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Biology

माउस ग्लोमेरुली को लेबल करने और विश्लेषण करने के लिए एक कुशल और तेज़ तरीका

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65973
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2, 2, 1,2, 3
1Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital, Sichuan University, 2Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, 3Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University

Summary

यह अध्ययन क्यूबिक-साफ़ माउस गुर्दे से ग्लोमेरुली को लेबल और विश्लेषण करने के तरीकों का एक आसान-से-उपयोग, पूर्ण और सरल सेट प्रस्तुत करता है। ग्लोमेरुलस संख्या और मात्रा जैसे डेटा को फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) -डेक्सट्रान, लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम), या सामान्य कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और सॉफ्टवेयर जैसे इमारिस का उपयोग करके आसानी से और मज़बूती से प्राप्त किया जा सकता है।

Abstract

ग्लोमेरुली गुर्दे में मौलिक इकाइयाँ हैं; इसलिए, ग्लोमेरुली का अध्ययन गुर्दे के कार्य और विकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। जैविक इमेजिंग सहज ज्ञान युक्त जानकारी प्रदान करता है; इस प्रकार, ग्लोमेरुली को लेबल करना और निरीक्षण करना बहुत महत्वपूर्ण है। हालांकि, वर्तमान में उपयोग में ग्लोमेरुली अवलोकन विधियों को जटिल संचालन की आवश्यकता होती है, और परिणाम लेबल विवरण या त्रि-आयामी (3 डी) जानकारी खो सकते हैं। स्पष्ट, अबाधित मस्तिष्क इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण (क्यूबीआईसी) ऊतक समाशोधन तकनीक का व्यापक रूप से गुर्दे के अनुसंधान में उपयोग किया गया है, जिससे अधिक सटीक पहचान और गहरी पहचान गहराई की अनुमति मिलती है। हमने पाया कि माउस ग्लोमेरुली को क्यूबिक क्लियरिंग विधि के बाद मध्यम आणविक भार FITC-Dextran के पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा तेजी से और प्रभावी ढंग से लेबल किया जा सकता है। साफ माउस गुर्दे पूरे गुर्दे में सभी ग्लोमेरुली के तीन आयामी छवि ढेर प्राप्त करने के लिए एक प्रकाश शीट खुर्दबीन (या कटा हुआ जब एक फोकल खुर्दबी) द्वारा स्कैन किया जा सकता है. उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित, ग्लोमेरुली संकेतों को आसानी से डिजिटाइज़ किया जा सकता है और ग्लोमेरुली की संख्या, मात्रा और आवृत्ति को मापने के लिए आगे का विश्लेषण किया जा सकता है।

Introduction

विभिन्न गुर्देकी बीमारियों 1,2,3,4,5के निदान और उपचार के लिए ग्लोमेरुली की संख्या और मात्रा बहुत महत्वपूर्ण है। ग्लोमेरुली संख्या अनुमान का सुनहरा मानक भौतिक विच्छेदन / हालांकि, इस पद्धति के लिए विशेष अभिकर्मकों और उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिससे यह धीमा और महंगा 6,7,8,9 हो जाता है। बायोप्सी जानकारी का खजाना प्रदान करता है, लेकिन जाहिर है, इस विधि केवल किसी न किसी अनुमान10,11 के लिए उपयुक्त है. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), गणना टोमोग्राफी (सीटी), और एक्स-रे सहित चिकित्सा इमेजिंग प्रौद्योगिकियां, ग्लोमेरुलर डिटेक्शन 12,13,14,15में भी व्यापक रूप से उपयोग की जाती हैं, लेकिन ऐसी तकनीकों के लिए भारी उपकरणों की आवश्यकता होती है। मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्प्शन/आयनीकरण (MALDI) इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमीटर16 या मोटी और पतली सेक्शन विधि17 जैसे नए तरीकों का उपयोग ग्लोमेरुलर डिटेक्शन में भी किया गया है, हालांकि वे थकाऊ और श्रमसाध्य रहते हैं।

