Summary
Nós demonstramos que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais (NSCs) usando um romance agarose gel com base em dispositivo microfluídicos. Esta tecnologia pode ser facilmente adaptável a outros sistemas de células de mamíferos, onde fontes de células são escassos, como células-tronco neurais, ea volta em torno do tempo é crítica.
Abstract
Embora a tecnologia microfluídica está chegando a um novo nível de maturidade para ensaios macromolecular, baseada em células ensaios estão ainda numa fase infantil 1. Isto é principalmente devido à dificuldade com que se pode criar um microambiente celular compatível e estável utilizando técnicas de microfabricação e materiais convencionais. Nós resolvemos este problema através da introdução de um material de microfabricação romance, agarose gel, como o material de base para o dispositivo microfluídicos. Agarose gel é altamente maleável e permeável a gás e nutrientes necessários para a sobrevivência da célula e, assim, um material ideal para celulares baseado em ensaios. Nós temos mostrado previamente que os dispositivos de agarose gel a base tem sido bem sucedida no estudo da migração de células de bactérias e neutrófilos 2. Neste relatório, três paralelas canais microfluídicos são padronizados em uma membrana de gel de agarose de cerca de 1 milímetro de espessura. Fluxos constantes com a mídia / buffer são mantidos nos dois canais laterais utilizando uma bomba peristáltica. As células são mantidas no canal central para a observação. Uma vez que os nutrientes e produtos químicos nos canais laterais estão constantemente difusão a partir do lado do centro do canal, o ambiente químico do canal central é facilmente controlado através do fluxo ao longo dos canais laterais. Usando este dispositivo, demonstramos que o movimento de células-tronco neurais pode ser monitorada visualmente com facilidade sob condições químicas diferentes, e os resultados experimentais mostram que a expressão de receptores de mais de fator de crescimento epidérmico (EGFR) aumenta a motilidade das células-tronco neurais. Motilidade das células-tronco neurais é um importante biomarcador para avaliar a agressividade das células, portanto, fator de tumorigénico 3. Decifrar o mecanismo subjacente a motilidade NSC trará insights sobre ambos os transtornos do desenvolvimento neural e no cérebro de invasão de células-tronco cancerosas.
Protocol
Procedimento
Slides de revestimento com fibronectina
Antes da montagem do dispositivo micro, esterilizar as lâminas de vidro com fibronectina. Pelagem os slides em uma biohood para manter a esterilidade. Alinhar um espaçador PDMS estéril ao longo das bordas do slide e marcar o lado que está virado para cima com um marcador permanente. Pipetar 1 ml de solução a 5 mg / ml de fibronectina (Sigma) no interior do espaçador PDMS sobre a totalidade da lâmina de vidro. Deixe os slides sem ser perturbado por uma hora, em seguida, secar completamente usando uma arma de N 2. Os slides podem ser armazenados a 4 o C para os experimentos posteriores.
A montagem do dispositivo
O protocolo conjunto inteiro dispositivo é feito de uma biohood em condições estéreis, utilizando os seguintes procedimentos:
- Limpe o mestre de silício com os microcanais estampados nele, limpando-a com álcool 70% e secagem com o 2 N arma. Coloque um espaçador PDMS estéril de 1 mm de altura usando uma pinça em torno do alívio características do mestre.
- Prepare o gel agarose utilizada no dispositivo, pesando 0,3 g de agarose em pó (Fisher Scientific) e 10 ml de CO 2 de mídia independente (Invitrogen) num copo de 50 ml. Agitar a mistura com uma espátula e aquecer no microondas por 20 segundos na potência alta. Se não dissolvido grânulos estão presentes, aquecer a mistura por mais 10 segundos e agite a mistura quente para se livrar dos grânulos últimos remanescentes. Repita o processo com um tempo de aquecimento de 8 segundos, e depois de 5 segundos.
- Rapidamente despeje a solução de agarose para o mestre de silício cercado por o espaçador PDMS e cobrir imediatamente a mistura agarose com uma lâmina de vidro estéril. Aplicar uma pressão constante e suave para o slide para cerca de 2 minutos para garantir que o gel agarose vai à mm de altura mesma constante 1 como o espaçador PDMS.
- Depois que o gel de agarose, retire o padrão agarose gel com o espaçador PDMS do mestre de silício e transferir para uma lâmina de vidro revestidas com fibronectina os microcanais do gel de agarose de frente para o slide. Use uma seringa de calibre 16 para fazer furos nas regiões reservatório da microcanais para entrada e saída de acessos. Adicionar 500 mL de CO 2 independente de mídia para o gel agarose padrão no slide para prevenir o dessecamento da microcanais.
