Summary
Her præsenterer vi en protokol til undersøgelse af hastigheden af programmeret celledødsinitiering ved kontinuerligt at afbilde podede blade efter induktion af celledød.
Abstract
Overfølsom respons (HR)-tildelt resistens er et effektivt forsvarsrespons, der kan bestemmes af N-resistensgenerne. HR manifesteres som dannelsen af celledødszoner på inokulerede blade. Her præsenteres en protokol til undersøgelse af hastigheden af celledødsinitiering ved billeddannelse af inokulerede blade i tiden mellem celledødsinitieringen og celledødsudseendet ved hjælp af et digitalt mikroskop. Det digitale mikroskop muliggør en kontinuerlig billeddannelsesproces i ønskede intervaller, hvilket muliggør en nøjagtig bestemmelse af celledødsinitieringshastighed op til minutter nøjagtigt i modsætning til timer i traditionelle metoder. Billeddannelse med det digitale mikroskop er også uafhængig af lys og kan derfor bruges dag og nat uden at forstyrre plantens døgnrytme. Forskellige patosystemer, der resulterer i programmeret celledødsudvikling, kunne undersøges ved hjælp af denne protokol med mindre ændringer. Samlet set tillader protokollen således enkel, nøjagtig og billig identifikation af initieringsrate for celledød.
Introduction
Kartoffel er en af verdens mest dyrkede fødevareafgrøder, fjerdepladsen bag ris, hvede og majs. Kartoffelproduktionen kan dog blive hårdt ramt af kartoffelvirus Y (PVY), som i øjeblikket betragtes som dets vigtigste viruspatogen 1,2. I kartoffelplanter cv. Rywal, flere stammer af PVY (herunder PVY-stamme N-Wilga) udløser overfølsom respons (HR)-tildelt resistens, hvor patogenets begrænsning til infektionsstedet manifesterer sig som nekrotiske læsioner på podede blade3. I dette patosystem medieres HR af Ny-1-resistensgenet, som er temperaturafhængigt, da planter, der dyrkes ved lavere temperaturer, effektivt udvikler nekrotiske læsioner, mens abort af resistens i planter, der dyrkes konstitutivt ved forhøjet (28 °C) temperatur, påvises som manglende læsionsdannelse og systemisk virusspredning 3,4. Når planterne overføres til en lavere temperatur (22 °C), initieres celledød, som kan udnyttes til at følge hastigheden af celledødsinitiering ved at afbilde podede blade i tiden mellem celledødsinitieringen og celledødsudseendet.
Denne protokol demonstrerer en simpel metode til bestemmelse af initieringsrate for celledød ved hjælp af et digitalt mikroskop. Ved at tage billeder af de podede blade efter overførsel af planten fra 28 °C til 22 °C muliggør et digitalt mikroskop kontinuerlig observation af bladet i ønskede intervaller. I modsætning til brugen af andre metoder (for eksempel konfokal mikroskopi eller observation af læsionsdannelse med det blotte øje) tillader dette bestemmelse af det nøjagtige tidspunkt for læsionsdannelse og derfor celledødsinitieringshastigheden op til minutter nøjagtigt i modsætning til timer i ovennævnte metoder 5,6. Brug af digitale mikroskoper er også uafhængig af lys og kan derfor bruges dag og nat. Denne protokol kan også bruges til at identificere komponenter, der er involveret i initiering af celledød, eller til at bestemme virkningerne af forskellige komponenter på initieringshastigheden for celledød, hvis brugte planter er transgene og har ændrede niveauer af komponenter af interesse.
Protocol
BEMÆRK: Afsnit 1 og 2 beskriver en modificeret protokol for plantematerialeforberedelse baseret på de metoder, der er skitseret af Lukan et al.7. Specifikt blev der foretaget nogle ændringer af kontrollerede miljøforhold og podningspræparation.
1. Dyrkning af kartoffelplanter
- Dyrk sund kartoffel cv. Rywalplanter i stamknudevævskultur8.
