Summary
La détection et la quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B (VHB) par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel constituent une méthode sensible et précise de diagnostic et de surveillance de l’infection par le VHB. Nous présentons ici un protocole de détection de l’ADN du VHB et de mesure de la charge virale d’un échantillon.
Abstract
Le virus de l’hépatite B (VHB) est une cause importante de maladie du foie dans le monde. Elle peut entraîner des infections aiguës ou chroniques, ce qui rend les individus très vulnérables à la cirrhose mortelle et au cancer du foie. La détection et la quantification précises de l’ADN du VHB dans le sang sont essentielles pour diagnostiquer et surveiller l’infection par le VHB. La méthode la plus courante pour détecter l’ADN du VHB est la PCR en temps réel, qui peut être utilisée pour détecter le virus et évaluer la charge virale afin de surveiller la réponse au traitement antiviral. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB dans le sérum ou le plasma humain à l’aide d’un kit PCR en temps réel marqué IVD. Le kit utilise des amorces et des sondes qui ciblent la région centrale hautement conservée du génome du VHB et peuvent quantifier avec précision tous les génotypes du VHB (A, B, C, D, E, F, G, H, I et J). Le kit comprend également un contrôle interne endogène pour surveiller une éventuelle inhibition de la PCR. Ce test dure 40 cycles et sa limite est de 38 Ct. Pour la quantification de l’ADN du VHB dans les échantillons cliniques, un ensemble de 5 étalons de quantification est fourni avec le kit. Les étalons contiennent des concentrations connues d’ADN spécifique du VHB qui sont calibrées par rapport à la 4e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour le test d’acide nucléique (code NIBSC 10/266). Les étalons sont utilisés pour valider la fonctionnalité de l’amplification de l’ADN spécifique au VHB et pour générer une courbe standard, permettant la quantification de l’ADN du VHB dans un échantillon. L’ADN du VHB aussi faible que 2,5 UI/mL a été détecté à l’aide du kit PCR. La haute sensibilité et la reproductibilité du kit en font un outil puissant dans les laboratoires cliniques, aidant les professionnels de la santé à diagnostiquer et à gérer efficacement les infections à VHB.
Introduction
Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus à ADN partiellement double brin du genre Orthohepadnavirus et de la famille des Hepadnaviridae 1. Il peut déclencher une infection chronique qui persiste tout au long de la vie, pouvant entraîner une cirrhose du foie et un carcinome hépatocellulaire 2,3,4. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), une population estimée à 296 millions de personnes vivait avec une infection chronique par le virus de l’hépatite B en 2019, et 1,5 million de personnes étaient nouvellement infectées chaque année5.
L’identification et la mesure de l’ADN du VHB dans des échantillons de sérum ou de plasma constituent une méthode précieuse pour détecter les personnes atteintes d’une infection continue par le virus de l’hépatite B, évaluer l’efficacité du traitement antiviral et prédire la probabilité de succès du traitement 6,7,8,9,10,11. Une charge virale élevée est associée à un risque accru de progression de la maladie du foie, y compris la cirrhose et le cancer du foie12,13. Par conséquent, une mesure précise de la charge virale est cruciale pour suivre la progression de l’infection par le VHB et éclairer les décisions concernant le traitement.
Les tests PCR quantitatifs en temps réel ont une sensibilité plus élevée, une plage dynamique plus large et une quantification plus précise de l’ADN du VHB que les techniques de PCR conventionnelles 14,15,16,17. Plusieurs kits commerciaux de diagnostic moléculaire basés sur la PCR en temps réel pour la quantification de l’ADN du VHB dans des échantillons de sérum ou de plasma sont disponibles sur le marché. Nous décrivons ici un flux de travail détaillé pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB dans le sérum ou le plasma humain à l’aide d’un kit de PCR en temps réel marqué IVD disponible dans le commerce. Il s’agit d’un test18,19 largement utilisé, peu coûteux mais très sensible, et ses caractéristiques de performance sont comparables à celles d’autres kits portant le marquage CE18 disponibles dans le commerce. Outre l’amplification de la région cible du VHB, un gène de contrôle interne endogène est également inclus dans le kit pour vérifier la qualité des échantillons, la qualité de l’ADN extrait, l’amplification par PCR et l’inhibition éventuelle de la PCR.
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Protocol
Cette étude n’a pas impliqué de participants humains ou d’échantillons cliniques. Le seul matériel biologique utilisé était la 4e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour le test d’acide nucléique (code NIBSC 10/266). Cette norme est un document de référence accessible au public qui ne contient pas d’informations personnelles ou de données identifiables. Par conséquent, aucune approbation éthique n’était requise pour cette étude.
1. Extraction de l’ADN
- Extraire l’ADN viral d’un échantillon de sérum ou de plasma humain. Conservez l’ADN extrait à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé en PCR.
REMARQUE : Le volume recommandé de sérum ou de plasma pour l’extraction de l’ADN est de 500 μL et le volume d’élution est de 50 μL. Dans cette étude, l’ADN viral a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction d’acide nucléique viral (Table of Materials).
2. PCR en temps réel
- Décongelez tous les réactifs (tableau 1) du kit de PCR en temps réel à température ambiante (RT ; 15-25 °C) avant de commencer la PCR. Une fois décongelés, mélanger les composants par vortex pulsé pendant 10 s à une vitesse modérée et centrifuger à 8 000 × g pendant 15 s à RT. Conserver tous les composants décongelés sur un bloc de refroidissement.
- Préparation de la réaction
- Préparez un mélange PCR conformément au tableau 2. Calculez le volume de réactifs à ajouter en fonction du nombre d’échantillons, des étalons et de l’absence de contrôle de modèle.
REMARQUE : Lors de la préparation du mélange PCR, il faut ajouter au moins 10 % de volume supplémentaire de chaque réactif (p. ex., si 10 réactions sont nécessaires, calculer pour 11 réactions). - Injecter 15 μL du mélange PCR préparé ci-dessus dans chaque tube PCR. Ensuite, ajoutez 15 μL de l’ADN de l’échantillon extrait. Ajouter 15 μL d’au moins un des étalons pour le VHB (norme HBV 1-5) comme témoin positif (PC) pour détecter l’ADN du VHB et 15 μL d’eau exempte de nucléase de qualité PCR comme témoin négatif (NC). Pour générer une courbe standard requise pour la quantification de l’ADN du VHB, utilisez les 5 étalons de quantification fournis avec le kit (norme HBV 1-5) pour chaque cycle de PCR.
- Fermer les tubes, mélanger les composants par vortex pulsé pendant 10 s à vitesse modérée et centrifuger à 8 000 × g pendant 15 s à RT avant de passer au thermocycleur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le mélange réactionnel, car cela pourrait interférer avec la détection de fluorescence.
- Préparez un mélange PCR conformément au tableau 2. Calculez le volume de réactifs à ajouter en fonction du nombre d’échantillons, des étalons et de l’absence de contrôle de modèle.
- Configuration du programme
- Programmez le thermocycleur en utilisant les conditions de cyclage recommandées dans le tableau 3.
- Sélection de canaux/fluorophores
- Sélectionnez les colorants fluorescents pour les plateformes de PCR en temps réel couramment utilisées, comme indiqué dans le tableau 4.
- Analyse des données
- Une fois l’exécution terminée, analysez le tracé d’amplification à l’échelle linéaire.
- Réglage du seuil
- Définissez le seuil dans la phase exponentielle d’une réaction PCR. Les valeurs seuils recommandées pour le kit sont mentionnées dans le tableau 5. Soyez cohérent avec le paramètre de seuil. Une fois que le seuil optimal pour le test est déterminé, utilisez-le de manière cohérente pour tous les échantillons d’une machine PCR particulière. Cela permettra de s’assurer que les résultats sont précis et reproductibles.
REMARQUE : Si le seuil est réglé trop bas, le signal peut être inférieur au niveau de bruit et la valeur Ct ne sera pas fiable. Si le seuil est trop élevé, le signal peut se trouver dans la phase de plateau de la réaction, où l’amplification n’est pas aussi efficace, et la valeur Ct peut être imprécise.
- Définissez le seuil dans la phase exponentielle d’une réaction PCR. Les valeurs seuils recommandées pour le kit sont mentionnées dans le tableau 5. Soyez cohérent avec le paramètre de seuil. Une fois que le seuil optimal pour le test est déterminé, utilisez-le de manière cohérente pour tous les échantillons d’une machine PCR particulière. Cela permettra de s’assurer que les résultats sont précis et reproductibles.
