрузите туши в блокирующее средство (5% козья сыворотка в 0,2% PBST) и блокируйте на 40 мин при комнатной температуре.
  2. Удалите блокирующий агент и замените его 200 мкл первичного антитела (например, анти-α-тубулина, 1:1000; анти-Футча, 1:50), разбавленного 0,2% PBST при 4 °C в течение ночи. Визуализируйте мышечные микротрубочки с помощью иммуноокрашивания моноклональным анти-α-тубулином. Anti-Futsch может косвенно отражать морфологию микротрубочек в NMJ.
  3. После инкубации первичного антитела личинки промывают 0,2% ПБСТ в течение 10 мин. Повторить 5 раз.
  4. Инкубируют личинок с 200 мкл вторичного антитела (например, козьего анти-Мауса-488, 1:1000), разбавленного 0,2% PBST при комнатной температуре, в течение 1,5 ч в темноте.
  5. Далее добавляют ядерный краситель типа TO-PRO(R)3 йодида (T3605) в концентрации 1:1000 в инкубационную пробирку на 30 мин при окрашивании микротрубочек в темноте20,22.
  6. Смойте вторичное антитело и ядерный краситель 0,2% PBST в течение 10 мин. Повторите 5 раз в темноте.

4. Монтаж

  1. Поместите тушку личинки в 0,2% ПБСТ на предметное стекло и отрегулируйте ее под стереомикроскопом. Убедитесь, что внутренняя поверхность туши личинки обращена вверх, а все тушки личинок расположены так, как нужно.
  2. Излишки раствора ПБСТ впитайте салфеткой и аккуратно добавьте каплю монтажного средства против выцветания.
  3. Положите на предметное стекло покровный листок, чтобы медленно и осторожно накрыть препарированных личинок, чтобы избежать пузырьков.
  4. Нанесите лак для ногтей вокруг покровного стекла. Поместите предметное стекло в темное место, чтобы уменьшить затухание флуоресценции.

5. Получение изображения

  1. Для получения изображений используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, выберите 60-кратный масляный иммерсионный объектив (числовая апертура 1,42) или аналогичный и отрегулируйте мощность лазера и длину волны в зависимости от эксперимента.
  2. Чтобы идентифицировать NMJ, сделайте снимки в мышце 4 в сегменте A3 (как показано на рисунке 1F). Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина или Футша и 543 нм для активации трека визуализации HRP. Настройте параметры на размер кадра 800 x 800 пикселей, цифровой зум 2,0 и интервал изображения 0,8 мкм в NMJ (рис. 2).
  3. Чтобы идентифицировать микротрубочки в мышце, сделайте снимки мышцы 2 в сегменте A3-A5 (как показано на рисунке 1G), так как у нее меньше трахеальных ветвей. Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина и лазер с длиной волны 635 нм для активации трека визуализации T3605. Настройте параметры на размер кадра 1024 x 1024 пикселя, цифровой зум 3,0 и интервал визуализации 0,4 мкм в мышечных клетках (рис. 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы продемонстрировали пошаговую процедуру визуализации сети микротрубочек как в нервно-мышечных соединениях (NMJ), так и в мышечных клетках. После вскрытия в соответствии с принципиальной схемой (рис. 1A-E) проводится иммуноокрашивание, после чего изображения наблюдаются и собираются под лазерным конфокальным микроскопом или стереоскопическим флуоресцентным микроскопом (рис. 1F,G).

Как пре-, так и постсинаптическая организация микротрубочек NMJ может быть помечена анти-α-тубулином, и, выбирая толщину слоя лазерного сканирующего конфокального микроскопа, можно отобразить морфологию микротрубочек различных срезов (рис. 2A-C). Футш также используется для трассировки нейронов, выявляя организацию микротрубочек в аксонах нейронов. Анти-HRP используется для мечения мембраны нейронов 10,23,24. Совместное окрашивание антителами к Футчу и анти-HRP проводят для определения состояния микротрубочек в аксонах нейронов. Окрашивание по Футшу может отражать обилие стабильных микротрубочек в пресинаптических нейронах NMJ9. Тубулин-специфический шаперон Е (TBCE) играет решающую роль в развитии цитоскелета МТ. Когда TBCE сбивается в пресинаптических нейронах, сигнал анти-Футча становится слабее и тоньше, а окрашивание в терминальных бутонах либо неочевидно, либо отсутствует23. Тау - это белок, связанный с микротрубочками, который играет важную роль в сборке и стабилизации микротрубочек25,26. У дрозофилы с эктопической экспрессией человеческого тау-белка дикого типа и мутантного тау-белка человека выявлено снижение интенсивности сигнала Футча на NMJ-терминалах20. По результатам окрашивания по Футчу интенсивность окрашивания ствола аксона была сильнее, чем у ветвей (рис. 2D-F). Микротрубочки на концах ветвей менее стабильны и более склонны к морфологическим изменениям, поэтому динамику микротрубочек можно отразить, окрашивая концевые микротрубочки.

