Summary
हमें दिखाना है कि epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर्स (EGFR) से अधिक अभिव्यक्ति तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) एक उपन्यास agarose जेल आधारित microfluidic डिवाइस का उपयोग की गतिशीलता को बढ़ाता है. यह तकनीक आसानी से अन्य स्तनधारी सेल प्रणाली, मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में जहां सेल सूत्रों दुर्लभ हैं अनुकूलनीय होना कर सकते हैं, और इस समय चारों ओर मोड़ महत्वपूर्ण है.
Abstract
जबकि microfluidic प्रौद्योगिकी परिपक्वता की macromolecular assays के लिए एक नए स्तर तक पहुँचने है, सेल आधारित assays अभी भी एक शिशु एक चरण में हैं . यह मोटे तौर पर कठिनाई के साथ जो एक सेल संगत और स्थिर पारंपरिक तकनीक microfabrication और सामग्री का उपयोग microenvironment बना सकते हैं के कारण है. हम एक उपन्यास microfabrication सामग्री, agarose जेल की शुरूआत के माध्यम से microfluidic डिवाइस के लिए आधार सामग्री के रूप में इस समस्या का पता. Agarose जेल अत्यधिक निंदनीय है, और गैस और सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के लिए पारगम्य है, और इस प्रकार सेल आधारित assays के लिए एक आदर्श सामग्री है. हम पहले से पता चला है कि agarose जेल आधारित उपकरणों बैक्टीरियल और न्युट्रोफिल सेल प्रवास 2 अध्ययन में सफल रहा है. इस रिपोर्ट में तीन समानांतर microfluidic चैनलों के बारे में 1mm मोटाई के एक agarose जेल झिल्ली में नमूनों हैं. मीडिया / बफर के साथ लगातार बहती दो पक्ष चैनलों में एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर रहे हैं बनाए रखा. कक्ष अवलोकन के लिए केन्द्र चैनल में रखा जाता है. पक्ष चैनलों में पोषक तत्वों और रसायनों के बाद से लगातार की ओर से केन्द्र चैनल, केन्द्र चैनल के रासायनिक पर्यावरण diffusing हैं पक्ष चैनलों के साथ प्रवाह के माध्यम से आसानी से नियंत्रित किया जाता है. इस डिवाइस का उपयोग करना, हम दिखाना है कि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के आंदोलन को विभिन्न रासायनिक शर्तों के तहत आसानी से ऑप्टिकली निगरानी कर सकते हैं, और प्रयोगात्मक परिणाम बताते हैं कि epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर्स (EGFR) से अधिक अभिव्यक्ति तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की गतिशीलता को बढ़ाता है. तंत्रिका स्टेम सेल की गतिशीलता कोशिकाओं आक्रामकता का आकलन इस प्रकार tumorigenic 3 कारक के लिए एक महत्वपूर्ण biomarker है . एनएससी गतिशीलता अंतर्निहित तंत्र का गूढ़ रहस्य में तंत्रिका विकास के दोनों विकारों और मस्तिष्क कैंसर स्टेम सेल आक्रमण में अंतर्दृष्टि उपज जाएगा.
Protocol
प्रक्रिया
Fibronectin साथ कोटिंग स्लाइड्स
Microfluidic डिवाइस के कोडांतरण से पहले, fibronectin साथ गिलास स्लाइड बाँझ. कोट biohood में स्लाइड्स बाँझपन बनाए रखने के लिए. स्लाइड के किनारों के साथ एक बाँझ PDMS स्पेसर संरेखित करें और पक्ष है कि एक स्थायी मार्कर के साथ सामना करना पड़ रहा है निशान. पिपेट fibronectin के 5 μg / मिलीलीटर गिलास स्लाइड की सम्पूर्णता पर PDMS स्पेसर के अंदर (सिग्मा) समाधान की एक मिलीलीटर. एक घंटे के लिए undisturbed स्लाइड छोड़ो, तो सूखी पूरी तरह से एक एन 2 बंदूक का इस्तेमाल. स्लाइड बाद के प्रयोगों के लिए 4 ओ सी पर संग्रहीत किया जा सकता है .
डिवाइस कोडांतरण
पूरे डिवाइस विधानसभा प्रोटोकॉल बाँझ शर्तों के तहत एक biohood में किया जाता है, निम्न कार्यविधियों का उपयोग कर:
- यह पोंछते नीचे 70% इथेनॉल के साथ और एन 2 बंदूक के साथ सुखाने के द्वारा उस पर नमूनों microchannels के साथ सिलिकॉन मास्टर साफ़. 1 मिमी ऊंचाई मास्टर की राहत सुविधाओं के आसपास संदंश का उपयोग कर के एक बाँझ PDMS स्पेसर रखें.
- Agarose जेल agarose पाउडर के 0.3 ग्राम (फिशर साइंटिफिक) और सीओ के 10 मिलीलीटर वजन डिवाइस में इस्तेमाल की तैयारी दो स्वतंत्र मीडिया एक 50 मिलीलीटर बीकर में (Invitrogen). एक रंग और उच्च पर 20 सेकंड के लिए एक माइक्रोवेव में गर्मी के साथ मिश्रण हिलाओ. यदि undissolved granules मौजूद हैं, एक और 10 सेकंड और गर्म मिश्रण अंतिम शेष granules के छुटकारा ज़ुल्फ़ के लिए मिश्रण गर्मी. 8 सेकंड के एक हीटिंग समय के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ, और तब 5 सेकंड.
- जल्दी PDMS स्पेसर से घिरा सिलिकॉन मास्टर पर agarose समाधान डालना और तुरंत एक बाँझ गिलास स्लाइड के साथ agarose मिश्रण कवर. एक निरंतर, कोमल दबाव के बारे में 2 मिनट के लिए स्लाइड करने के लिए सुनिश्चित लागू करें कि एक ही निरंतर PDMS स्पेसर के रूप में 1 मिमी ऊंचाई agarose जेल जाएगा.
- Agarose जैल के बाद, छील सिलिकॉन मास्टर और एक fibronectin agarose जेल में स्लाइड का सामना करना पड़ रहा microchannels के साथ लेपित गिलास स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण से PDMS स्पेसर के साथ नमूनों agarose जेल बंद. एक 16 गेज सिरिंज टिप का उपयोग करने के लिए Inlet और आउटलेट accesses के लिए microchannels के जलाशय क्षेत्रों में छेद पंच के लिए. नमूनों agarose जेल microchannels के desiccation को रोकने के लिए स्लाइड पर सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया के 500 μl जोड़ें.
- एक्रिलिक डिवाइस में इस्तेमाल किया 70% इथेनॉल के साथ कई गुना धो और डि पानी से कुल्ला. Agarose जेल में microchannels के साथ छिद्रित छेद के साथ कई गुना में छेद संरेखित करें. फिर, जेल, PDMS स्पेसर, और डिवाइस के धातु फ्रेम के साथ fibronectin स्लाइड के साथ कई गुना संरेखित. डिवाइस में शिकंजा प्लेस और एक शराबी का उपयोग कर प्रतिरोध के बिंदु करने के लिए कस. यह सुनिश्चित करें कि युक्ति agarose में microchannels deforming की हद तक नहीं अधिक कड़ा है किया जाता है. एक दक्षिणावर्त क्रम में शिकंजा कस करने के लिए सुनिश्चित करें कि उपकरण के अंदर जेल बदलाव नहीं करता. लीक और एक 1ml सिरिंज का उपयोग कर microchannels में रुकावटों के लिए इस उपकरण का परीक्षण करें. सिरिंज Tygon टयूबिंग टयूबिंग की समाप्ति पर एक जेल लोडिंग विंदुक टिप के साथ के साथ फिट है microchannels में सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया इंजेक्षन . Microchannel सफलतापूर्वक गठन समझा जाता है जब मीडिया केवल जब मीडिया इसी इनलेट में अंतःक्षिप्त है microchannel की दुकान से बाहर निकलने के लिए मनाया जाता है. अब, उपकरण इस्तेमाल के लिए तैयार है.
तैयारी और डिवाइस में कोशिकाओं सीडिंग
जब कोशिकाओं (100,000 सेलों / एमएल के आसपास सेल घनत्व) 70% confluency तक पहुँचते हैं, वे डिवाइस में वरीयता प्राप्त होने के लिए तैयार हैं.
दो DPBS करने के लिए कोशिकाओं विषय washes (Invitrogen). Trypsin EDTA (Invitrogen) के 200 μl जोड़ें कोशिकाओं को अलग. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र M2 सीरम युक्त trypsin निष्क्रिय करने के लिए मीडिया के 5ml युक्त ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण. 5 मिनट के लिए 1000 RPM में कोशिकाओं के साथ विकास मीडिया Centrifuged. सतह पर तैरनेवाला बंद aspirated और कक्षों की गोली DPBS के 5 मिलीलीटर resuspend. DPBS कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र एक ही परिस्थितियों में. फिर से सतह पर तैरनेवाला बंद aspirated, और सीओ 500 μl 2 स्वतंत्र मीडिया सेल के गोली resuspend .
गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह के माध्यम से डिवाइस के microchannel केंद्र में कोशिकाओं के परिणामस्वरूप निलंबन बीज. सेल निलंबन के 60 μl और सीओ मध्यम 2 स्वतंत्र के 20 μl के साथ microchannel केंद्र के इनलेट आउटलेट जोड़ें, क्रमशः . कोशिका आसंजन के लिए देखने के लिए एक brightfield माइक्रोस्कोपी के तहत microchannel केन्द्र का निरीक्षण करें. कोशिकाओं को आम तौर पर 10 मिनट के बाद का पालन करें. बाद कोशिकाओं चैनल के नीचे करने के लिए एक उचित घनत्व पालन, इनलेट में शेष सेल निलंबन और आउटलेट में मीडिया pipeted. सीओ प्लेस 60 μl दोनों और केन्द्र चैनल के इनलेट आउटलेट में 2 स्वतंत्र मीडिया. प्लेस PDMS वें से अधिक शामिल हैंई केंद्र Inlet और आउटलेट केंद्र चैनल से मीडिया के वाष्पीकरण को कम करने के लिए.
कोशिकाओं इमेजिंग डिवाइस में
डिवाइस के विधानसभा से पहले माइक्रोस्कोप के मौसम स्टेशन (X81 ओलिंप) के माध्यम से बाँझ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला टयूबिंग धागा और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (205U/CA वाटसन - मार्लो) के साथ कनेक्ट. टयूबिंग के माध्यम से 4 RPM के एक दर पर पीबीएस फ्लश. डिवाइस के विधानसभा के बाद, epidermal वृद्धि (EGF) (सिग्मा) कारक एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया में समाधान का उचित सांद्रता तैयार करते हैं. भंवर 5 सेकंड के लिए EGF समाधान और टयूबिंग के साथ कनेक्ट. डिवाइस के लिए इसी EGF सांद्रता के साथ चिह्नित tubings कनेक्ट. इसके बारे में एक घंटा लगता है के लिए EGF चैनल रिज भर में फैलाना और एक स्थिर रासायनिक ढाल स्थापित है.
एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर, Slidebook, के बारे में एक प्रयोगात्मक रन में 5 घंटे के लिए हर 10 मिनट में छवियों का एक सेट लेने के लिए प्रयोग किया जाता है. xy स्वचालित मंच क्रमादेशित है जैसे कि एक ही केन्द्र चैनल, और तीन केंद्र चैनलों के कुल दो उप क्षेत्रों (400μm x400μm के एक क्षेत्र के साथ प्रत्येक) एक निश्चित समय बिंदु पर imaged हैं. अलग केंद्र चैनल (3 आम तौर पर एक समय में) में कक्ष अलग EGF सांद्रता, के रूप में टयूबिंग पर चिह्नित किया है.
सामग्री और उपकरण
सेल लाइनों: C17.2 कोशिकाओं प्रसवोत्तर माउस सेरिबैलम 6, 7 के बाहरी कीटाणु परत से व्युत्पन्न एनएससी हैं. इस सेल लाइन का उपयोग करना, हम दो अन्य murine स्टेम सेल लाइनों retrovirus अभिकर्मक विधि का उपयोग विकसित किया है. इन दो stably ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों (1) wtEGFR कर रहे हैं - कि मानव जंगली प्रकार EGFR खत्म व्यक्त, और (2) ΔEGFR - एक constitutively सक्रिय EGFR उत्परिवर्ती है कि. पता लगाने में आसानी के लिए, रेट्रोवायरस ribosomal (IRES) बाध्यकारी और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए एक आंतरिक साइट के द्वारा पीछा हितों की जीन के साथ एक रीढ़ ले.
सेल संस्कृति: माउस C17.2 एनएससी और उनके वेरिएंट M2 के मीडिया में एक थाली 6 अच्छी तरह से (10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम (Invitrogen), 5% घोड़े सीरम (एचएस) (Invitrogen DMEM (Invitrogen) में बड़े हो रहे थे ), और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen)). कक्ष 37 ओ सी पर 80% हवा और 5% सीओ 2 में बनाए रखा गया.
Microfluidic युक्ति: एक प्लास्टिक कई गुना, एक PDMS स्पेसर, और जगह में डिवाइस रखने के लिए एक स्टेनलेस फ्रेम.
इमेजिंग
एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन (ओलिंप नौवीं-81), एक तेज सीसीडी कैमरा (Orca, हमामात्सू) के साथ संबंध में प्रयोग किया जाता है. microfluidic डिवाइस एक स्वचालित xyz मंच पर मुहिम शुरू की है, और मंच एक पर्यावरण कक्ष है कि 37 ओ सी के एक तापमान बनाए रखता है से घिरा है वहां आम तौर पर कर रहे हैं कि स्वचालित xyz मंच का उपयोग एक ही समय बिंदु पर फिल्माया जाएगा एक ही चिप पर 3-4 उपकरणों.
बनाए रखने फ्लो
8 समानांतर लाइनों (205U/CA वाटसन - मार्लो) ऑटो के साथ एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप सिंक और स्रोत चैनलों के सभी में प्रवाह बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्र तीन एनएससी उपभेदों के विभिन्न EGF सांद्रता में 1 (पैतृक, wtEGFR, और डी EGFR) गतिशीलता सभी trajectories 5 घंटे की एक फिल्म (wtEGF 100ng/ml, 4hour के लिए छोड़कर) पर नज़र रखने से लिया जाता है, और सभी पटरियों के मूल थे तुलना प्रयोजन के लिए (0,0) repositioned.
चित्र EGFR अभिव्यक्ति के स्तर और गतिशीलता (क) 100ng/ml EGF साथ एक microfluidic चैनल की सतह पर दो wtEGF एनएससी की छवियों के 2 सहसंबंध. बाईं छवि एक फ्लोरोसेंट छवि है, और सही एक संचरित उज्ज्वल क्षेत्र छवि है. पैमाने बार 100μm है, और चैनल चौड़ाई 400 सुक्ष्ममापी है. कक्ष दो आबादी में व्यक्त GFP की चमक के द्वारा अलग कर रहे हैं. कक्ष में नीले हलकों dimmer हैं, इस प्रकार कम EGFR अभिव्यक्ति के स्तर है, और लाल हलकों में कोशिकाओं brigher हैं, इस प्रकार उच्च EGFR अभिव्यक्ति के स्तर है . (ख) कम और उच्च EGFR अभिव्यक्ति के स्तर के साथ कोशिकाओं के trajectories . इन trajectories चार घंटे लंबी फिल्म से लिया जाता है.
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Discussion
चित्र एक तीन एनएससी उपभेदों, माता पिता कोशिकाओं, wtEGFR और ΔEGFR (नियंत्रण) के trajectories से पता चलता है. Trajectories के प्रत्येक सेट में एक 5 घंटे लंबी फिल्म से प्राप्त किया गया. पैतृक कोशिकाओं के लिए सेल गतिशीलता जब EGF एकाग्रता ~ 10ng/ml था नुकीला, wtEGFR कोशिकाओं के लिए सेल गतिशीलता चोटी 100ng/ml या इसके बाद के संस्करण के लिए स्थानांतरित कर दिया, ΔEGFR कोशिकाओं के लिए सेल गतिशीलता EGF एकाग्रता की स्वतंत्र रूप में की उम्मीद है.