- Raccourci
- Faites fonctionner le kit pendant 40 cycles d’amplification. Ne considérez aucune amplification au-delà de 38 cycles pour toute interprétation.
- Analyse qualitative des résultats
- Utilisez le kit pour la détection qualitative de l’ADN du VHB. Utiliser la norme 2 comme PC avec des valeurs de Ct attendues à 20 ± 2 pour le VHB et 24 ± 3 pour l’IC.
- Assurez-vous qu’aucun contrôle de modèle (NTC) ne présente d’amplification pour les cibles HBV et de contrôle interne (IC). Si une réaction d’amplification se produit dans la réaction NTC, il est possible que l’échantillon ait été contaminé.
- Étant donné que le seuil de dosage est de 38, considérez toute amplification avant 38 Ct pour la cible du VHB comme un échantillon positif pour le VHB. Lorsque tous les témoins satisfont aux exigences énoncées ci-dessus, envisager un spécimen suivant les interprétations mentionnées dans le tableau 6.
- Analyse quantitative des résultats
- Utiliser l’ensemble de 5 étalons de quantification des concentrations connues pour l’ADN spécifique du VHB qui sont calibrés par rapport à la 4e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB pour les techniques d’amplification des acides nucléiques (NAT)20 (tableau 7).
- Utilisez ces normes pour générer une courbe standard. Utilisez la courbe standard pour quantifier l’ADN du VHB d’un échantillon inconnu.
REMARQUE : Le logiciel de PCR en temps réel générera une courbe standard à l’aide des valeurs Ct obtenues pour les cibles HBV des 5 étalons et de leurs concentrations correspondantes en unités internationales par microlitre (UI/μL). - N’interprétez les valeurs des échantillons inconnus que si la pente des étalons se situe entre -3,1 et -3,6, la valeur R2 est comprise entre 0,99 et 1,0, l’efficacité de la PCR est comprise entre 90 % et 110 % (0,9-1,1) et s’il n’y a pas d’amplification dans le témoin négatif.
- Le logiciel calculera la concentration de chaque échantillon positif pour le VHB en unités internationales par microlitre (UI/μL). Pour calculer la charge virale (conversion de l’UI/μL en unités internationales par millilitre [UI/mL]), utilisez l’équation suivante :
Résultat (UI/mL) = (Résultat [UI/μL] x Volume d’élution [μL])/ Volume d’échantillon (mL)
NOTE : La 4e norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB, code 10/266 du NIBSC, a été extraite pour la purification de l’ADN viral à partir de 0,5 mL de plasma, éluée l’ADN viral purifié dans 50 μL de tampon d’élution et utilisée avec le kit PCR comme échantillon de référence avec les 5 étalons du VHB et le NTC. La charge virale VHB de l’échantillon de référence (code NIBSC 10/266) a été calculée comme suit : (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65 900 UI/mL.
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Representative Results
La figure 1 présente un diagramme schématique du processus de détection et de quantification de l’ADN du VHB à partir du plasma/sérum humain. La figure 2 présente un diagramme d’amplification de la norme 2 (utilisée comme PC) et de la NTC pour le VHB et l’IC. La figure 3 montre les courbes d’amplification d’un échantillon positif pour le VHB, d’un échantillon négatif pour le VHB et d’un échantillon avec inhibition de la PCR. La courbe d’amplification, la valeur Ct pour le VHB et la concentration obtenue en unités internationales par microlitre (UI/μL) pour le code NIBSC 10/266 sont présentées à la figure 4. La figure 5 présente des courbes d’amplification pour la cible HBV des 5 étalons HBV du kit ainsi qu’une courbe standard représentative pour celle-ci. La pente de la courbe standard est de -3,361, R2 est de 0,99996 et l’efficacité est de 0,98. Les courbes d’amplification pour la cible IC des 5 étalons HBV sont présentées à la figure 6.