Морфологические изменения микротрубочек также могут быть легко визуализированы22. Петли микротрубочек можно окрашивать анти-Futsch и анти-α-тубулином. Кроме того, форма одной петли может быть четко отображена, что облегчает количественный анализ. Например, катанин – это белок, рассекающий микротрубочки, который играет важную роль в регуляции динамики микротрубочек. Сообщается, что каталитическая субъединица катанин 60 оказывает влияние на морфологию микротрубочек22. Мао сконструировал мутант Катанин-60 путем Р-элемент-опосредованной эксцизии и uas-Катанин-60 путем вставки pUAST-attB-Katanin 60 во вторую хромосому в 51D. Было наглядно продемонстрировано увеличение петель микротрубочек, вызванное мутациями Katanin 6017A (рис. 2A,B,D,E). Кроме того, при гиперэкспрессии катанина 60 короткие фрагменты МТ также могли наблюдаться в терминальных бутонах (рис. 2В).

Сеть микротрубочек можно наблюдать при окрашивании антителами к α-тубулину в мышечных клетках. Была отчетливо видна сеть микротрубочек, простирающихся вокруг ядра (рис. 3А). Расщепляющий микротрубочки белок катанин регулирует распределение сети микротрубочек22. У мутанта Katanin 6017A мышечные клетки имели значительно повышенную интенсивность перинуклеарного МТ и демонстрировали более сильные пучки по сравнению с диким типом (рис. 3B). Представлена фрагментация волокон микротрубочек, вызванная гиперэкспрессией катанина 60 (рис. 3В). Таким образом, протокол позволяет визуализировать сеть микротрубочек как в нейронах, так и в мышечных клетках.

Figure 1
Рисунок 1. Процедура дорсального вскрытия личинки дрозофилы . (А-Е) Порядок подготовки личиночных тушек (видоизменен с21). (А) Вставьте по два штифта в ротовые крючки и хвост личинки. (B) С помощью ножниц для препарирования сделайте небольшой поперечный надрез близко к заднему концу. (C) Разрез вдоль вентральной срединной линии по направлению к переднему концу. (D) Вставьте четыре булавки для насекомых в четыре угла личинки. (Д) Используйте щипцы, чтобы удалить внутренние органы, и отрегулируйте положение штифтов, чтобы поместить личинку в подходящее положение для фотографирования. (F) Фаллоидин используется для мечения цитоскелета для визуализации мышцы, а HRP используется для мечения клеточной мембраны нейронов. Наблюдаемая область NMJ ограничена мышцей 4 в сегменте A3, окрашенной совместно с анти-HRP (зеленый) и фаллоидином (пурпурный). На правой панели показано схематическое изображение локальной мышечной структуры. Размер кадра 1024 x 1024 пикселя, цифровой зум 0,6 и интервал изображения около 4 мкм при использовании объектива 10x (числовая апертура 0,45). (G) Наблюдаемая область мышечных клеток ограничена мышцей 2 в сегментах от А3 до А5, окрашенной фаллоидином (пурпурным). Одиночный срез фиксируется стереоскопическим флуоресцентным микроскопом. Масштабная линейка: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Конфокальные изображения микротрубочек в NMJ с помощью анти-α-тубулина или анти-Futsch. В левом столбце показаны NMJ-терминалы контроля w1118 (A), мутанта Katanin 60 17A (B) и нейрональная гиперэкспрессия Katanin 60 (C), окрашенные совместно с анти-HRP (красный) и анти-α-тубулином (зеленый). Изображения представляют собой проекции от полных z-стеков через всю мышцу 4 НМДж брюшного сегмента А3. Средний столбец показывает более четкое изображение микротрубочек в окончаниях NMJ путем удаления микротрубочек из мышцы. В правой колонке показана морфология микротрубочек в синаптических бутонах с помощью аналитического программного обеспечения. Масштабная линейка: 1 мкм. Клеммы NMJ разных генотипов, окрашенные совместно с анти-HRP (красный) и анти-Futsch (зеленый) (D-F). Петли МТ были обозначены стрелками. Масштабная линейка: 5 мкм. Эта цифра была адаптирована из22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Окрашивание перинуклеарной сети микротрубочек в мышечных клетках личинок дрозофилы . (А-С) Личиночные мышцы окрашивают анти-α-тубулином (зеленым), чтобы показать сеть микротрубочек, и T3605 (синий), чтобы показать ядро для контроля w1118 (A), мутанта Katanin 6017A (B) и катанина 60 в мышечной системе (C). Изображения представляют собой проекции полных z-стеков от появления микротрубочек до центра ядра. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь описан протокол вскрытия и иммуноокрашивания нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы и мышечных клеток. Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, во время процесса рассечения очень важно избежать травмирования наблюдаемых мышц. Возможно, стоит зафиксировать филе перед удалением внутренних органов, чтобы предотвратить прямой контакт щипцов с мышцами. Чтобы избежать повреждения мышц или отрыва от личиночного эпидермиса, важно следить за тем, чтобы скорость шейкера не превышала 15 оборотов в минуту во время промывки и инкубации. Кроме того, для обеспечения четкой и полной фотографии морфологии NMJ необходим точный контроль за расширением кожи. Целесообразно проводить предварительные эксперименты для оптимизации концентрации антител, времени фиксации, блокировки и инкубации. Фиксированная продолжительность ограничена примерно 40 минутами. Слишком короткая или слишком длинная не способствует иммуноокрашиванию сети микротрубочек.

