Summary
يؤكد التحقيق الأولي أن النزف تحت العنكبوتية (SAH) يسبب زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. يتطلب تقييم انقباض الخلايا المحيطة بعد SAH التمييز بين خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة. ومن ثم ، تم تطوير إجراء لتسمية pericytes الدماغ قابلة للحياة وغير قابلة للحياة في وقت واحد في أقسام الدماغ ، مما يسهل الملاحظة باستخدام مجهر متحد البؤر عالي الدقة.
Abstract
الخلايا المحيطة هي خلايا جدارية حاسمة تقع داخل دوران الأوعية الدقيقة الدماغية ، وهي محورية في تعديل تدفق الدم الدماغي بنشاط عن طريق تعديلات الانقباض. تقليديا ، يتم قياس انقباضها من خلال مراقبة التحولات المورفولوجية وتغيرات قطر الشعيرات الدموية القريبة في ظل ظروف محددة. ومع ذلك ، فإن تثبيت ما بعد الأنسجة ، وتقييم الحيوية وما يترتب على ذلك من انقباض pericyte للخلايا المحيطة بالدماغ المصورة يصبح معرضا للخطر. وبالمثل ، فإن وضع العلامات الوراثية على الخلايا المحيطة بالدماغ يقصر في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، لا سيما في الحالات العصبية مثل النزف تحت العنكبوتية (SAH) ، حيث يتحقق تحقيقنا الأولي من صحة زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. تم وضع بروتوكول موثوق للتغلب على هذه القيود ، مما يتيح وضع علامات الفلورسنت في وقت واحد لكل من pericytes الدماغ الوظيفية وغير الوظيفية في أقسام الدماغ. تسمح طريقة وضع العلامات هذه بتصور مجهر متحد البؤر عالي الدقة ، مع وضع علامة متزامنة على الأوعية الدموية الدقيقة لشريحة الدماغ. يوفر هذا البروتوكول المبتكر وسيلة لتقييم انقباض pericyte في الدماغ ، وتأثيره على قطر الشعيرات الدموية ، وهيكل pericyte. إن التحقيق في انقباض الخلايا المحيطة بالدماغ في سياق SAH يعطي فهما ثاقبا لآثاره على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية.
Introduction
تحيط الخلايا المحيطة بالدماغ ، التي تتميز بنتوءاتها النحيلة وأجسام الخلايا البارزة ، دوران الأوعية الدقيقة 1,2. في حين أن زيادة تدفق الدم الدماغي مدفوعة في الغالب بتمدد الشعيرات الدموية ، فإن الشرايين الأصغر تظهر معدلات تمدد أبطأ3. يمارس انقباض Pericyte تأثيرا على قطر الشعيرات الدموية ومورفولوجيا pericyte ، مما يؤثر على ديناميكيات الأوعية الدموية4. يؤدي تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ إلى انقباض الشعيرات الدموية ، وفي السيناريوهات المرضية ، قد يعيق الانكماش المفرط تدفق كرات الدم الحمراء5. يمكن لعوامل مختلفة ، بما في ذلك النورإبينفرين المنطلق من الموضع الأزرق ، أن تحفز تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ داخل الشعيرات الدموية6. مع دور تنظيمي في تدفق الدم الدماغي ، تظهر pericytes تخليق 20-HETE ، وتعمل كمستشعر للأكسجين أثناء فرط التأكسج7. يؤثر الانقباض التأكسدي النترجي الناجم عن الإجهاد في خلايا الدماغ بشكل ضار على الشعيرات الدموية5. على الرغم من التحقيقات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي في تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ 8 ، لا تزال المعرفة محدودة فيما يتعلقبتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة داخل شرائح الدماغ.
بشكل حاسم ، فإن التصوير بعد تثبيت الأنسجة للخلايا المحيطة بالدماغ يضر بحيويتها وتقييم الانقباض اللاحق. علاوة على ذلك ، في سيناريوهات مثل الاضطرابات العصبية (على سبيل المثال ، نزيف تحت العنكبوتية - SAH) ، يفشل وضع العلامات المعدلة وراثيا للخلايا المحيطة بالدماغ في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، كما أكدت دراستنا الأولية لموت الخلايا المحيطة بالدماغ التي يسببهاSAH 9.
للتغلب على هذه التحديات ، استخدمنا TO-PRO-3 لتسمية الخلايا المحيطة الحية ، بينما تم تلطيخ المتوفين بيوديد البروبيديوم (PI). استخدمنا تقنيات التصوير متحد البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ مع الحفاظ على نشاط الشريحة أثناء التصوير. تهدف هذه المقالة إلى تقديم طريقة قابلة للتكرار لتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ ، والتي تعمل كأداة قيمة للتحقيق في تأثير pericytes الدماغ على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية بعد SAH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات واستخدام بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). تم استخدام فئران Sprague-Dawley (SD) من كلا الجنسين ، 300-350 جم ، في هذه الدراسة.
1. تحفيز نموذج SAH
- تخدير الفئران باستخدام 2٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين. الحفاظ على التخدير عن طريق توفير التخدير المستمر بالاستنشاق مع الأيزوفلوران (1٪ -3٪). تأمين رأس الجرذ باستخدام جهاز تجسيمي (انظر جدول المواد).
- قم بإنشاء نموذج SAH باتباع الخطوات أدناه.
- أدخل إبرة الحقن المجهري في الصهريج فوق السيلار. بعد ذلك ، قم بحقن الدم الذاتي من شريان ذيل الفئران (بدون مضادات التخثر) في الخزان فوق السيلار باستخدام مضخة حقنة (انظر جدول المواد).
- زرع إبرة حقن مجهري في البطين الدماغي الجانبي الأيمن باستخدام الإحداثيات المذكورة: bregma ، −0.8 مم ؛ جانبي ، 1.4 مم ؛ العمق ، 4 مم9. بالنسبة لمجموعات SAH ، قم بحقن 0.2 مل من دم شريان ذيل الفئران. بالنسبة للمجموعات الوهمية ، يتم تطبيق نفس الحجم من محلول ملحي متساوي التوتر (الشكل 1 أ).
2. إعداد شريحة الدماغ وتحقيق الاستقرار
- تخدير الفئران بعمق باستخدام استنشاق إيزوفلوران 2٪. بعد قطع الرأس ، استخرج الأدمغة بأكملها واغمرها في السائل النخاعي الاصطناعي المثلج (ACSF).
ملاحظة: استخدم محاليل ACSF المحضرة حديثا بالتركيب التالي: 134 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.8 مللي مول KCl ، 29 مللي متر NaHCO3 ، 1.1 مللي متر NaH 2 PO 4 ، 1.5 mM MgSO4 ، 2.5 mM CaCl2 ، و 10.11 mM D-Glucose (انظر جدول المواد). الحفاظ على درجة الحموضة بين 7.3 و 7.4. - استخدم اهتزازا (انظر جدول المواد) لتحضير شرائح الدماغ الحادة بسمك 200 ميكرومتر من فئران SD في ACSF المثلج البارد الذي يتم تهويته بنسبة 5٪ CO 2 و 95٪ O 2 (الشكل 2).
- ضع شرائح الدماغ الحادة التي يبلغ سمكها 200 ميكرومتر في غرفة تخزين على شبكة نايلون مغمورة في ACSF. قم بموازنة محلول ACSF مع 95٪ O 2 و 5٪ CO2 ، مع الحفاظ على نطاق درجة حرارة 35-37 درجة مئوية. اسمح لشرائح الدماغ بالاستقرار لمدة 2 ساعة ، مما يمنحها الوقت للتكيف (الشكل 3).
3. وضع العلامات على pericytes في شرائح الدماغ الحادة باستخدام TO-PRO-3
ملاحظة: تم تصنيف الخلايا المحيطة من شرائح الدماغ الحادة بشكل فلوري باستخدام التتبع TO-PRO-310.
- أضف صبغة الفلورسنت TO-PRO-3 إلى ACSF ، وتحقيق تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. احتضان شرائح الدماغ الحادة في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة باستخدام ACSF المحتوي على TO-PRO-3 لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: تذكر ارتداء قفازات اللاتكس أثناء التعامل مع TO-PRO-3 للحماية. - انقل مصفاة شبكة النايلون ، التي تحمل شرائح الدماغ ، من غرفة التحميل إلى غرفة شطف الألواح المكونة من 6 آبار (انظر جدول المواد). اترك شرائح الدماغ تبقى في غرفة الشطف لمدة 10 دقائق (الشكل 4 د).
ملاحظة: تنهي خطوة الشطف هذه عملية التلوين ، وتقلل من وضع العلامات على الخلفية ، وتمنع تلطيخ غير محدد. - اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محلول ACSF المتوازن مع خليط من 5٪ CO 2 و 95٪ O2. توقف خطوة الشطف هذه امتصاص الصبغة وتقلل من وضع العلامات على الخلفية (الشكل 4C).
4. تلطيخ الخلايا غير الحيوية من دوران الأوعية الدقيقة الدماغية في شرائح الدماغ الحادة
- احتضان شرائح الدماغ محملة مسبقا ب TO-PRO-3 عند 37 درجة مئوية مع إيزولكتين B4 مترافق مع Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4 ؛ 5 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في بيئة مظلمة. بعد الحضانة ، شطف شرائح الدماغ لمدة 15 دقيقة في ACSF (الشكل 4E).
- احتضان شرائح الدماغ في ACSF بالغاز مع 5٪ CO 2 و 95٪ O2 كالمعتاد. أضف يوديد البروبيديوم (PI) بتركيز 37 ميكرومتر إلى كلا المحلولين عند 37 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى تسمية خلايا الدماغ غير الحيوية. احتضن المستحضرات في محلول ACSF لمدة 60 دقيقة في الظلام (الشكل 4F).
- بعد ذلك ، اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محاليل ACSF لوقف امتصاص الصبغة وتقليل وضع العلامات على الخلفية.
5. تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ الحادة
- انقل شرائح الدماغ برفق إلى أطباق متحدة البؤر ذات قاع زجاجي (انظر جدول المواد) باستخدام ماصات باستور البلاستيكية. املأ الأطباق بمحلول ACSF تمت موازنته مسبقا مع 5٪ CO 2 و 95٪ O2. استخدم شبكة حديدية لتثبيت شرائح دماغ الفئران في مكانها.
- نقل الأطباق البؤرية ذات القاع الزجاجي إلى مرحلة المجهر متحد البؤر. ضع شريحة الدماغ الحادة في قاع الطبق وقم بإعطائها9 بمحلول ACSF متوازن بمزيج من 95٪ O 2 و 5٪ CO2 أثناء التصوير المجهري متحد البؤر (الشكل 5A والشكل 5Ab).
- تصور خلايا جدار الأوعية الدموية الدماغية القشرية باستخدام هدف 40x. التقط حزم الصور باستخدام برامج متوافقة (انظر جدول المواد). استخدم المرشحات المناسبة ل IB4 (الإثارة / الانبعاث 460 نانومتر / 520 نانومتر) ، PI (الإثارة / الانبعاث 545 نانومتر / 595 نانومتر) ، و TO-PRO-3 (الإثارة / الانبعاث 606 نانومتر / 666 نانومتر) (الشكل 5D).