Figure 1 : Schéma de principe du processus de détection et de quantification de l’ADN du VHB à partir d’échantillons de plasma/sérum humain. Extraire l’ADN viral d’un échantillon de sérum ou de plasma humain d’une personne suspectée d’être atteinte du VHB. Préparez le mélange de PCR en ajoutant chaque composant de la PCR, à l’exception de l’ADN du modèle et de la ou des normes. Distribuez-le dans des tubes/puits PCR. Ajoutez l’ADN viral/standard(s) extrait(s) en tant qu’ADN modèle et fermez les tubes PCR. Chargez-le dans une machine de PCR en temps réel, démarrez l’exécution de la PCR et analysez le résultat une fois l’exécution terminée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Graphique d’amplification de la norme 2 (utilisée comme PC) et de la NTC. Un diagramme d’amplification de la norme 2 du VHB est présenté ici pour les cibles du VHB et de la CI. Pour l’analyse qualitative des résultats, la norme 2 peut être utilisée comme contrôle positif. Pour NTC, aucune amplification n’a été observée pour l’une ou l’autre des cibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Diagrammes d’amplification pour un échantillon positif au VHB, un échantillon négatif au VHB et un échantillon avec inhibition par PCR. Des diagrammes d’amplification pour trois échantillons différents : VHB positif (cas 1), VHB négatif (cas 2) et un échantillon contenant des inhibiteurs de la PCR (cas 3) sont présentés ici. Dans le cas de l’échantillon positif au VHB, les deux cibles sont amplifiées, alors que seule la CI a été amplifiée pour l’échantillon négatif au VHB, et aucune amplification pour la cible du VHB n’a été observée comme prévu. Ni le VHB ni l’IC n’ont été amplifiés pour le cas 3, ce qui signifie que l’inhibition de la PCR s’est produite en raison des inhibiteurs de la PCR présents dans l’échantillon d’ADN utilisé comme matrice de PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Courbe d’amplification, valeur Ct pour le VHB et concentration obtenue en VHB (UI/μL) pour le code NIBSC 10/266. L’ADN viral extrait du code NIBSC 10/266 a été exécuté avec les 5 normes HBV et NTC. La courbe d’amplification de la cible HBV est indiquée pour l’échantillon NIBSC code 10/266 dans le panneau supérieur. Sa valeur Ct pour le VHB est de 18,94 et la concentration calculée est de 6659 UI/μL, comme indiqué dans le panneau inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Courbes d’amplification pour la cible HBV des 5 étalons HBV et de la courbe standard. Les courbes d’amplification pour la cible HBV (canal vert) des 5 étalons HBV sont indiquées dans le panneau supérieur. Une courbe standard avec sa pente (3,361), sa valeur R2 (0,99996) et son efficacité PCR (0,98) sont affichées dans le panneau inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Courbes d’amplification pour la cible IC des 5 étalons HBV. Les courbes d’amplification de 5 étalons HBV pour le CI (canal jaune) sont présentées ici. Comme on pouvait s’y attendre, ils se ressemblent avec des valeurs Ct similaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Les courbes d’amplification pour la cible HBV des 5 étalons HBV et NTC ont été exécutées en trois exemplaires. Les diagrammes d’amplification de trois répétitions pour la cible HBV (canal vert) des 5 étalons HBV montrent des résultats similaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Courbes d’amplification pour la cible HBV de code NIBSC 10/266, code NIBSC 14/198 et ses cinq dilutions. Les courbes d’amplification de la cible HBV (canal vert) des échantillons de référence NIBSC code 10/266, NIBSC code 14/198 et ses cinq dilutions (1,25 UI/mL, 2,5 UI/mL, 5 UI/mL, 25 UI/mL et 50 UI/mL) sont indiquées ici. Aucune amplification n’a été détectée pour 1,25 UI/mL, tandis que d’autres dilutions ont montré des courbes d’amplification appropriées avant 38 Ct. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Description |
| Mixage principal multiplex | Tampon PCR, ADN polymérase Taq Hot Start et autres composants PCR |
| Mélange de sondes d’amorce HBV | Amorces et mélange de sondes pour la détection du VHB |
| Mélange de sondes d’amorce IC endogène | Amorces et mélange de sondes pour la détection du contrôle interne endogène (CI) |
| Normes pour le VHB | · Norme HBV 1 |
| · Norme HBV 2 | |