Микротрубочки в нейронах плотно упакованы, и их трудно четко визуализировать с помощью обычной микроскопии. По сравнению с нейронами, мышечные клетки дрозофилы заметно большие, причем мышца 2 сегмента А3 имеет размеры до 40 мкм х 150 мкм, что делает ее пригодной для визуализации с высоким разрешением. Таким образом, использование мышечных клеток дрозофилы для исследования регуляции белков, связанных с сетью микротрубочек, является интуитивным и ясным подходом, который имеет большое значение для валидации фенотипов NMJ20,22,23. По сравнению с предыдущим методом27 мы изменили направление рассечения с дорсального на брюшное, чтобы получить беспрепятственный объект. Элюирующий буфер мышцы с 0,2% PBST является относительно щадящим и помогает сохранить целостность мышц.

У этого подхода все еще есть некоторые ограничения. Как белок, связывающий микротрубочки, Futsch экспрессируется исключительно в нейронах и может опосредованно представлять собой полимеризованные микротрубочки. Однако, если для визуализации сети микротрубочек во время скрининга взаимодействия используется только Futsch, некоторые белки-кандидаты могут быть упущены. α-тубулин или β-тубулин могут непосредственно представлять сеть микротрубочек, однако эти два белка представлены как пресинаптическими, так и постсинаптическими, и иногда их трудно различить. Более того, в цитоплазме распределено большое количество гетеродимеров α/β-тубулина, а это означает, что мечение либо α-тубулина, либо β-тубулина может быть непригодным для живой визуализации, так как одновременно могут наблюдаться как полимеризованный, так и неполимеризованный тубулин.

Наблюдение за микротрубочками от двигательных нейронов до мышечных клеток может обеспечить всестороннее понимание механизмов движения с точки зрения нейронных цепей, облегчая изучение процессов развития нервной системы и патогенеза неврологических заболеваний. Визуализация сети микротрубочек в различных модельных системах полезна для проверки функции генов с разных точек зрения с помощью этого протокола. Этот метод также может быть использован для наблюдения за постсинаптическими рецепторами NMJ, что полезно для изучения связи между синапсами и синаптической пластичности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Ин Сюна за обсуждение и комментарии к рукописи. Эта работа поддержана грантом Национального научного фонда Китая (NSFC) C. M. (31500839).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin invitrogen A30104 dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium Beyotime P0128M
FV10-ASW confocal microscope Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated Thermo Fisher A-11001 dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710 Zeiss
Micro Scissors 66vision 54138B
Mouse anti-Futsch antibody Developmental Studies Hybridoma Bank   22C10 dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody Sigma T5168 dilute 1:1,000
Paraformaldehyde Wako 168-20955 Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins Entomoravia 0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161 Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41 Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP Jackson ImmunoResearch dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide Invitrogen T3605 dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8 Kylin-Bell lab instruments E0018
TritonX-100 BioFroxx 1139
Tweezers  dumont 500342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

Tags

Нервно-мышечное соединение личинок дрозофилы мышечные клетки сеть микротрубочек нарушения развития нервной системы неврологические заболевания тау-белок ассоциированный с микротрубочками расщепляющий микротрубочки белок спастин катанин 60 наследственная спастическая параплегия иммуноокрашивание меланогастер дрозофилы пресинаптические микротрубочки постсинаптические микротрубочки мутация гиперэкспрессия регуляторная роль
Использование нервно-мышечного соединения личинок <em>дрозофилы</em> и мышечных клеток для визуализации сети микротрубочек
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin,… More

Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin, S., Mao, C. X. Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network. J. Vis. Exp. (200), e65774, doi:10.3791/65774 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter