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Neuroscience

इमेजिंग महत्वपूर्ण और गैर महत्वपूर्ण मस्तिष्क Pericytes Subarachnoid रक्तस्राव के बाद मस्तिष्क स्लाइस में

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65873
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, 2Clinical Medical Research Center, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

Summary

प्रारंभिक जांच से पुष्टि होती है कि सबराचोनोइड रक्तस्राव (एसएएच) मस्तिष्क पेरिसाइट निधन का कारण बनता है। पेरिसाइट सिकुड़न के बाद एसएएच का मूल्यांकन करने के लिए व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स के बीच भेदभाव की आवश्यकता होती है। इसलिए, मस्तिष्क वर्गों में समवर्ती रूप से व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स को लेबल करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की गई है, जो एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अवलोकन की सुविधा प्रदान करती है।

Abstract

पेरिसाइट्स सेरेब्रल माइक्रोकिरकुलेशन के भीतर स्थित महत्वपूर्ण भित्ति कोशिकाएं हैं, जो संकुचन समायोजन के माध्यम से मस्तिष्क रक्त प्रवाह को सक्रिय रूप से संशोधित करने में महत्वपूर्ण हैं। परंपरागत रूप से, विशिष्ट परिस्थितियों में रूपात्मक बदलाव और आस-पास केशिका व्यास परिवर्तनों को देखकर उनकी सिकुड़न का अनुमान लगाया जाता है। फिर भी, ऊतक निर्धारण के बाद, जीवन शक्ति का मूल्यांकन और इमेज्ड मस्तिष्क पेरिसाइट्स की आगामी पेरिसाइट सिकुड़न समझौता हो जाता है। इसी तरह, आनुवंशिक रूप से लेबलिंग मस्तिष्क पेरिसाइट्स व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य पेरिसाइट्स के बीच अंतर करने में कम हो जाता है, विशेष रूप से सबराचोनोइड रक्तस्राव (एसएएच) जैसी न्यूरोलॉजिक स्थितियों में, जहां हमारी प्रारंभिक जांच मस्तिष्क पेरिसाइट निधन को मान्य करती है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल तैयार किया गया है, जिससे मस्तिष्क वर्गों में कार्यात्मक और गैर-कार्यात्मक मस्तिष्क पेरिसाइट्स दोनों के एक साथ फ्लोरोसेंट टैगिंग सक्षम हो सके। इस लेबलिंग विधि उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोप दृश्य की अनुमति देता है, समवर्ती मस्तिष्क टुकड़ा microvasculature अंकन. यह अभिनव प्रोटोकॉल मस्तिष्क पेरिसाइट सिकुड़न, केशिका व्यास और पेरिसाइट संरचना पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन करने का एक साधन प्रदान करता है। एसएएच संदर्भ के भीतर मस्तिष्क पेरिसाइट सिकुड़न की जांच सेरेब्रल माइक्रोकिरकुलेशन पर इसके प्रभावों की व्यावहारिक समझ पैदा करती है।

Introduction

मस्तिष्क pericytes, उनके पतला protuberances और उभरे हुए सेल निकायों द्वारा प्रतिष्ठित, microcirculation 1,2 घेर. जबकि सेरेब्रल रक्त प्रवाह वृद्धि मुख्य रूप से केशिका फैलाव द्वारा संचालित होती है, छोटी धमनियां फैलाव की धीमी दर प्रदर्शित करती हैं3. पेरिसाइट सिकुड़न केशिका व्यास और पेरिसाइट आकृति विज्ञान पर प्रभाव डालती है, संवहनी गतिशीलता को प्रभावित करती है4. मस्तिष्क पेरिसाइट्स के संकुचन से केशिका कसना होता है, और रोग परिदृश्यों में, अत्यधिक संकुचन एरिथ्रोसाइट प्रवाह को बाधित कर सकता है5. लोकस कोरुलेस से जारी नॉरपेनेफ्रिन सहित विभिन्न कारक, केशिकाओं के भीतर मस्तिष्क पेरिसाइट संकुचन को प्रेरित कर सकते हैं6. सेरेब्रल रक्त प्रवाह में एक नियामक भूमिका के साथ, पेरिसाइट्स 20-एचईटीई संश्लेषण का प्रदर्शन करते हैं, जो हाइपरॉक्सिया7 के दौरान ऑक्सीजन सेंसर के रूप में कार्य करते हैं। मस्तिष्क पेरिसाइट्स के ऑक्सीडेटिव-नाइट्रेटिव तनाव-ट्रिगर संकुचन केशिकाओं को हानिकारक रूप से प्रभावित करता है5. मस्तिष्क पेरिसाइट संकुचन8 में विवो और पूर्व विवो जांच दोनों के बावजूद, मस्तिष्क स्लाइस के भीतर व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स की इमेजिंग के बारे में सीमित ज्ञान बनी रहती है।

महत्वपूर्ण रूप से, मस्तिष्क पेरिसाइट्स के पोस्ट-ऊतक निर्धारण इमेजिंग उनकी जीवन शक्ति और बाद में सिकुड़न मूल्यांकन से समझौता करते हैं। इसके अलावा, न्यूरोलॉजिकल विकारों (जैसे, सबराचोनोइड रक्तस्राव - एसएएच) जैसे परिदृश्यों में, मस्तिष्क पेरिसाइट्स की ट्रांसजेनिक लेबलिंग व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य पेरिसाइट्स के बीच अंतर करने में विफल रहती है, जैसा कि हमारे प्रारंभिक एसएएच-प्रेरित मस्तिष्क पेरिसाइट मृत्यु अध्ययन9 द्वारा पुष्टि की गई है।

इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, हमने जीवित पेरिसाइट्स को लेबल करने के लिए टीओ-प्रो -3 को नियोजित किया, जबकि मृतक लोगों को प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ दाग दिया गया था। हम इमेजिंग के दौरान टुकड़ा गतिविधि को संरक्षित करते हुए मस्तिष्क स्लाइस में व्यवहार्य और गैर व्यवहार्य मस्तिष्क pericytes कल्पना करने के लिए उच्च संकल्प confocal इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का इस्तेमाल किया. इस लेख का उद्देश्य मस्तिष्क स्लाइस में व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स इमेजिंग के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रस्तुत करना है, जो एसएएच के बाद मस्तिष्क माइक्रोकिरकुलेशन पर मस्तिष्क पेरिसाइट्स के प्रभाव की जांच करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य करता है।

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Protocol

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल Kunming चिकित्सा विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (kmmu20220945). वर्तमान अध्ययन के लिए दोनों लिंगों के स्प्रैग-डॉली (एसडी) चूहों, 300-350 ग्राम, का उपयोग किया गया था।

1. SAH मॉडल को प्रेरित करना

  1. 2% isoflurane और 100% ऑक्सीजन का उपयोग चूहों एनेस्थेटाइज. आइसोफ्लुरेन (1% -3%) के साथ निरंतर इनहेलेशन एनेस्थीसिया की आपूर्ति करके संज्ञाहरण बनाए रखें। एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग करके चूहे के सिर को सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके SAH मॉडल बनाएं।
    1. सुपरसेलर सिस्टर्न में एक माइक्रोइंजेक्शन सुई डालें। फिर, चूहे की पूंछ धमनी (थक्कारोधी के बिना) से ऑटोलॉगस रक्त को एक सिरिंज पंप ( सामग्री की तालिका) का उपयोग करके सुपरसेलर सिस्टर्न में इंजेक्ट करें।
    2. उल्लिखित निर्देशांक का उपयोग करके सही पार्श्व सेरेब्रल वेंट्रिकल में एक माइक्रोइंजेक्शन सुई प्रत्यारोपित करें: ब्रेग्मा, -0.8 मिमी; पार्श्व, 1.4 मिमी; गहराई, 4 मिमी9. एसएएच समूहों के लिए, चूहे की पूंछ धमनी रक्त के 0.2 एमएल इंजेक्ट करें। नकली समूहों के लिए, आइसोटोनिक खारा (चित्रा 1 ए) की एक ही मात्रा का प्रशासन करें।

2. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और स्थिरीकरण

  1. गहराई से 2% isoflurane साँस लेना का उपयोग चूहों संवेदनाहारी. सिर काटने के बाद, पूरे दिमाग को निकालें और उन्हें बर्फ-ठंडे कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) में डुबो दें।
    नोट: निम्नलिखित संरचना के साथ हौसले से तैयार एसीएसएफ समाधान का उपयोग करें: 134 एमएम एनएसीएल, 2.8 एमएम केसीएल, 29 एमएम एनएएचसीओ3, 1.1 एमएम एनएएच 2 पीओ 4, 1.5 एमएम एमजीएसओ4, 2.5 एमएम सीएसीएल2, और 10.11 एमएम डी-ग्लूकोज (सामग्री की तालिकादेखें)। पीएच 7.3 और 7.4 के बीच बनाए रखें।
  2. बर्फ-ठंडे एसीएसएफ में एसडी चूहों से 200 माइक्रोन की मोटाई के साथ तीव्र मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने के लिए एक वाइब्रेटोम (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें जो 5% सीओ 2 और 95% ओ 2(चित्रा 2)के साथ वातित है।
  3. एसीएसएफ में जलमग्न एक नायलॉन जाल पर एक भंडारण कक्ष में 200 माइक्रोन मोटी तीव्र मस्तिष्क स्लाइस रखें. एसीएसएफ समाधान को 95% O 2 और 5% CO2 के साथ संतुलित करें, 35-37 डिग्री सेल्सियस की तापमान सीमा बनाए रखें। मस्तिष्क स्लाइस उन्हें समायोजित करने के लिए समय दे रही है(चित्रा 3) 2 घंटे के लिए स्थिर करने के लिए अनुमति दें.

3. TO-PRO-3 के साथ तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में pericytes लेबलिंग

नोट: तीव्र मस्तिष्क स्लाइस से pericytes fluorescently अनुरेखक करने के लिए प्रो -310 का उपयोग लेबल थे.

  1. एसीएसएफ में फ्लोरोसेंट डाई टू-प्रो -3 जोड़ें, 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करें। 20 मिनट के लिए TO-PRO-3 युक्त ACSF के साथ एक अंधेरे वातावरण में कमरे के तापमान पर तीव्र मस्तिष्क स्लाइस सेते हैं.
    नोट: सुरक्षा के लिए TO-PRO-3 को संभालते समय लेटेक्स दस्ताने पहनना याद रखें।
  2. नायलॉन जाल छलनी हस्तांतरण, मस्तिष्क स्लाइस ले जाने के लिए, एक 6 अच्छी तरह से थाली rinsing कक्ष ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए लोड हो रहा है कक्ष से. मस्तिष्क स्लाइस 10 मिनट (चित्रा 4 डी) के लिए rinsing कक्ष में रहने के लिए अनुमति दें.
    नोट: यह rinsing कदम धुंधला प्रक्रिया को समाप्त करता है, पृष्ठभूमि लेबलिंग कम हो जाती है, और निरर्थक धुंधला रोकता है।
  3. एसीएसएफ समाधान का उपयोग करके कुल 15 मिनट के लिए तैयारी को कुल्ला, जो 5% सीओ 2 और 95% ओ2 के मिश्रण से संतुलित है। यह rinsing कदम डाई तेज रोकता है और पृष्ठभूमि लेबलिंग (चित्रा 4C) को कम करता है.

4. तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में सेरेब्रल माइक्रोकिरकुलेशन के गैर-महत्वपूर्ण पेरिसाइट्स धुंधला हो जाना

  1. एक अंधेरे वातावरण में 30 मिनट के लिए एलेक्सा फ्लोर 488 (FITC-ISOB4; 5 माइक्रोग्राम/एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) के लिए संयुग्मित आइसोलेक्टिन बी 4 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर TO-PRO-3 के साथ प्रीलोडेड मस्तिष्क स्लाइस सेते हैं। इनक्यूबेशन बाद, एसीएसएफ(चित्रा 4ई)में 15 मिनट के लिए मस्तिष्क स्लाइस कुल्ला.
  2. एसीएसएफ में मस्तिष्क स्लाइस को हमेशा की तरह 5% सीओ 2 और 95% ओ2 के साथ गैस्ड करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर दोनों समाधानों के लिए 37 माइक्रोन की एकाग्रता पर प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) जोड़ें। यह गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स को लेबल करेगा। अंधेरे में 60 मिनट के लिए इस एसीएसएफ समाधान में तैयारी को इनक्यूबेट करें (चित्रा 4एफ)।
  3. अगला, डाई तेज को रोकने और पृष्ठभूमि लेबलिंग को कम करने के लिए एसीएसएफ समाधान के साथ 15 मिनट के लिए तैयारी कुल्ला.

5. तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में महत्वपूर्ण और गैर महत्वपूर्ण मस्तिष्क pericytes की इमेजिंग

  1. धीरे प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर कांच के नीचे confocal व्यंजन (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए मस्तिष्क स्लाइस हस्तांतरण. व्यंजन को एसीएसएफ समाधान के साथ भरें जो पहले 5% सीओ 2 और 95% ओ2 के साथ संतुलित था। जगह में चूहे मस्तिष्क स्लाइस सुरक्षित करने के लिए एक लोहे की जाली का प्रयोग करें.
  2. कांच के नीचे के कॉन्फोकल व्यंजनों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के चरण में स्थानांतरित करें। डिश के तल पर तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा स्थिति और एसीएसएफ समाधान के साथ95 % ओ 2 और 5% सीओ2 के मिश्रण के साथ संतुलित 95% ओ 2 और 5% सीओके मिश्रण के साथ यह कन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग (चित्रा 5 ए और चित्रा 5 एबी ') के दौरान इत्र 9.
  3. एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर मस्तिष्क cortical microvasculature की दीवार कोशिकाओं कल्पना. संगत सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि स्टैक कैप्चर करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। IB4 (उत्तेजना/उत्सर्जन 460 एनएम/520 एनएम), पीआई (उत्तेजना/उत्सर्जन 545 एनएम/595 एनएम), और टीओ-प्रो -3 (उत्तेजना/उत्सर्जन 606 एनएम/666 एनएम)(चित्रा 5डी)के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करें।
    NOTE: निम्न विवरणहरूको साथ छविहरू कम्प्या: 40× DIC N1 वस्तुनिष्ठ लेन्स, 3 × 12 बिट: 512 × 512 पिक्सल (0.22 × 0.22 मिमी), क्यालिब्रेशन: 0.42 μm/px।
  4. उनके नेटवर्क और आकृति विज्ञान के आधार पर सेरेब्रल माइक्रोवैस्कुलचर और पेरिसाइट्स की पहचान करें। प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा पर एक मस्तिष्क microvasculature नेटवर्क युक्त एक विशिष्ट क्षेत्र का पता लगाएँ और छवियों पर कब्जा.
  5. ध्यान से इमेजिंग स्थान ध्यान दें बाद में कब्जा (चित्रा 5 बी, सी) में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए. आगे की प्रक्रिया और विश्लेषण के लिए, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (ImageJ) और फोटो संपादन सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।

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Representative Results

सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत, मस्तिष्क पेरिसाइट्स आमतौर पर कोशिका मृत्यु से नहीं गुजरते हैं। चित्रा 6 इस घटना को दिखाता है, पीले रंग के साथ महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स की उपस्थिति का संकेत मिलता है; मस्तिष्क पेरिसाइट्स पीआई के साथ कोई धुंधला नहीं दिखाते हैं, जो उनकी व्यवहार्यता का संकेत देते हैं। आगे की जांच करने के लिए कि क्या पेरिसाइट्स कोशिका मृत्यु के बाद माइक्रोवैस्कुलचर से जुड़े रहते हैं, एसएएच चूहे के मॉडल में तरीकों को नियोजित किया गया था, और बाद में इमेजिंग आयोजित की गई थी।

एसएएच के बाद मस्तिष्क स्लाइस में महत्वपूर्ण और गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स दोनों इमेजिंग के लिए तरीके विकसित किए गए हैं। जैसा कि चित्रा 7 में दर्शाया गया है, महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स (नीले तीर) माइक्रोवैस्कुलचर के भीतर स्थित हैं, जबकि गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स सफेद तीर द्वारा दर्शाए जाते हैं। यह एक साथ दृश्य मस्तिष्क स्लाइस के भीतर महत्वपूर्ण और गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स दोनों की पहचान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, यह देखा गया कि पीआई-लेबल वाले गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स पूरे माइक्रोवैस्कुलचर से जुड़े रहे।

Figure 1
चित्रा 1: एसएएच मॉडल। (ए) चूहे के सिर मजबूती स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए stereotaxic तंत्र के लिए सुरक्षित किया गया था. SAH मॉडल को सुपरसेलर सिस्टर्न में एक स्टीरियोटैक्सिक सुई को सावधानीपूर्वक डालकर प्रेरित किया गया था। (बी, सी) एसएएच मॉडल में, रक्त खोपड़ी के भीतर सबराचोनोइड स्पेस में प्रवेश करता है, जिससे मस्तिष्क प्रभावित होता है। सेरेब्रल गोलार्ध एसएएच के लगभग 24 घंटे बाद रक्त से भर जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: तीव्र पूरे मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी . (ए) नीचे कक्ष निर्धारण के लिए agarose गोंद के साथ लेपित किया गया था. (बी) मस्तिष्क को मजबूती से पालन करने के लिए गोंद को नीचे के कक्ष में सावधानीपूर्वक लागू किया गया था। (C) तापमान बनाए रखने के लिए आसपास के टैंक को बर्फ-ठंडे ACSF से भरा गया था। (डी) वांछित खंड मोटाई ध्यान से परिभाषित किया गया था। (ई, एफ)। मस्तिष्क स्लाइस सावधानी से एक 6 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित कर रहे थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक 6 अच्छी तरह से थाली में पिपेट और डाई लोड हो रहा है स्थानांतरण. (ए)तीव्र मस्तिष्क स्लाइस प्लास्टिक पाश्चर पिपेट (3 एमएल) का उपयोग कर स्थानांतरित कर रहे थे. (ं) में प्रयुक्त पिपेट की लंबाई 18ण्2 बउ थी। (बी) और (सी) के लिए, प्लास्टिक पाश्चर विंदुक की ठीक टिप ध्यान से स्थानांतरण के दौरान मस्तिष्क स्लाइस को किसी भी संभावित नुकसान को रोकने के लिए छंटनी की गई थी। 6 अच्छी तरह से प्लेटों कुशलता से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में प्रतिदीप्ति धुंधला के लिए (बी) से (सी) में संक्रमण किया गया. (बी) 6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से गैस वितरण के लिए तैनात ठीक ट्यूबिंग के साथ, एक छोटे नायलॉन जाल झरनी समायोजित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की इनक्यूबेशन। तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में TO-PRO-3 के साथ पेरिसाइट्स लेबल करने के लिए एक व्यवस्थित प्रक्रिया का सावधानीपूर्वक पालन किया गया था। (ए) प्रारंभ में, छह-अच्छी प्लेट (12 × 8 सेमी) का एक कुआं एसीएसएफ के 10 एमएल से भरा गया था, जो 95% ओ 2 और 5% सीओ2 के मिश्रण से जुड़े ठीक टयूबिंग का उपयोग करके समाधान को बुदबुदाकर उचित वातन सुनिश्चित करता है। (बी) इसके बाद, मस्तिष्क स्लाइस सावधानी से छह अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित कर रहे थे. (सी) टीओ-प्रो -3 स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोन को डाई-लोडिंग चैंबर में पेश किया गया था, जो डाई विघटन (डी) की सुविधा के लिए धीरे-धीरे आंदोलन कर रहा था। (ई, एफ) आगे मस्तिष्क स्लाइस की विशेषता के लिए, IB4 (एसीएसएफ में 1 माइक्रोन) और पीआई (एसीएसएफ में 1 माइक्रोन) के साथ धुंधला हो जाना आयोजित किया गया था। इन अनुक्रमिक कदम तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में करने के लिए प्रो -3 के साथ pericytes के सफल लेबलिंग सक्षम, इस प्रकार लेबल मस्तिष्क pericytes के बाद के विश्लेषण और परीक्षा की सुविधा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मस्तिष्क स्लाइस में महत्वपूर्ण और गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स की इमेजिंग। (ए) समाधान ट्यूबिंग के माध्यम से वितरित 95% ओ 2 और 5% सीओ2 के मिश्रण के साथ संतुलित है। (बीई) तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में करने के लिए प्रो -3-लेबल, IB4 लेबल endothelial, और पीआई लेबल कोशिकाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए सेटअप. (ई) कन्फोकल माइक्रोस्कोपी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: मस्तिष्क स्लाइस में महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स की छवि । (ए) सेरेब्रल माइक्रोवास्कुलचर को आईबी 4 (हरा) के साथ लेबल किया गया था। (बी) गैर-महत्वपूर्ण कोशिकाओं को पीआई के साथ लेबल किया गया था। (सी)महत्वपूर्ण पेरिसाइट्स को टीओ-प्रो -3 (पीला) के साथ लेबल किया गया था। (D) मर्ज की गई छवि प्रदर्शित होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एसएएच के बाद एक मस्तिष्क टुकड़ा में महत्वपूर्ण और गैर महत्वपूर्ण मस्तिष्क pericytes की प्रतिनिधि छवि. (ए) सेरेब्रल माइक्रोवैस्कुलचर को आईबी 4 (हरा) के साथ लेबल किया गया था। (बी) गैर-महत्वपूर्ण कोशिकाओं को पीआई (लाल) के साथ लेबल किया गया था। (सी)महत्वपूर्ण पेरिसाइट्स को टीओ-प्रो -3 (पीला) के साथ लेबल किया गया था। (D) मर्ज की गई छवि प्रदर्शित होती है। नीले तीर महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स के उदाहरणों को इंगित करते हैं, जबकि सफेद तीर गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स के उदाहरणों का संकेत देते हैं। विशेष रूप से, पेरिसाइट्स के नाभिक माइक्रोवैस्कुलर सतह के ऊपर नहीं फैलते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एसएएच के बाद गैर-महत्वपूर्ण पेरिसाइट्स और समय की संख्या के बीच सकारात्मक सहसंबंध। उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग को एसएएच के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर मस्तिष्क पेरिसाइट्स को पकड़ने के लिए नियोजित किया गया था। मस्तिष्क पेरिसाइट्स की ध्यान देने योग्य कोशिका मृत्यु एसएएच के बाद 6 घंटे में शुरू हुई, जैसा कि (ए) में सफेद तीर द्वारा इंगित किया गया है। इसके बाद, 6 घंटे के निशान से पेरिसाइट मृत्यु में पर्याप्त वृद्धि हुई। गैर-महत्वपूर्ण पेरिसाइट्स की गिनती ने एसएएच के बाद बीतने वाले समय के साथ एक सकारात्मक सहसंबंध प्रदर्शित किया, जैसा कि (बी) में दर्शाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

विकसित महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स, गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स और मस्तिष्क स्लाइस में माइक्रोवास्कुलचर की कल्पना करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग तकनीक हैं। तीव्र चूहे मस्तिष्क स्लाइस में, प्रक्रिया में TO-PRO-311 के साथ पेरिसाइट्स की प्रारंभिक लेबलिंग होती है, इसके बाद IB412 के साथ माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं; इसके बाद, पीआई का उपयोग करके मृतक पेरिसाइट्स की पहचान की जाती है। यह प्रोटोकॉल सीधा, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कार्यात्मक अनुसंधान के लिए अत्यधिक लागू है।

विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र के भीतर मस्तिष्क पेरिसाइट्स का पता लगाने के लिए, दूर-लाल फ्लोरोफोर टीओ-प्रो -3 कार्यरत है। जबकि टीओ-प्रो -3 मुख्य रूप से निश्चित ऊतक13 के नाभिक को दाग देता है, यह चुनिंदा रूप से जीवित पेरिसाइट्स पूर्व विवो में शामिल होता है जब शारीरिक खारा14 में लागू होता है। पहले के अध्ययनों ने TO-PRO-315 का उपयोग करके murine मस्तिष्क पेरिसाइट्स की असमान पहचान की पुष्टि की है। यह फ्लोरोफोर प्रभावी रूप से महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स11 लेबल करता है। इसके विपरीत, पीआई, वास्तविक समय सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन12 के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया गया फ्लोरोक्रोम, निर्धारण (पूर्व-निर्धारण पीआई धुंधला)16से पहले लागू होने पर बिगड़ती कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है। हालांकि, चूंकि पेरिसाइट्स की रूपात्मक विशेषताएं, विशेष रूप से उनके नाभिक, माइक्रोवैस्कुलर सतह से ऊपर नहीं बढ़ते हैं, पीआई धुंधला का उपयोग करके एंडोथेलियल और पेरिसाइट नाभिक के बीच अंतर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जैसा कि चित्रा 8 ए में सफेद तीर द्वारा इंगित किया गया है। चूहे हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र के तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से जुड़े अध्ययन ने सुझाव दिया है कि एंडोथेलियम का लगभग एक तिहाई somas और पेरिसाइट्स17 की प्रक्रियाओं द्वारा कवर किया गया है.