| · Norme HBV 3 | |
| · Norme HBV 4 | |
| · Norme HBV 5 | |
| Contrôle négatif | Eau exempte de nucléases de qualité PCR |
Tableau 1 : Réactifs fournis avec le kit de PCR en temps réel et leur description
| Réactif | Volume par réaction |
| Mixage principal multiplex | 11 μL |
| Mélange de sondes d’amorce HBV | 2 μL |
| Mélange de sondes d’amorce IC endogène | 2 μL |
| Volume total de la réaction | 15 μL |
Tableau 2 : Volume de chaque réactif à ajouter par réaction pour la préparation du mélange PCR
| Pas | Température (°C) | Heure | Collecte de données | Cycles |
| Dénaturation initiale | 94 | 10 min (en anglais) | - | 1 |
| Cycle PCR | 94 | 15 secondes | - | 40 |
| 55 | 60 s | Sur | ||
| 72 | 15 secondes | - |
Tableau 3 : Conditions de cycle de la PCR
| Cible | Rotor-Gène Q* | CFX 96 | PCR en temps réel ABI # |
| VHB | Vert | FAM | FAM |
| IC | Jaune | SORTILÈGE | VIC |
| *Configuration de l’optimisation automatique du gain - sélectionnez « Effectuer l’optimisation avant la 1ère acquisition » | |||
| #Uniquement pour les machines de PCR en temps réel d’Applied Biosystems, sélectionnez ROX comme colorant de référence passif lors de la configuration de la plaque, car le mélange principal du kit contient ROX | |||
Tableau 4 : Sélection des colorants pour différentes plates-formes de PCR en temps réel
| Instrument de PCR en temps réel | Colorants | Plage de valeurs seuil§ |
| PCR en temps réel de l’ABI¶ | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| SORTILÈGE | 50–400 | |
| Rotor-Gène Q | Vert | 0.015–0.03 |
| Jaune | 0.01–0.02 | |
| §Une valeur seuil absolue varie d’un instrument à l’autre en fonction de l’âge, du modèle et de l’état d’étalonnage de l’instrument | ||
| ¶Ces valeurs seuils s’appliquent lorsque ROX est sélectionné comme colorant de référence passif | ||
| †La fluorescence relative est augmentée d’environ 2 à 5 fois lorsque les tubes PCR blancs de Bio-Rad sont utilisés à la place des tubes transparents. Ainsi, la valeur seuil doit être déterminée en conséquence | ||
Tableau 5 : Valeurs seuils recommandées pour différentes plateformes de PCR en temps réel
| Type d’échantillon | Cas | Signal d’amplification en entrée | Interprétation des résultats | |||
| FAM/Vert | HEX/VIC/Jaune | |||||
| Contrôle | Standard 2/PC | Oui (20 ± 2) | Oui (24 ± 3) | Standard 2/PC fonctionne correctement | ||
| NTC (en anglais seulement) | Non | Non | NTC fonctionne correctement | |||
| Échantillon | 1 | Oui | Oui / Non* | Détection d’ADN spécifique du VHB | ||
| 2 | Non | Oui | L’ADN spécifique du VHB n’a pas été détecté. L’échantillon ne contient pas de quantité détectable d’ADN spécifique du VHB | |||
| 3 | Non | Non | Inhibition possible de la PCR, diluer l’échantillon d’ADN (1 :10) / réextraire l’ADN de l’échantillon d’origine et répéter la PCR | |||
| *La détection du contrôle interne n’est pas nécessaire lorsque la cible HBV est détectée. Une charge élevée d’ADN du VHB dans l’échantillon peut entraîner une réduction ou une absence du signal de contrôle interne | ||||||
Tableau 6 : Interprétation des résultats des inhibiteurs positifs, négatifs et PCR contenant des échantillons de mauvaise qualité
| Standard | Concentration (UI/μl) | Ct désiré | |
| VHB | IC | ||
| (FAM/ Vert) | (HEX/VIC/Jaune) | ||
| Norme HBV 1 | 5 X 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| Norme HBV 2 | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| Norme HBV 3 | 5 X 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| Norme HBV 4 | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| Norme HBV 5 | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tableau 7 : Étalons du VHB et concentration de la cible du VHB et des valeurs de Ct souhaitées
| Échantillon | Ct attendu | Ct obtenu pour le VHB | Ct moyen | Écart type | CV % | ||
| Répliquer 1 | Répliquer 2 | Répliquer 3 | |||||
| Norme HBV 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| Norme HBV 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| Norme HBV 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| Norme HBV 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| Norme HBV 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tableau 8 : Valeurs de Ct obtenues, moyenne, écart-type et coefficient de variation (CV%) de 5 étalons du VHB.
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Discussion
Le code NIBSC 10/266 s’est vu attribuer une unité de 9,55,000 UI/mL lorsqu’il est reconstitué dans 0,5 mL d’eau exempte de nucléases conformément aux informations fournies par le fournisseur21. Cela peut être considéré comme un échantillon positif pour le VHB à forte charge. La charge virale du VHB déterminée par la trousse de charge virale utilisée dans cette étude était de 6 65 900 UI/mL (figure 4). Comme l’efficacité d’extraction de l’ADN de tout kit d’extraction d’ADN n’est pas de 100%, une partie de l’ADN est souvent perdue pendant le processus de purification. Bien que la charge virale déterminée par la trousse soit légèrement inférieure à la valeur attribuée par le fournisseur du réactif (code NIBSC 10/266), les données sont tout de même satisfaisantes car la différence log10 entre les deux valeurs n’est que de 0,157, ce qui est inférieur à la valeur limite (0,5)22.
La trousse de charge virale utilisée dans ce protocole est très robuste et fournit des données reproductibles, comme le montre la figure 7. Dans cette expérience, les 5 étalons et le NTC ont été exécutés en trois exemplaires, et leurs valeurs de Ct, la moyenne, l’écart-type et le coefficient de variation (CV%) sont indiqués dans le tableau 8. Un pourcentage CV inférieur à 1 %, tel que mentionné dans le tableau 8, indique que l’expérience est plus fiable et produit des résultats très précis.
Un échantillon de référence à très faible charge (code NIBSC : 14/198)23 a été utilisé avec le kit pour vérifier son niveau de contrôle. Le code NIBSC 14/198 contient moins de 50 UI/mL d’ADN du VHB selon les informations fournies par le fournisseur. L’ADN a été extrait du code NIBSC 14/198 et de multiples dilutions (1,25 UI/mL, 2,5 UI/mL, 5 UI/mL et 25 UI/mL) de l’ADN ont été préparées. Le kit a utilisé toutes les dilutions et 5 étalons du VHB comme ADN modèle. Il a été observé que cette trousse peut détecter toutes les dilutions jusqu’à 2,5 UI/mL d’ADN du VHB (figure 8) et qu’elle correspond exactement à la durée de vie de la trousse de charge virale. Par conséquent, le kit de charge virale est un outil très sensible et reproductible que les laboratoires de diagnostic moléculaire peuvent utiliser pour aider les professionnels de la santé à diagnostiquer et à gérer efficacement les infections par le VHB.
Les utilisateurs doivent garder à l’esprit les étapes critiques suivantes lorsqu’ils effectuent la procédure. Les utilisateurs doivent utiliser uniquement de l’ADN extrait de haute qualité comme modèle de PCR pour garantir des résultats précis. Il est important d’éviter les multiples cycles de gel-dégel (pas plus de 3 fois) des réactifs. Le mélange PCR ne doit pas être exposé à la lumière pendant une longue période car il contient la sonde fluorescente sensible à la lumière et le colorant de référence passif ROX. Il est essentiel de toujours inclure aucun contrôle de modèle ni aucune norme dans chaque exécution afin de garantir l’exactitude et la fiabilité des résultats. Des pipettes calibrées avec des pointes filtrées stériles doivent toujours être utilisées. L’ADN et les étalons doivent être ajoutés dans une zone distincte avec une pipette différente de celle de la zone de préparation de la réaction pour éviter la contamination croisée.