ملاحظة: التقط صورا بالتفاصيل التالية: عدسة DIC N1 موضوعية 40× ، 3 × 12 بت: 512 × 512 بكسل (0.22 × 0.22 مم) ، المعايرة: 0.42 ميكرومتر / بكسل. - تحديد الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة والخلايا المحيطة بناء على شبكتها ومورفولوجيتها. حدد موقع منطقة معينة تحتوي على شبكة الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة على كل شريحة دماغية والتقط الصور.
- لاحظ بعناية موقع التصوير لضمان الاتساق في اللقطات اللاحقة (الشكل 5B ، C). لمزيد من المعالجة والتحليل ، استخدم برنامج تحليل الصور (ImageJ) وبرنامج تحرير الصور (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في ظل الظروف الفسيولوجية الطبيعية ، لا تخضع خلايا الدماغ عموما لموت الخلايا. يوضح الشكل 6 هذه الظاهرة ، حيث يشير اللون الأصفر إلى وجود خلايا محيطية حيوية في الدماغ. لا تظهر الخلايا المحيطة بالدماغ أي تلطيخ مع PI ، مما يشير إلى صلاحيتها. لمزيد من التحقيق فيما إذا كانت الخلايا المحيطة تظل مرتبطة بالأوعية الدموية الدقيقة بعد موت الخلية ، تم استخدام طرق في نموذج الفئران SAH ، وتم إجراء التصوير اللاحق.
تم تطوير طرق لتصوير كل من خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ بعد SAH. كما هو موضح في الشكل 7، تقع الخلايا المحيطة بالدماغ الحيوية (الأسهم الزرقاء) داخل الأوعية الدموية الدقيقة، بينما تمثل الخلايا المحيطة بالدماغ غير الحيوية بأسهم بيضاء. يسمح هذا التصور المتزامن بتحديد كل من خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية داخل شرائح الدماغ. علاوة على ذلك ، لوحظ أن خلايا الدماغ غير الحيوية التي تحمل علامة PI ظلت مرتبطة بالأوعية الدموية الدقيقة بأكملها.
الشكل 1: نموذج SAVE . (أ) تم تثبيت رأس الجرذ بإحكام بجهاز الانجذاب التجسيمي لضمان الاستقرار. تم تحفيز نموذج SAH عن طريق إدخال إبرة مجسمة بعناية في الصهريج فوق السيلار. (ب، ج) في نموذج SAH ، يدخل الدم إلى الفضاء تحت العنكبوتية داخل الجمجمة ، مما يؤثر على الدماغ. يمتلئ نصفي الكرة المخية بالدم بعد حوالي 24 ساعة من SAH. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحضير شريحة الدماغ الكاملة الحادة . (أ) كانت الحجرة السفلية مغلفة بغراء الأغاروز للتثبيت. (ب) وضع الغراء بدقة على الحجرة السفلية للالتصاق بقوة بالدماغ. (ج) تم ملء الخزان المحيط ب ACSF المثلج البارد للحفاظ على درجة الحرارة. (د) تم تحديد سمك المقطع المطلوب بعناية. (ه، و). تم نقل شرائح الدماغ بدقة إلى لوحة 6 آبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نقل الماصات وتحميل الصبغة في لوحة ذات 6 آبار. (أ) تم نقل شرائح الدماغ الحادة باستخدام ماصات باستور البلاستيكية (3 مل). كان طول الماصة المستخدمة في (أ) 18.2 سم. بالنسبة للوصلتين (ب) و (ج) ، تم قطع الطرف الرفيع لماصة باستور البلاستيكية بعناية لمنع أي ضرر محتمل لشرائح الدماغ أثناء النقل. تم نقل الألواح المكونة من 6 آبار بكفاءة من (B) إلى (C) لتلطيخ التألق في حمام مائي 37 درجة مئوية. (ب) بئر واحد من صفيحة 6 آبار يستوعب مصفاة شبكية صغيرة من النايلون ، مع أنابيب دقيقة موضوعة لتوصيل الغاز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: حضانة شرائح الدماغ الحادة. تم اتباع إجراء منهجي بدقة لتسمية pericytes مع TO-PRO-3 في شرائح الدماغ الحادة. (أ) في البداية ، تم ملء بئر