- Efter 6-8 uger skæres ti 1 cm lange eksplanter indeholdende knuder fra kartoffelplanter på sterilt papir under sterile forhold ved hjælp af steril pincet og en skalpelkniv.
- Overfør dem til plastkasser med Murashige og Skoog (MS30) medium (figur 1A) og dyrk dem under kontrollerede miljøforhold (22 °C i lyset og 19 °C i mørke med 250 μE eller μmol/m2/s stråling og en 16-timers fotoperiode ved en relativ luftfugtighed på 55% ± 5%).
- Overfør dem til jorden 2 uger efter mikroformering.
- Fyld potterne (r = 10 cm) med jord. Brug en finger til at skabe et 3-4 cm dybt hul i jorden midt i en gryde, fyld hullet med vand og vent på, at det absorberer.
- Placer en plante pr. Gryde i hullet, og lad bladene være over overfladen. Dæk forsigtigt rødderne med jord (figur 1B).
BEMÆRK: Nogle planter udvikler muligvis ikke rødder. Udeluk disse planter fra analysen.
- Dyrk planterne i jord i et vækstkammer under kontrollerede miljøforhold (22 °C i lyset og 19 °C i mørke, ved en relativ luftfugtighed på 55% ± 5%, med 250 μmol/m2/s stråling og en 16-timers fotoperiode).
- Efter 3-4 uger er planterne klar. Brug disse planter til at blive podet.
BEMÆRK: Planter skal have mindst 3-4 fuldt udviklede blade med synlige foldere (figur 1C). De skal se sunde ud uden synlige symptomer (gule eller brune blade), som kan forveksles med læsioner forårsaget af PVY. For at opnå sammenlignelige resultater bør planter podes samtidig (f.eks. kl. 9) i alle forsøg for at undgå mulige virkninger af døgnrytme på planters immunrespons og læsionsdannelse 9,10,11.
2. Podeforberedelse og kartoffelpodning
- Planten podes med PVY-stamme N-Wilga (PVYN-Wi; tiltrædelsesnr. EF558545) podning som anført nedenfor.
BEMÆRK: Flere planter kan podes parallelt, hvis mere end et digitalt mikroskop er tilgængeligt. Planter skal have mindst tre fuldt udviklede blade før podning (figur 1C). PVYN-Wi multipliceres og vedligeholdes i kartoffel cv. Pentland.- Forbered fosfatbuffer, suppleret med natriumdiethyldithiocarbamat (DIECA), til podning: Bland 1,3 ml 0,2 MNaH2PO4, 8,7 ml 0,2 MNa2HPO4 og 0,225 g DIECA. Der fyldes op til 100 ml med ddH20. pH justeres til 7,6 ved at tilsætte 1 M NaOH- eller 1 M HCl-opløsning.
- Høst 6-8 uger gammelt PVYN-Wi inficeret kartoffel cv. Pentland planter fra vævskultur i ekstraktionsposer med filternet (0,5 g pr. 6 planter) og tilsæt fosfatbuffer suppleret med DIECA (4x masse plantemateriale, masse: volumenforhold). Brug en håndhomogenisator i 1-2 minutter for at opnå en homogen opløsning.
- Støv let de første tre bund fuldt udviklede blade af 3-4 uger gamle kartoffelplanter (fra trin 1.6) med carborundumpulver.
BEMÆRK: Juster mængden af carborundum pulver. For meget kan forårsage skade, mens for lidt kan resultere i ineffektiv infektion. Optimalt anvendes 0,1 mg/cm carborundumpulver, hvilket er ca. 1,5 mg pulver pr. blad af gennemsnitlig størrelse (ca. 15 cm2). - Gnid forsigtigt bladene med podningen (~ 100 μL pr. Blad). Efter 10 minutter vaskes bladene grundigt med ledningsvand.
- Pas på ikke at skade bladene. Overskrid ikke inkubationstiden. Juster mængden af podestoffet i henhold til bladstørrelse - 6,5 μL / cm, hvilket er ca. 100 μL pr. Blad af gennemsnitlig størrelse (ca. 15 cm2).
- Overfør planterne til et vækstkammer og dyrk dem under kontrollerede miljøforhold (28 °C i lyset og 28 °C i mørke ved en relativ luftfugtighed på 55% ± 5%, med 250 μmol/m2/s stråling og en 16 timers fotoperiode) i 3 dage.
3. Planteforberedelse og brug af det digitale mikroskop til registrering af læsionsudvikling
- De podede planter overføres fra vækstkammeret ved 28 °C til et vækstkammer ved 22 °C 3 dage efter podningen med andre betingelser som beskrevet i trin 1.5.
- Vælg en plante til observation. Immobiliser det andet inokulerede blad ved hjælp af tape (figur 1D). Sørg for, at det ønskede blad er helt immobiliseret, før du starter med billeddannelse (figur 1D).
- Installer et softwareprogram til billedoptagelse på den bærbare computer. Tilslut det digitale mikroskop til computeren. Åbn softwaren.
BEMÆRK: Sørg for, at anlægget, digitalmikroskopet og den bærbare computer er placeret på hylden nær stikkontakten for at tilslutte computeren. Beslutningen om udvælgelse af blade, der skal overvåges, kan afhænge af det biologiske spørgsmål, der undersøges, f.eks. hvilken type proces, der fører til dannelsen af begrænset programmeret celledød. - Juster mikroskopet over det immobiliserede blad. Fokuser ved hjælp af drejeknappen på det digitale mikroskop (vist i figur 1E).
- Sørg for, at sigtelinjen er så bred som muligt for at øge chancerne for at fange dannelsen af læsionen, men stadig forstørret nok til at få øje på læsionens udseende (typisk anvendes 25x forstørrelse).
- Indstil kameraindstillingerne. Klik på knappen Indstillinger i øverste højre hjørne af billedet (figur 2A, cirklet del 1) og juster kameraindstillingerne: Lysstyrke (60-70), kontrast (10-15), nuance (0), hvidbalance, mætning (45-50), skarphed (0), gamma (5) (figur 2B). De indstillinger, der blev brugt i denne undersøgelse, var som følger: Lysstyrke (64), kontrast (14), nuance (0), mætning (47), skarphed (0), gamma (5).
BEMÆRK: Kameraindstillingerne skal justeres til udelys for at sikre den bedste billedkvalitet. Indstillingerne kan tilpasses efter brugerens forhold i vækstkammeret. - Indstil indstillingerne for billedoptagelse ved at klikke på ikonet for Image Capture (Figur 2C, cirklet del 2). Klik på knappen Time-Lapsed Video og indstil Image Capture hvert 15. minut i 24 timer (figur 2C).
BEMÆRK: Intervallet mellem de billeder, der tages, og billeddannelsens varighed er fuldt fleksibelt og kan tilpasses efter eksperimentets behov. I tiden mellem billedoptagelse slukkes LED-lyset. LED-lyset tændes automatisk under billedoptagelse. - Start billedoptagelse ved at klikke på knappen START (Figur 2C).
BEMÆRK: Efter overførsel fra 28 °C til 22 °C bør planterne begynde at udvikle læsioner inden for 24 timer. Hvis ikke, kan dette være et tegn på ineffektiv podning. Juster mængden af carborundumpulver, sørg for, at tidspunktet for podeinkubation på blade var korrekt, og bestem virusoverflod i podningen ved qPCR. - For at gemme billeder skal du vælge alle billeder og klikke på ikonet Gem (figur 2B, cirklet del 3). Angiv eksportindstillinger. Indstil DPI til maksimum (300) (figur 2D). Når du har gemt, skal du slette alle billeder i programmet.
- Til billedanalyse er ethvert program til billedvisning / redigering tilstrækkeligt. Brugen af gratis software til billedredigering, ImageJ, forklares nedenfor.
- Importer tidssekvensen for billeder fra et enkelt synsfelt (klik på Filer i øverste venstre hjørne, vælg Importer og derefter Billedsekvens). Indsæt stien til mappen med gemte billeder, og tryk på OK-knappen for at starte konverteringen.
- Efter konverteringen åbner softwaren automatisk en intern videoafspiller, der viser den endelige video. Eksporter videofilen ved at klikke på Filer > Gem som og vælge AVI-format. Et lille vindue åbnes. Indstil billedhastigheden som 0.3 fps, og tryk på OK for at gemme videoen som en AVI-videofil.
BEMÆRK: Tidspunktet for læsionsudvikling kan også bestemmes ved manuelt at kontrollere alle billederne og finde et billede, hvor læsionen vises.
Representative Results
Denne undersøgelse demonstrerer en trinvis protokol til undersøgelse af celledødsinitiering gennem læsionsforekomst på kartoffel-cv. Rywal, med et digitalt mikroskop. Dette gør det muligt at bestemme det nøjagtige tidspunkt for programmeret celledødsinitiering.
Planter, der har udviklet rødder, blev sat i jord 2 uger efter kartoffel cv. Rywal-mikroformering (figur 1A, B). Efter 3-4 ugers vækst under beskrevne forhold blev planter med mindst 3-4 fuldt udviklede blade med synlige foldere, der så sunde ud uden tegn på abscission, brugt til yderligere analyse (figur 1C). Ved hjælp af et digitalt mikroskop som beskrevet i denne protokol observerede vi det samme område på det podede blad med 15 minutters mellemrum og bestemte læsionsforekomsten og udvidelsen i tid (figur 3). Læsionen opstod efter 15 timer og 30 minutter (figur 3).
Figur 1: Planteforberedelse til analyse med et digitalt mikroskop . (A) En plastkasse med MS 30 medium og kartoffel cv. Rywal plante explants indeholdende knuder. (B) Kartoffel cv. Rywal plante i jord (2 uger efter mikroformering). C) Kartoffel cv. Rywal plante, klar til podning (4 uger efter at være sat i jord), med mindst tre fuldt udviklede blade. D) Andet podede blad (pil) af kartoffel cv. Rywal plante placeret og immobiliseret (pil) med tape. (E) Plante placeret under det digitale mikroskop med pilen pegende på den drejeknap, der bruges til fokusering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Digital softwareindstilling til registrering af læsionsudvikling. (A) Softwaregrænseflade - cirklet med rødt er muligheder for knappen til (1) kameraindstillinger, (2) billedoptagelsesindstillinger og (3) lagring af billeder. (B) Vindue med kameraindstillinger, som åbnes med et klik på (1) i panel A. Lysstyrke, kontrast, mætning, skarphed og gamma skal justeres korrekt. (C) Vindue med indstillinger for billedoptagelse, som åbnes med et klik på (2) angivet i panel A. (D) Vindue med billedlagringsindstillinger, som åbnes med et klik på (3) angivet i panel A. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Læsionsdannelse på det podede blad observeret under det digitale mikroskop. Billeder af den centrale del af PVY-inokulerede kartoffelblade ved 23,6x forstørrelse set under digitalmikroskopet, taget med 5 minutters mellemrum. Podede planter blev sat ved 28 ° C i 3 dage, og på den tredje dag startede observationen med et digitalt mikroskop ved 22 ° C kl. 7:00. (A) Kl. 21:02 er læsionen endnu ikke synlig, (B) 90 min senere, kl. 22:32, er læsionen synlig. (C) Læsionsudvidelsen blev observeret kl. 01:02 og (D) kl. 07:32 næste morgen. Forsøget blev gentaget to gange, og læsionerne forekom henholdsvis 8 timer og 12 timer efter celledødsinitiering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Den demonstrerede protokol giver brugeren mulighed for nøjagtigt at bestemme initieringshastigheden for celledød ved kontinuerligt at afbilde podede blade i tiden mellem celledødsinitieringen og celledødsudseendet ved hjælp af et digitalt mikroskop. Selvom der er mange måder at overvåge læsioner og plantesygdomsforekomst12,13,14,15 på, præsenterer denne protokol fordelen ved lysuafhængig måling uden at forstyrre plantens døgnrytme, da lyset slukkes mellem målingerne.