100ng/ml के साथ wtEGF कोशिकाओं के सबसे गतिशील कोशिकाओं थे, वे के बारे में 1.5 गुना 10ng/ml के साथ माता पिता कोशिकाओं की तुलना में तेजी से चले गए. यह इंगित करता है कि (1) EGFR की अभिव्यक्ति से अधिक कोशिकाओं गतिशीलता को बढ़ाता है, (2) EGF ligand रिसेप्टर नीलामी की घटनाओं की संख्या सेल गतिशीलता पर सीधा प्रभाव पड़ता है. ΔEGFR सेल लाइन constitutively सक्रिय EGFR उत्परिवर्ती है. इस उत्परिवर्ती मानव glioblastoma की ~ 60% में प्रकट होता है. यह एक छोटा कोशिकी डोमेन है कि एक विधान सक्रिय kinase ligand स्वतंत्र हो जाता है. autophosphorylation की तीव्रता ligand सक्रिय जंगली प्रकार (wtEGFR) EGFR 4 के साथ तुलना में छोटा है (लगभग 10% ). यह अवलोकन है कि ΔEGF कोशिकाओं माता पिता और wtEGFR (EGF के अभाव में) की तुलना में थोड़ा अधिक गतिशीलता है, लेकिन एक निरंतर गतिशीलता विभिन्न EGF सांद्रता में रखा जाता है underlies.
चूंकि wtEGFR कोशिकाओं GFP (हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन) और EGFR का एक ही प्रतियां किया, wtEGFR कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता EGFR अभिव्यक्ति के स्तर का पता चलता है. यह हमें सीधे सेल गतिशीलता के साथ EGFR प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर (हरे रंग का फ्लोरोसेंट तीव्रता) सहसंबंधी करने की अनुमति देता है. चित्र 2 से पता चलता है दो सेल की आबादी का trajectories, लाल वृत्त में कोशिकाओं चमक रहे हैं, इस प्रकार उच्च EGFR अभिव्यक्ति के स्तर है, और नीले वृत्त में कोशिकाओं रात के खाने हैं, इस प्रकार कम EGFR अभिव्यक्ति के स्तर है. परिणाम फिर से दिखाना है कि उच्च EGFR अभिव्यक्ति के स्तर, अधिक गतिशील इन कोशिकाओं रहे हैं.
परंपरागत रूप से, एनएससी की गतिशीलता Boyden कक्ष परख, जहां एक झिल्ली के माध्यम से पलायन कोशिकाओं का प्रतिशत 5 मूल्यांकन किया जाता है का उपयोग करने के लिए निर्धारित किया गया है. यह एक जनसंख्या आधारित परख, जहां सेल व्यवहार व्यक्तिगत मूल्यांकन नहीं कर सकते हैं. यहाँ दिखाया microfluidic डिवाइस एक एकल कोशिका के स्तर पर सेल गति का अध्ययन करने का अवसर प्रस्तुत करता है, और एक अच्छी तरह से नियंत्रित रासायनिक वातावरण में. यह एक की अनुमति देता है, पहली बार के लिए, सीधे EGFR एनएससी गतिशीलता phenotype के साथ जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर सहसंबंधी. डिवाइस के छोटे आकार के ऐसे मानव स्टेम कोशिकाओं के रूप में में जहां कोशिकाओं स्रोतों सीमित हैं प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
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Acknowledgments
यह काम विज्ञान के न्यूयॉर्क राज्य कार्यालय, प्रौद्योगिकी और शैक्षणिक अनुसंधान (NYSTAR) (उन्नत प्रौद्योगिकी अनुदान के लिए एक केन्द्र के रूप में), और नेनोबायोटेक्नोलॉजी केंद्र (NBTC), राष्ट्रीय एसटीसी कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित है समझौते ईसीएस 9876771 - सं के तहत विज्ञान फाउंडेशन, और अमेरिकी ब्रेन ट्यूमर एसोसिएशन और मेडिसिन के न्यू यॉर्क अकादमी (जब).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
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- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
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