واحد من صفيحة ذات ستة آبار (12 × 8 سم) ب 10 مل من ACSF ، مما يضمن التهوية المناسبة عن طريق فقاعات المحلول باستخدام أنابيب دقيقة متصلة بخليط من 95٪ O 2 و 5٪ CO2. (ب) بعد ذلك، نقلت شرائح الدماغ بدقة إلى الصفيحة ذات الستة آبار. (ج) تم إدخال 10 ميكرولتر من محلول المخزون TO-PRO-3 في غرفة تحميل الصبغة ، مع التقليب بلطف لتسهيل إذابة الصبغة (D). (ه، و) لمزيد من توصيف شرائح الدماغ ، تم إجراء تلطيخ مع IB4 (1 ميكرومتر في ACSF) و PI (1 ميكرومتر في ACSF). مكنت هذه الخطوات المتسلسلة من وضع العلامات الناجحة للخلايا المحيطة ب TO-PRO-3 في شرائح الدماغ الحادة ، وبالتالي تسهيل التحليل والفحص اللاحقين لخلايا الدماغ الموصوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصوير الخلايا المحيطة الحيوية وغير الحيوية في الدماغ في شرائح الدماغ. (أ) المحلول موزون بخليط من 95٪ O 2 و5٪ CO2 يتم توصيله عبر الأنبوب. (ب-ه) الإعداد للتصوير عالي الدقة للخلايا البطانية التي تحمل علامة TO-PRO-3 والبطانية التي تحمل علامة IB4 والخلايا ذات العلامات PI في شرائح الدماغ الحادة. ه: الفحص المجهري البؤري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صورة الخلايا المحيطة الحيوية للدماغ في شرائح الدماغ. (أ) تم تمييز الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة ب IB4 (أخضر). (ب) تم تمييز الخلايا غير الحيوية ب PI. (ج) تم تمييز الخلايا المحيطة الحيوية ب TO-PRO-3 (أصفر). ( د) يتم عرض الصورة المدمجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: صورة تمثيلية لخلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شريحة دماغية بعد SAH. (أ) تم تمييز الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة ب IB4 (أخضر). (ب) تم تمييز الخلايا غير الحيوية ب PI (أحمر). (ج) تم تمييز الخلايا المحيطة الحيوية ب TO-PRO-3 (أصفر). ( د) يتم عرض الصورة المدمجة. تشير الأسهم الزرقاء إلى أمثلة على الخلايا المحيطة بالدماغ الحيوية ، بينما تشير الأسهم البيضاء إلى أمثلة على خلايا الدماغ غير الحيوية. والجدير بالذكر أن نوى الخلايا المحيطة لا تبرز فوق سطح الأوعية الدموية الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: العلاقة الموجبة بين عدد الخلايا المحيطة غير الحيوية والوقت بعد SAH. تم استخدام التصوير البؤري عالي الدقة لالتقاط الخلايا المحيطة بالدماغ في نقاط زمنية مختلفة بعد SAH. بدأ موت الخلايا الملحوظ للخلايا المحيطة بالدماغ في 6 ساعات بعد SAH ، كما هو موضح بالأسهم البيضاء في (A). في وقت لاحق ، كانت هناك زيادة كبيرة في وفيات pericyte من علامة 6 ساعات فصاعدا. أظهر عدد الخلايا المحيطة غير الحيوية ارتباطا إيجابيا بالوقت المنقضي بعد SAH ، كما هو موضح في (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطوير تقنيات تصوير متحدة البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ الحيوية ، وخلايا الدماغ غير الحيوية ، والأوعية الدموية الدقيقة في شرائح الدماغ. في شرائح دماغ الفئران الحادة ، تستلزم العملية وضع العلامات الأولية على الخلايا المحيطة ب TO-PRO-311 ، تليها الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة مع IB412. في وقت لاحق ، يتم تحديد pericytes المتوفى باستخدام PI. هذا البروتوكول واضح ومباشر وقابل للتكرار وقابل للتطبيق بدرجة كبيرة على البحث الوظيفي.