Efter podningen skal planterne vokse ved 28 °C i 3 dage. Ny-1-resistensgenet , som inducerer et overfølsomt respons, er temperaturafhængigt, og i planter dyrket ved højere temperaturer fører det til abort af resistens, hvilket manifesteres som mangel på læsionsdannelse og systemisk virusspredning3. Efter at planter er overført til 22 ° C, påbegyndes celledød, så for nøjagtige resultater skal observation med et digitalt mikroskop begynde så hurtigt som muligt efter denne overførsel. Et andet afgørende trin i forberedelsen af planten til billeddannelse er immobilisering af bladet (figur 1D), da planten vil fortsætte med at vokse under billeddannelse, hvilket kan flytte det observerede blad ud af fokus, eller en sådan opsætning vil ikke give de ønskede resultater.
Hvis den beskrevne protokol anvendes på transgene planter med ændrede komponenter af interesse, der antages at være involveret i initiering af celledød, gør protokollen det muligt for brugeren at bestemme, om det nedsatte niveau af en undersøgt komponent påvirker hastigheden af celledødsinitiering. Dermed kan komponenter, der er involveret i initiering af celledød, identificeres i patosystemer, hvor programmeret celledød forekommer ved hjælp af denne protokol. Andre metoder til at identificere disse komponenter er for eksempel transkriptomisk analyse såsom RNA-seq eller forskellige former for mikroskopi, hvilket kan være dyrt og tidskrævende16. Metoden beskrevet i denne protokol giver mulighed for nem og billig identifikation af komponenter, der er involveret i initiering af celledød, ved at observere forskelle i initieringshastigheder for celledød mellem transgene planter og kontrolplanter. Optimalt set skal der i et sådant set-up anvendes to digitale kameraer, da et transgent anlæg skal analyseres parallelt med et kontrolanlæg inden for samme forsøg.
I denne protokol blev PVY-stammen N-Wilga anvendt; dog kan andre stammer af denne virus, for eksempel GFP-mærket PVY (PVY-N605 (123) -GFP)7, også anvendes. Desuden kunne andre patosystemer, som resulterer i programmeret celledødsudvikling, undersøges ved hjælp af denne protokol med mindre modifikationer.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Barbara Jaklič for teknisk bistand. Denne forskning blev støttet økonomisk af det slovenske forsknings- og innovationsagentur (forskningskernefinansiering nr. P4-0165 og projekt Z4-3217: Deciphering redox-related signaling interconnectedness in potato resistance against viruses).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Autoclave A-21 CAV | Kambi |
N/A | |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
| Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
| DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
| Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
| Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
| Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
| Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
| Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
| Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
| Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
| Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
| Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
| Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
| Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
| NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
| Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
| pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
| Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
| Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
| Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
| Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
| Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
| Tweezers | Braun | BD033R |
References
- Karasev, A. V., Gray, S. M. Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato. Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).
- Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity. Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).
- Szajko, K., et al. The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance. Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).
- Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding. Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).
- Lukan, T., et al. Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato. Frontiers in Plant Science. 9, 168 (2018).
- Baebler, Š, et al. Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato. Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).
- Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy. Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).
- Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. Potato in vitro culture techniques and biotechnology. Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator). Nature. 470, 110-115 (2011).
- Roden, L. C., Ingle, R. A. Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions. Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).
- Srivastava, D., et al. Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response. Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).
- Mulaosmanovic, E., et al. High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis. Plant Methods. 16, 62 (2020).
- Martinelli, F., et al. Advanced methods of plant disease detection. A review. Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).
- Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review. Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426 (2019).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Rowarth, N. M., et al. RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis). BMC Plant Biology. 21 (1), 375 (2021).