चित्रा 6 में, करने के लिए प्रो -3 के साथ लेबल मस्तिष्क pericytes microvasculature के भीतर मनाया जाता है. IB4 और PI के साथ लेबल किए गए सेरेब्रल माइक्रोवैस्कुलचर की कॉन्फोकल छवियों से पता चलता है कि केवल कुछ कोशिकाएं सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान कोशिका मृत्यु से गुजरती हैं, जैसा कि चित्रा 6में पीआई-पॉजिटिव मृत कोशिकाओं की अनुपस्थिति से प्रमाणित है। नतीजतन, एसएएच मॉडल का उपयोग गैर-महत्वपूर्ण पेरिसाइट्स की उपस्थिति की जांच के लिए किया जाता है। चित्रा 7 दिखाता है कि, मस्तिष्क स्लाइस के भीतर, कोशिका मृत्यु एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में पेरिसाइट्स में अधिक प्रमुख है। इसके अतिरिक्त, चित्रा 8 ए में, पेरिसाइट मौत में उल्लेखनीय वृद्धि एसएएच के बाद 6 घंटे से शुरू होती है। चित्रा 8 बी गैर-महत्वपूर्ण पेरिसाइट्स की संख्या और एसएएच के बाद बीत चुके समय के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध प्रदर्शित करता है। फिर भी, महत्वपूर्ण और गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स दोनों को इमेजिंग करने वाले एक व्यापक अध्ययन को वर्तमान ज्ञान के सर्वोत्तम के लिए प्रलेखित नहीं किया गया है।

वर्तमान में, यह अनिश्चित बना हुआ है कि क्या अन्य प्रजातियों या प्रणालियों (जैसे, हृदय, छोटी आंत) से पेरिसाइट्स भी एसएएच के बाद तीव्र स्लाइस में महत्वपूर्ण और गैर-महत्वपूर्ण राज्यों को प्रकट करते हैं। अंत में, प्रदान की गई प्रोटोकॉल एसएएच के बाद मस्तिष्क स्लाइस में महत्वपूर्ण और गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स दोनों इमेजिंग के लिए एक प्रतिकृति दृष्टिकोण प्रदान करता है। इसकी सादगी और विश्वसनीयता के कारण, इस तकनीक को मस्तिष्क स्लाइस में पेरिसाइट्स की कार्यात्मक और संरचनात्मक विविधता का अनावरण करने और पेरिसाइट पैथोफिज़ियोलॉजी से संबंधित विभिन्न रोग मॉडल में विस्तृत सेलुलर जांच की सुविधा प्रदान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81960226,81760223) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; युन्नान प्रांत का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (202001AS070045,202301AY070001-011)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate ABC biochemistry ABC703006 RT
Adobe Photoshop Adobe Adobe Illustrator CS6 16.0.0 RT
Aluminium foil MIAOJIE 225 mm x 273 mm RT
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881 RT
Confocal imaging software Nikon NIS-Elements 4.10.00 RT
Confocal Laser Scanning Microscope Nikon N-SIM/C2si RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2) PENGYIDA 40L RT
Glass Bottom Confocal Dishes Beyotime FCFC020-10pcs RT
Glucose Sigma-Aldrich G5767 RT
Glue EVOBOND KH-502 RT
Ice machine XUEKE IMS-20 RT
Image analysis software National Institutes of Health Image J RT
Inhalation anesthesia system SCIENCE QAF700 RT
Isolectin B 4-FITC SIGMA L2895–2MG Store aliquots at –20 °C
KCl Sigma-Aldrich 7447–40–7 RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 RT
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506 RT
NaCl Sigma-Aldrich 7647–14–5 RT
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich 10049–21–5 RT
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761 RT
Pasteur pipette NEST Biotechnology 318314 RT
Peristaltic Pump Scientific Industries Inc Model 203 RT
Propidium (Iodide) Med Chem Express HY-D0815/CS-7538 Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus SCIENCE QA RT
Syringe pump Harvard PUMP PUMP 11 ELITE Nanomite RT
Thermostatic water bath OLABO HH-2 RT
Vibrating microtome Leica VT1200 RT

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References

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Zhang, Y. J., Li, Y. C., Yu, H. F., Li, C., Deng, H. J., Dong, Y. H., Li, G. B., Wang, F. Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (198), e65873, doi:10.3791/65873 (2023).

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