لتتبع الخلايا المحيطة بالدماغ على وجه التحديد داخل الجهاز العصبي ، يتم استخدام الفلوروفور الأحمر البعيد TO-PRO-3. في حين أن TO-PRO-3 يلطخ في الغالب نوى الأنسجة الثابتة13 ، فإنه يندمج بشكل انتقائي في pericytes الحية خارج الجسم الحي عند تطبيقه في محلول ملحيفسيولوجي 14. أكدت الدراسات السابقة التحديد القاطع لخلايا دماغ الفئران باستخدام TO-PRO-315. هذا الفلوروفور يصنف بشكل فعال pericytes الدماغ الحيوية11. في المقابل ، يعمل PI ، وهو فلوروكروم مشحون شائع الاستخدام لتقييم صلاحية الخلية في الوقت الفعلي12 ، كعلامة للخلايا المتدهورة عند تطبيقها قبل التثبيت (تلطيخ PI قبل التثبيت)16. ومع ذلك ، نظرا لأن الخصائص المورفولوجية للخلايا المحيطة ، وخاصة نواتها ، لا تمتد فوق سطح الأوعية الدموية الدقيقة ، فإن التمييز بين نوى البطانة والنواة المحيطة باستخدام تلطيخ PI يمكن أن يكون أمرا صعبا ، كما هو موضح بالسهم الأبيض في الشكل 8 أ. اقترحت الدراسات التي تتضمن المجهر الإلكتروني لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد لمنطقة CA1 من قرن آمون الفئران أن ما يقرب من ثلث البطانة مغطى ب somas وعمليات pericytes17.
في الشكل 6، لوحظت الخلايا المحيطة بالدماغ المشار إليها ب TO-PRO-3 داخل الأوعية الدموية الدقيقة. تكشف الصور متحدة البؤر للأوعية الدموية الدماغية الدقيقة الموضحة ب IB4 و PI أن عددا قليلا فقط من الخلايا يخضع لموت الخلايا أثناء عملية التقسيم ، كما يتضح من عدم وجود خلايا ميتة موجبة PI في الشكل 6. وبالتالي ، يتم استخدام نموذج SAH للتحقيق في وجود pericytes غير الحيوية. يوضح الشكل 7 أن موت الخلايا داخل شرائح الدماغ يكون أكثر بروزا في الخلايا المحيطة مقارنة بالخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك ، في الشكل 8 أ ، لوحظت زيادة كبيرة في وفيات pericyte بدءا من 6 ساعات بعد SAH. يوضح الشكل 8B وجود علاقة إيجابية بين عدد الخلايا المحيطة غير الحيوية والوقت المنقضي بعد SAH. ومع ذلك ، لم يتم توثيق دراسة شاملة تصور كل من خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية بأفضل ما في المعرفة الحالية.
في الوقت الحالي ، لا يزال من غير المؤكد ما إذا كانت الخلايا المحيطة من الأنواع أو الأنظمة الأخرى (مثل القلب والأمعاء الدقيقة) تظهر أيضا حالات حيوية وغير حيوية في شرائح حادة بعد SAH. في الختام ، يقدم البروتوكول المقدم نهجا قابلا للتكرار لتصوير كل من خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ بعد SAH. نظرا لبساطتها وموثوقيتها ، يمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن التنوع الوظيفي والهيكلي للخلايا المحيطة في شرائح الدماغ وتسهيل التحقيقات الخلوية التفصيلية في نماذج الأمراض المختلفة المتعلقة بالفيزيولوجيا المرضية pericyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81960226,81760223); مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة يوننان (202001AS070045،202301AY070001-011)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K.
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T.
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