Voici quelques conseils de dépannage courants pour la détection et la quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B à l’aide de la PCR. Le signal d’amplification dans le contrôle négatif peut se produire en raison d’une contamination croisée lors de la configuration de la réaction. Ainsi, l’utilisateur doit vérifier la contamination des composants du kit. Aucun signal d’amplification avec des étalons ne peut se produire pour les raisons suivantes : (i) Mélange PCR incorrect utilisé. L’utilisateur doit vérifier si tous les composants sont ajoutés correctement ou non. (ii) Utilisation de réactifs périmés. L’utilisateur doit vérifier la date d’expiration avant de configurer la réaction. (iii) Stockage inadéquat des réactifs. Assurez-vous que les réactifs sont stockés à -20 °C ou moins et qu’ils ne sont pas conservés à température ambiante pendant une longue période pendant la configuration de la réaction. (iv) Des conditions de cycle PCR incorrectes ont été utilisées. Dans ce cas, il est recommandé de répéter la PCR avec le bon programme. (iv) Un signal faible ou nul du contrôle interne des échantillons peut se produire en raison d’une charge élevée de VHB dans l’échantillon et de l’inhibition de la PCR. L’utilisateur peut diluer l’échantillon d’ADN (1 :10) et répéter le test pour une charge élevée de VHB dans l’échantillon. Dans le cas de l’inhibition de la PCR, l’ADN de l’échantillon doit être réextrait avec des réactifs de bonne qualité et le test doit être répété.
La détection et la quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B par PCR sont des techniques très sensibles et spécifiques, mais elles présentent certaines limites telles que le coût et la complexité. Les instruments et les réactifs de PCR en temps réel peuvent être coûteux, et le coût des tests peut constituer un obstacle pour certains patients et systèmes de santé. La PCR en temps réel est une technique complexe qui nécessite un personnel formé pour effectuer le test et interpréter les résultats. Il s’agit d’une mesure indirecte de la charge virale, de sorte que la qualité des étalons et de l’ADN matrice peut influencer le résultat. Un nouveau génotype du VHB et/ou une ou plusieurs mutations dans la région amorce-sonde peuvent conduire à des résultats faussement négatifs.
La détection et la quantification en temps réel de l’ADN du VHB par PCR sont une méthode très sensible et spécifique qui permet de détecter de faibles niveaux d’ADN viral. Par rapport à d’autres méthodes comme les tests sérologiques (ELISA et test à flux latéral), la PCR en temps réel présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il est plus sensible que les tests sérologiques. Deuxièmement, il peut quantifier la quantité d’ADN du VHB présente dans un échantillon, alors que les tests sérologiques ne peuvent fournir qu’un résultat qualitatif. Enfin, la PCR en temps réel est moins sujette aux faux positifs que les tests sérologiques24. Dans l’ensemble, la PCR en temps réel est la méthode la plus sensible, la plus spécifique et la plus quantitative disponible pour la détection et la quantification de l’ADN du VHB. Il s’agit également d’une technique relativement rapide, ce qui la rend idéale pour un usage clinique.
La détection et la quantification en temps réel de l’ADN du virus de l’hépatite B par PCR sont un outil puissant qui aura plusieurs applications futures, notamment le développement de nouvelles thérapies antivirales et les tests au point de service. La technique peut être utilisée pour cribler de nouveaux médicaments antiviraux et pour surveiller l’efficacité de ces médicaments dans le cadre d’essais cliniques. Cela pourrait conduire à la mise au point de traitements plus efficaces et moins toxiques pour l’infection par le VHB. Les instruments de PCR en temps réel sont de plus en plus petits et portables, ce qui permet d’effectuer un test de la charge virale contre le VHB au point de service. Cela pourrait améliorer l’accès au dépistage et conduire à un diagnostic et à un traitement plus précoces de l’infection par le VHB. Les composants de ce kit basé sur la PCR en temps réel peuvent être adaptés avec la PCR numérique pour une quantification absolue afin d’un suivi plus précis de la charge du flacon.
En plus de ces applications spécifiques, la détection et la quantification en temps réel de l’ADN du VHB par PCR sont susceptibles de jouer un rôle important dans la recherche et le développement de nouveaux outils et stratégies de prévention, de diagnostic et de traitement de l’infection par le VHB.
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Disclosures
Les auteurs sont associés à Kilpest India Limited, le fabricant du kit de charge virale contre le VHB utilisé dans cette étude.
Acknowledgments
Nous remercions Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita et Shikha pour leur assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