पारदर्शिता प्रौद्योगिकियों की मदद से, गहरी गहराई का निरीक्षण करना और मोटे ऊतकों या यहां तक कि पूरे अंगों 18,19,20,21,22,23से समृद्ध और अधिक संपूर्ण जानकारी प्राप्त करना संभव है। इसलिए, पारदर्शिता प्रौद्योगिकियों व्यापक रूप से गुर्देअनुसंधान 24 में इस्तेमाल किया गया है. साफ गुर्दे में ग्लोमेरुली का अवलोकन और पता लगाना भी शामिल है। हालांकि, इन प्रकाशित लेखों को या तो केवल संक्षेप में ग्लोमेरुलर डिटेक्शन25 के लिए संदर्भित किया गया था या ग्लोमेरुली को लेबल करने के लिए ट्रांसजेनिक जानवरों26, स्व-उत्पादित रंजक13, या उच्च सांद्रता एंटीबॉडी इनक्यूबेशन27 जैसे मुश्किल-से-प्राप्त लेबलिंग विधियों का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, हालांकि अध्ययनों ने साफ गुर्दे में ग्लोमेरुली का विश्लेषण किया था, विश्लेषण हमेशा13 तक सीमित थे या लेखकों द्वारा स्वयं26 द्वारा स्थापित विश्लेषण एल्गोरिदम पर निर्भर थे।

हम पहले चूहों के गुर्दे28 में ग्लोमेरुली लेबल करने के लिए एक और अधिक सुविधाजनक तरीका का प्रदर्शन किया है. इमारिस का उपयोग करके, हमने पाया कि ग्लोमेरुली गिनती, आवृत्ति और मात्रा जल्दी से प्राप्त की जा सकती है। इस प्रकार, यहां हम चूहों के गुर्दे के ग्लोमेरुली को लेबल और विश्लेषण करने के तरीकों का एक अधिक सुलभ, व्यापक और सरलीकृत सेट प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

इस अध्ययन में वयस्क C57BL/6 चूहों (6 सप्ताह की आयु, 25-30 ग्राम) का उपयोग किया गया था। सभी प्रक्रियाओं पशु कल्याण और प्रयोगात्मक नैतिकता के स्थानीय नियमों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया. अध्ययन को सिचुआन यूनिवर्सिटी बायोमेडिकल रिसर्च एथिक्स कमेटी के वेस्ट चाइना हॉस्पिटल द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. ग्लोमेरुली लेबलिंग और ऊतक तैयारी

  1. ग्लोमेरुली लेबलिंग
    1. काम कर रहे जांच समाधान तैयार करने के लिए 1:1 (1 मिलीग्राम: 1 एमएल) के अनुपात में 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में FITC-dextran (10 मिलीग्राम) भंग.
      नोट: काम कर रहे समाधान 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
    2. C57 माउस को माउस टेल वेन फिक्सेटर में रखें। गर्म पानी के साथ धुंध गीला, माउस पूंछ के मध्य भाग के चारों ओर धुंध लपेटें, और 1 मिनट के लिए पूंछ को गर्म करें।
    3. 75% इथेनॉल के साथ माउस पूंछ पोंछ जब तक बाएँ और दाएँ पूंछ नसों दिखाई दे रहे हैं.
    4. 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज के साथ काम कर रहे जांच समाधान के 100 माइक्रोन ड्रा करें और धीरे-धीरे माउस पूंछ नस में समाधान इंजेक्ट करें।
    5. इंजेक्शन के बाद, जांच समाधान 30 मिनट के लिए प्रसारित करते हैं. चूहों को अपने पिंजरों में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति दें।
    6. एक बार पर्याप्त परिसंचरण प्राप्त हो जाने के बाद, सोडियम पेंटोबार्बिटल (1%, 60-80 μg / किग्रा) के चूहों द्वारा इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन को गहराई से एनेस्थेटाइज करें।
  2. किडनी सैंपलिंग और फिक्सेशन
    1. एक लापरवाह स्थिति में शारीरिक प्लेट के लिए संवेदनाहारी चूहों को ठीक करें। मेडिकल टेप के साथ उनके पंजे सुरक्षित करें।
    2. त्वचा की तैयारी के बाद, सोडियम पेंटोबार्बिटल (1%, 10 मिलीग्राम / किग्रा) की घातक खुराक के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    3. पेट की गुहा को उजागर करने के लिए एक midline पेट चीरा बनाओ.
    4. गुर्दे प्रकट और धूआं हुड में एक स्केलपेल और कैंची के साथ उन्हें हटा दें. गुर्दे के लिफाफे को धीरे से हटा दें।
    5. गुर्दे लीजिए और उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में ठीक करें।
    6. कमरे के तापमान (आरटी) पर झटकों के साथ पीबीएस तीन बार 1 घंटे प्रत्येक के साथ नमूने धो लें।
    7. माइक्रोस्कोपी के लिए गुर्दे को तैयार करें।
      1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए गुर्दे को स्लाइस करें: स्लाइस मोटाई को मानकीकृत करने के लिए मस्तिष्क मैट्रिक्स (1 मिमी स्टील, 40-75 ग्राम) का उपयोग करके गुर्दे को 1 मिमी मोटी स्लाइस में काटें। 4% पीएफए में स्लाइस स्थानांतरण और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारण जारी रखें.
      2. प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के लिए पूरे गुर्दे: 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में गुर्दे को ठीक करें।

2. समाशोधन

  1. अभिकर्मक तैयारी
    1. 10% (wt/wt) N-butyldiethanolamine, 10% (wt/wt) ट्राइटन X-100 और 80% ddH2O को मिलाकर CUBIC-L अभिकर्मक तैयार करें।
    2. 45% (wt/wt) एंटीपाइरीन, 30% (wt/wt) निकोटिनामाइड, 0.5% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) N-butyldiethanolamine और 24.5% ddH2O को मिलाकर CUBIC-R अभिकर्मक तैयार करें। सुनिश्चित करें कि समाधान में 9.6-9.8 का पीएच और 1.522 का अपवर्तक सूचकांक (आरआई) है।
      नोट: CUBIC-L का उपयोग लिपिडेशन के लिए किया जाता है, और CUBIC-R का उपयोग अपवर्तक सूचकांक मिलान के लिए किया जाता है।
  2. समाशोधन प्रक्रिया
    1. एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में गुर्दे के नमूने ले लीजिए और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ उन्हें CUBIC-L में साफ़. संतोषजनक ऑप्टिकल पारदर्शिता प्राप्त करने तक हर 4 घंटे (गुर्दे के स्लाइस के लिए) या हर 24 घंटे (पूरे गुर्दे के लिए) क्यूबिक-एल बदलें।
      नोट: इस प्रक्रिया में किडनी स्लाइस के लिए 1 दिन और पूरे किडनी के लिए 5 दिन लगते हैं।
    2. प्रत्येक 1 घंटे के लिए आरटी पर कोमल मिलाते हुए के साथ पीबीएस में तीन बार नमूने धो लें.
    3. नमूनों के लिए क्यूबिक-आर लागू करें, 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने मिलाते हुए, 6 घंटे के लिए 60 आरपीएम।
    4. सीधे साफ नमूनों का निरीक्षण करें या उन्हें 1 सप्ताह के लिए आरटी पर क्यूबिक-आर से भरे काले ट्यूबों में स्टोर करें।

3. छवि अधिग्रहण

  1. कन्फोकल इमेजिंग
    नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ कटा हुआ गुर्दे के नमूनों की छवि बनाएं (लेंस: एक योजना Apo λ 4×/0.2 N1 उद्देश्य या एक योजना Apo VC 10×/0.45 DIC N1 उद्देश्य)। जेड-स्टैक के साथ बड़ी छवियों (जैसे, किडनी स्लाइस के लिए 6052 माइक्रोन x 6052 माइक्रोन) कैप्चर करें।
    1. निम्नलिखित अनुक्रम में कन्फोकल माइक्रोस्कोप चालू करें: लेजर पावर, कॉन्फोकल कंट्रोल स्विच, कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप और कॉन्फोकल हार्डवेयर। स्व-परीक्षण चलाने के बाद, कॉन्फ़ोकल सॉफ़्टवेयर चालू करें।
    2. उपयुक्त लेंस का चयन करें। CUBIC-R अभिकर्मक से नमूना निकालें, इसे कॉन्फोकल डिश में रखें, और CUBIC-R अभिकर्मक को सूखने से रोकने के लिए इसे कवर करें।
    3. नमूने को देखने के क्षेत्र के बीच में ले जाएं और फोकल विमान को तब तक समायोजित करें जब तक कि वह फ़ोकस में न हो।
    4. 3 डी पुनर्निर्माण (चरण 3.1.4.1) और बड़ी छवि पुनर्निर्माण (चरण 3.1.4.2-3.1.4.3) लागू करें।
      1. 3 डी पुनर्निर्माण (confocal): ज़ूम विमान को एक दिशा में स्विच करें जब तक कि कोई प्रतिदीप्ति दिखाई न दे; इस स्थिति को शीर्ष के रूप में परिभाषित किया गया है। फिर, ज़ूम प्लेन को विपरीत दिशा में तब तक स्विच करें जब तक कि कोई प्रतिदीप्ति दिखाई न दे; इस स्थिति को नीचे के रूप में परिभाषित किया गया है। स्कैनिंग प्रारंभ करने के लिए संवाद बॉक्स के निचले-दाएँ कोने में चलाएँ बटन क्लिक करें.
      2. बड़ी छवि पुनर्निर्माण (confocal): देखने के क्षेत्र को नमूने के मध्य में ले जाएं, और वर्तमान स्थिति को केंद्र के रूप में सेट करें। देखने की 2 x 2 फ़ील्ड चुनें.
      3. ND मल्टीफ़ंक्शन इंटरफ़ेस में, बड़ी छवियों को फिर से संगठित करने और पैनल में विभिन्न विकल्पों को सेट करने के लिए Z स्टैक का चयन करें। फिर दबाएं रन बटटो n स्कैनिंग शुरू करने के लिए।
  2. लाइट शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) इमेजिंग
    नोट: एक प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (लेंस: ईसी प्लान-नियोफ्लुअर 5x/0.16 (मध्यम एन = 1.529) उद्देश्य) के साथ पूरे गुर्दे की छवि।
    1. नमूना संलग्न करना (LSFM):
      1. नमूना फिक्सिंग एडाप्टर के लिए पारदर्शी गुर्दे को गोंद करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि गुर्दा मजबूती से जुड़ा न हो।
      2. नमूना बिन में गुर्दे भिगोएँ और खुर्दबीन प्रणाली में नमूना बिन धक्का. हैच बंद करें।
    2. निरीक्षण करें और स्कैन करें (LSFM):
      1. इंटरफ़ेस का पता लगाएँ में, नमूना को एक उपयुक्त अवलोकन स्थिति में ले जाएँ। अधिग्रहण इंटरफ़ेस पर स्विच करें, ऑप्टिकल पथ सेट करें, 488 एनएम लेजर, एलबीएफ 405/488/561/640, ऑप्टिकल स्प्लिटिंग फिल्टर ब्लॉक एसबीएस एलपी 490 का चयन करें, कैमरा 2 का चयन करें, और छद्म रंग को हरे रंग में बदलें।
      2. चैनल सबमेनू में पहले दर्ज किए गए बाएँ/दाएँ Z ऑफ़सेट मान भरें। सबसे छोटे ज़ूम (0.36) का चयन करें और अधिकतम स्पष्टता के लिए इसे फ़ाइन-ट्यून करें।
    3. पूरे अंग की X\Y सीमा और Z परिसर ज्ञात कीजिए। लेजर तीव्रता और एक्सपोज़र समय (अधिमानतः 10 एमएस से कम) समायोजित करें, और शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें।
    4. यदि ऊतक बहुत बड़ा है, तो छवि सिलाई के साथ दो या अधिक छवियों को मर्ज करें। माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर (यहां, ZEISS ZEN 3.7) का उपयोग करके कैप्चर की गई फ़ाइल खोलें। प्रसंस्करण > विधि का चयन करें > सिलाई > विधि पैरामीटर > पूर्ण छवि सिलाई के लिए लागू करें।

4. डाटा प्रोसेसिंग और मात्रा का ठहराव

नोट: ग्लोमेरुली को लेबल करने और विश्लेषण करने के लिए सरफेस फ़ंक्शन का उपयोग करके इमारिस (छवि विश्लेषण) सॉफ़्टवेयर के साथ छवि स्टैक को संसाधित करें।

  1. ग्लोमेरुली की गिनती
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में बड़ी छवियों (confocal माइक्रोस्कोपी) या सिले छवियों (प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी) आयात.
    2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फ़ाइलें खोलें। नया सरफेस बनाने के लिए सरफेस बटन पर क्लिक करें। स्क्रीन के निचले बाएँ भाग में गाइड का पालन करें।
      1. कुछ भी टिक किए बिना अगला बटन (दायां तीर बटन) पर क्लिक करें।
      2. चिकना विकल्प से पहले बॉक्स पर टिक करें और सतह के विवरण को नियंत्रित करने के लिए एक उचित संख्या (जैसे, 14.5) दर्ज करें। थ्रेसहोल्डिंग में पृष्ठभूमि घटाव का चयन करें और ग्लोमेरुली के अनुमानित औसत व्यास के साथ बॉक्स भरें। अगला बटन क्लिक करें।
      3. यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें, और अगला बटन क्लिक करें। उचित श्रेणी का चयन करें और सरफेस बनाने के लिए अगला बटन पर क्लिक करें।
    3. फ़िल्टर पर क्लिक करें, फिर गैर-गोलाकार वस्तुओं को फ़िल्टर करने के लिए गोलाकार जोड़ने के लिए जोड़ें बटन। इस नई सतह की प्रतिलिपि बनाने के लिए डुप्लिकेट बटन पर क्लिक करें।
    4. सांख्यिकी बटन पर क्लिक करें, फिर समग्र बटन पर क्लिक करें; सॉफ्टवेयर ग्लोमेरुली की संख्या को सतह की कुल संख्या के रूप में प्रस्तुत करेगा।
  2. ग्लोमेरुली की मात्रा
    1. ऊपर के रूप में ग्लोमेरुली की एक सतह बनाएं।
    2. जब सतह पूरा हो जाए, तो क्लिक करें चयन लक्ष्य वस्तुओं का चयन करने और प्रत्येक वस्तु का आयतन प्रस्तुत करने के लिए बटन। सहेजें बटन पर क्लिक करें, और आगे के विश्लेषण के लिए आँकड़ों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
  3. स्लाइस या पूरे गुर्दे की मात्रा
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में बड़ी छवियों (confocal माइक्रोस्कोपी) या सिले छवियों (प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी) आयात.
    2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फाइलें खोलें। नया सरफेस बनाने के लिए सरफेस बटन पर क्लिक करें। स्क्रीन के निचले बाएँ भाग में गाइड का पालन करें।
      1. टिक किए बिना अगला बटन (दायां तीर बटन) पर क्लिक करें।
      2. चिकना विकल्प से पहले बॉक्स पर टिक करें और सतह के विवरण को नियंत्रित करने के लिए एक उचित संख्या (जैसे, 50) दर्ज करें। थ्रेसहोल्डिंग में पूर्ण तीव्रता का चयन करें। अगला बटन क्लिक करें।
      3. सरफेस को तब तक एडजस्ट करें जब तक कि यह पूरे टिशू को कवर न कर ले, और नेक्स्ट बटन पर क्लिक करें। सतह बनाने के लिए अगला बटन क्लिक करें।
    3. पूरे ऊतक की सतह का चयन करने और ऊतक की मात्रा प्रस्तुत करने के लिए चयन बटन पर क्लिक करें। स्प्रेडशीट में आंकड़े निर्यात करने के लिए सहेजें बटन पर क्लिक करें.

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Representative Results

यह अध्ययन चूहों के गुर्दे में ग्लोमेरुली को लेबल करने और विश्लेषण करने के लिए एक सरल और कुशल तरीका प्रदान करता है।

ग्लोमेरुली (रक्त वाहिकाओं) को इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन FITC-Dextran द्वारा अच्छी तरह से लेबल किया जा सकता है। समाशोधन प्रक्रिया के बाद, गुर्दे पारदर्शी हो गए (चित्रा 1 ए), और ग्लोमेरुली को प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1बी)या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1सी)का उपयोग करके स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में सीमित स्कैनिंग गहराई होती है, इसलिए गुर्दे को लगभग 1 मिमी-मोटी स्लाइस में काटा जाना चाहिए। यदि एक लाइट-शीट माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, तो पूरे गुर्दे को सीधे स्कैन किया जा सकता है।

स्पष्ट संकेतों के साथ, ग्लोमेरुली की संख्या को गिनना आसान था। वास्तव में, लेबलिंग इतनी प्रभावी थी कि ग्लोमेरुली को नग्न आंखों से गिना जा सकता था। ग्लोमेरुली की मात्रा को सीधे मापा जा सकता है। बेशक, इमारिस जैसे सॉफ्टवेयर ने इस प्रक्रिया को बहुत तेज कर दिया। सतह समारोह का उपयोग करना, एक गुर्दा टुकड़ा (चित्रा 2) में सभी ग्लोमेरुली, एक पूरे गुर्दे (चित्रा 3) में, या एक पट्टी (चित्रा 4) में चुना जा सकता है, और ग्लोमेरुली की संख्या और मात्रा सीधे प्राप्त की जा सकती है (चित्रा 2 सी, चित्रा 3 सी, चित्रा 4 सी)। चयनित क्षेत्र की मात्रा भी मापा जा सकता है (चित्रा 2 बी, चित्रा 3 बी, चित्रा 4 बी), इसलिए ग्लोमेरुली वॉल्यूम अनुपात और एक निश्चित क्षेत्र में या पूरे गुर्दे में आवृत्ति की गणना की जा सकती है (चित्रा 2 डी, चित्रा 3 डी, चित्रा 4 डी)। विशिष्ट क्षेत्रों में गणना करने के लिए गुर्दे के एक क्षेत्र का चयन किया जा सकता है। हमने बायोप्सी के समान एक पट्टी प्रस्तुत की। पट्टी में ग्लोमेरुली की संख्या, मात्रा और आवृत्ति भी आसानी से प्राप्त की जा सकती है (चित्र 4)।

जैसा कि आंकड़ों में दिखाया गया है, इस अध्ययन में प्रस्तुत परिणाम हैं (एन = संख्या, एफ = आवृत्ति, वी = आयतन, वी (ए) = औसत आयतन, वी (टी) = कुल आयतन):

स्लाइस में एन ग्लोमेरुली = 1128,पूरे गुर्दे में एन ग्लोमेरुली = 14006,स्लाइस में एफ ग्लोमेरुलर = 65 प्रति मिमी3,पूरे गुर्दे में एफ ग्लोमेरुलर = 105 प्रति मिमी3,स्लाइस में वी कुल ग्लोमेरुली / वीस्लाइस = 2.24%,पूरे गुर्दे में वी कुल ग्लोमेरुली / वीगुर्दे = 5.54%, वी (ए) स्लाइस में ग्लोमेरुली = 373654 माइक्रोन3, वी (ए) पूरे गुर्दे में ग्लोमेरुली = 521627 माइक्रोन3, स्लाइस में वी (टी) ग्लोमेरुली = 421481724 माइक्रोन3, पूरे गुर्दे में वी (टी) ग्लोमेरुली = 7305386256 माइक्रोन3 (चित्रा 2 डी, चित्रा 3 डी)।

पट्टी में एन ग्लोमेरुली = 63,पट्टी में एफ ग्लोमेरुली = 72 प्रति मिमी3,वी कुल ग्लोमेरुली पट्टी/वीपट्टी में = 2.23%, वी (ए) पट्टी में ग्लोमेरुली = 307698 माइक्रोन3, वी (टी) पट्टी में ग्लोमेरुली = 19384977 माइक्रोन3 (चित्रा 4 डी)।

Figure 1
चित्रा 1: गुर्दे के ऊतकों की पारदर्शिता और FITC-डेक्सट्रान-लेबल ग्लोमेरुली। (ए) पारदर्शिता उपचार से पहले और बाद में गुर्दा। (बी) एलएसएफएम के साथ स्कैन किए गए पूरे गुर्दे की छवि। (सी) गुर्दे के एक टुकड़े की छवि confocal खुर्दबीन (बाएं: 4x, दाएं: 10x) के साथ स्कैन किया. स्केल बार = 300 माइक्रोन (4x, confocal); स्केल बार = 100 माइक्रोन (10x, confocal) ।; स्केल बार = 700 माइक्रोन (5x, ज़ूम 0.36, LSFM)। ग्लोमेरुली को FITC-Dextran के साथ लेबल किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फ़ंक्शन सतह confocal स्कैन गुर्दे टुकड़ा करने के लिए लागू किया. (ए) टुकड़ा और सभी ग्लोमेरुली की सतह बनाई जाती है। गुलाबी = ग्लोमेरुली, नीला = बाहर गुर्दे के टुकड़े की सतह, हरा = जहाजों का मूल लेबल (ग्लोमेरुली और कुछ बड़े जहाज)। स्केल बार = 300 माइक्रोन। (बी) जब स्लाइस की सतह (बाएं) या ग्लोमेरुली (दाएं) का चयन किया जाता है (चयनित वस्तुएं पीली हो जाएंगी), तो डेटा सीधे प्राप्त किया जा सकता है (बिंदीदार बॉक्स हाइलाइट्स जहां यह डेटा दिखाता है)। (सी) संख्या, हर एक ग्लोमेरुलस की मात्रा, और कुल ग्लोमेरुली की मात्रा सीधे और साथ ही स्लाइस की मात्रा प्राप्त की जा सकती है। (डी) निर्यात किए गए डेटा का और विश्लेषण किया जा सकता है ताकि गणना, जैसे ग्लोमेरुली की औसत मात्रा और ग्लोमेरुली और चयनित क्षेत्र के आयतन अनुपात पर काम किया जा सके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एलएसएफएम स्कैन पूरे गुर्दे के लिए लागू समारोह सतह। (ए) पूरे गुर्दे की सतह और सभी ग्लोमेरुली बनाए जाते हैं। गुलाबी = ग्लोमेरुली, नीला = बाहर पूरे गुर्दे की सतह, हरा = वाहिकाओं का मूल लेबल (ग्लोमेरुली और कुछ बड़े वाहिकाएं)। स्केल बार = 1000 माइक्रोन। (बी) जब गुर्दे की सतह (बाएं) या ग्लोमेरुली (दाएं) का चयन किया जाता है (चयनित वस्तुएं पीली हो जाएंगी), तो डेटा सीधे प्राप्त किया जा सकता है (बिंदीदार बॉक्स हाइलाइट्स जहां यह डेटा दिखाता है)। (सी) संख्या, हर एक ग्लोमेरुलस की मात्रा, और ग्लोमेरुली की संख्या सीधे प्राप्त की जा सकती है, साथ ही गुर्दे की मात्रा भी। (डी) निर्यात किए गए डेटा का और विश्लेषण किया जा सकता है ताकि गणना, जैसे ग्लोमेरुली की औसत मात्रा और ग्लोमेरुली और पूरे गुर्दे के मात्रा अनुपात पर काम किया जा सके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फ़ंक्शन सतह चयनित गुर्दे की पट्टी पर लागू होती है। (ए) पट्टी की सतह और सभी ग्लोमेरुली बनाए जाते हैं। गुलाबी = ग्लोमेरुली, नीला = बाहर गुर्दे की पट्टी की सतह, हरा = वाहिकाओं का मूल लेबल (ग्लोमेरुली और कुछ बड़े जहाज)। स्केल बार = 150 माइक्रोन। (बी) जब पट्टी की सतह (बाएं) या ग्लोमेरुली (दाएं) का चयन किया जाता है (चयनित वस्तुएं पीली हो जाएंगी), तो डेटा सीधे प्राप्त किया जा सकता है (बिंदीदार बॉक्स हाइलाइट्स जहां यह डेटा प्रदर्शित करता है)। (सी) संख्या, हर एक ग्लोमेरुलस की मात्रा, और कुल ग्लोमेरुली की मात्रा सीधे प्राप्त की जा सकती है, साथ ही पट्टी की मात्रा भी। (डी) निर्यात किए गए डेटा का और विश्लेषण किया जा सकता है ताकि गणना, जैसे ग्लोमेरुली की औसत मात्रा और ग्लोमेरुली और चयनित क्षेत्र के आयतन अनुपात पर काम किया जा सके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऊतक-समाशोधन प्रौद्योगिकियों को 3 या 4 समूहों 29,30,31 में वर्गीकृत किया जा सकता है। कार्बनिक विलायक आधारित ऊतक समाशोधन (जैसे, डिस्को और पेगासोस), जलीय आधारित ऊतक समाशोधन (जैसे, क्यूबिक), और हाइड्रोजेल एम्बेडिंग ऊतक समाशोधन (जैसे, स्पष्टता) सभी को गुर्दे समाशोधन 25,26,28,32 में लागू किया गया है। CUBIC, जैसा कि हमने प्रदर्शित किया है, सबसे अच्छा काम करता है जब ग्लोमेरुली (जहाजों) को FITC-Dextran के साथ लेबल किया जाता है। इसके अलावा, क्यूबिक एक अपेक्षाकृत अधिक सुविधाजनक आपरेशन प्रक्रिया है और संसाधित नमूनों कार्बनिक अभिकर्मकों33 में भिगोने की जरूरत नहीं है के रूप में, साधारण सूक्ष्म लेंस27 से अधिक की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, विभिन्न समाशोधन विधियों और पोत लेबल विधियों के अपने फायदे और नुकसान हैं; शोधकर्ताओं को अपनी विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों के साथ प्रयोग करने की आवश्यकता हो सकती है।

पिछले अध्ययनों में देखा गया कि ग्लोमेरुली को साफ गुर्दे में लेबल किया जा सकता है जब गुर्दे में रक्त वाहिकाओं को 13,25,26,28 लेबल किया गया था। इस घटना के लिए एक संपूर्ण स्पष्टीकरण अभी भी आगे की जांच करने की आवश्यकता है, लेकिन यह अनुमान लगाया जा सकता है कि संवहनी प्रणाली के लिए एक अच्छी लेबलिंग विधि भी ग्लोमेरुली को प्रभावी ढंग से लेबल करती है। प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर, हम एक मध्यम आणविक भार (जैसे 150 केडीए) के साथ FITC-डेक्सट्रान के इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन की सिफारिश करेंगे। हालांकि, चूंकि लेबलिंग रक्त परिसंचरण पर निर्भर करती है, इसलिए यह विधि ग्लोमेरुली को लेबल करने में विफल हो सकती है जब उनके पास परिसंचरण की कमी होती है।

एलएसएफएम बड़े पैमाने पर ऊतक अवलोकन की अनुमति देता है, जिससे यह पूरे गुर्दे के ग्लोमेरुली का पता लगाने के लिए अधिक उपयुक्त हो जाता है। हालांकि, लाइट-शीट माइक्रोस्कोप हर प्रयोगशाला में उपलब्ध नहीं हो सकते हैं। इसलिए, हम साधारण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रोटोकॉल का एक वैकल्पिक सेट प्रदान कर रहे हैं। यद्यपि गुर्दे को कई वर्गों में कटा हुआ होना चाहिए, पूरे गुर्दे में ग्लोमेरुली की गिनती और मात्रा जैसे डेटा प्राप्त करना संभव है। इसके अलावा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी डेटा की एक छोटी मात्रा प्रदान करता है, जो अधिक डेटा प्रोसेसिंग अनुकूल है।

Imaris प्रत्यक्ष डेटा आउटपुट प्रदान करता है। हालांकि, एनालॉग सिग्नल को मूल रूप से बारीकी से मिलान करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, सॉफ़्टवेयर को बड़ी फ़ाइलों को संसाधित करने में लंबा समय लग सकता है, जो निराशाजनक हो सकता है। जब तक ग्लोमेरुली को स्पष्ट रूप से लेबल और कल्पना की जा सकती है, तब तक डेटा विश्लेषण के लिए एक से अधिक अद्वितीय समाधान हैं। विभिन्न प्रयोगशालाओं के शोधकर्ता अपने स्वयं के परिचित सॉफ्टवेयर और प्रोग्रामिंग भाषाओं के साथ काम कर सकते हैं।

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Disclosures

सभी लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (82204951) और सिचुआन साइंस एंड टेक्नोलॉजी प्रोग्राम (2020JDRC0102) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% PFA Biosharp 7007171800 Fixation reaagen
502 Glue  Deli 7146 For fixing the kidney to the sample fixing adapter 
Antipyrine Aladdin A110660 Clearing reagent
Brain Matrix RWD Life Science 1mm 40-75 Tissue slicing
Confocal microscopy Nikon A1plus Image acquisition
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD150S Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy  Zeiss Light sheet 7  Image acquisition
Mice Ensiweier Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) 
N-Butyldiethanolamine Aladdin B299095 Clearing reagent
Nicotinamide Aladdin N105042 Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz Sigma-Aldrich P3761
Tail vein fixator JINUOTAI JNT-FS35 Fix the mouse for vail injection
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Clearing reagent

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Bai, L., Wu, Y., Dai, W., Shi, Q., Wu, L., Zhang, J., Zheng, L. An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli. J. Vis. Exp. (204), e65973, doi:10.3791/65973 (2024).

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