- Lavar o colector de acrílico utilizada no dispositivo com etanol 70% e enxágüe com água DI. Alinhe os orifícios no colector com o furos no gel de agarose com os microcanais. Então, alinhar o bloco com o gel, espaçador PDMS, eo slide fibronectina com a estrutura metálica do dispositivo. Coloque os parafusos em dispositivo e aperte o ponto de resistência usando uma chave de fenda. Isto é feito para garantir que o dispositivo não é mais apertada ao ponto de deformar os microcanais na agarose. Aperte os parafusos no sentido horário para garantir que o gel dentro do dispositivo não se desloque. Testar o dispositivo de vazamentos e entupimentos nos microcanais com uma seringa de 1ml. A seringa é equipado com tubos de Tygon com uma ponteira gel de carga no final da tubulação para injetar CO 2 independente de mídia na microcanais. A microcanais é considerado formado com êxito quando a mídia é observada a única saída da tomada do microcanal quando a mídia é injetado na entrada correspondente. Agora, o dispositivo está pronto para uso.
Preparar e propagação das células no dispositivo
Quando as células chegar a 70% (densidade celular cerca de 100.000 células / ml) confluência, eles estão preparados para ser semeado no dispositivo.
Assunto das células a dois DPBS (Invitrogen) lavagens. Adicionar 200 mL de tripsina-EDTA (Invitrogen) para destacar as células. Transferência das células para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 5 ml de mídia M2 contendo soro para inativar a tripsina. Centrifugadas a mídia de crescimento com as células a 1000 RPM por 5 minutos. Aspirado fora o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células 5 ml de DPBS. Centrifugar as células DPBS novamente sob as mesmas condições. Aspirado fora o sobrenadante novamente, e ressuspender o sedimento de células em 500 mL de CO 2 de mídia independente.
Semente a suspensão resultante de células para o centro de microcanais do dispositivo através da gravidade-driven fluir. Adicione a entrada e saída do centro de microcanais com 60 mL da suspensão de células e 20 l de CO 2 a médio-independente, respectivamente. Observar o centro de microcanais sob um microscópio de campo claro de olhar para adesão celular. As células aderem geralmente após 10 minutos. Depois que as células aderem ao fundo do canal com uma densidade adequada, pipeted a suspensão de células restantes na entrada e os meios de comunicação na tomada. ML lugar 60 de CO 2 em ambos os meios de comunicação independentes de entrada e saída do canal central. Lugar PDMS cobre mais de the de entrada e saída de centro para minimizar a evaporação de mídia do canal central.
Imagem das células no dispositivo
Antes da montagem do dispositivo, rosca do tubo estéril peristáltica através da estação meteorológica do microscópio (Olympus X81) e se conectar com a bomba peristáltica (Watson-Marlow 205U/CA). Lave PBS através do tubo a uma taxa de 4 RPM. Após a montagem do dispositivo, prepare concentrações adequadas de fator de crescimento epidérmico (EGF) (Sigma) soluções no CO 2-de mídia independente em tubos de centrífuga de 15 ml. Vortex as soluções EGF por 5 segundos e se conectar com o tubo. Conecte o tubulações marcados com concentrações EGF correspondente ao dispositivo. Demora cerca de uma hora para o EGF para difundir todo o cume e estabelecer um canal de gradiente químico estável.
Um software de imagem, Slidebook, é usada para tomar um conjunto de imagens a cada 10 minutos para cerca de 5 horas em uma corrida experimental. O estágio xy automatizado é programado de tal forma que duas sub-áreas (cada uma com uma área de 400 micras de x400μm) do canal de mesmo centro, e um total de três canais centro são gravadas em um ponto determinado momento. Células em diferentes canais de centro (tipicamente 3 em uma corrida) tem concentrações diferentes EGF, conforme marcado na tubulação.
Materiais e Equipamentos
Linhagens de células: as células são C17.2 NSCs derivadas da camada externa germinal do cerebelo do rato pós-natal 6, 7. Usando esta linha de células, nós desenvolvemos outras duas linhas-tronco de camundongos células usando o método de transfecção retrovírus. Estas duas linhas de células transfectadas estavelmente são (1) wtEGFR - que mais expressa o EGFR-tipo humano selvagem, e (2) ΔEGFR - que é um mutante EGFR constitutivamente ativo. Para facilitar a detecção, os retrovírus levar um backbone com o gene de interesse seguido por um site interno para a ligação ribossomal (IRES) e da proteína verde fluorescente (GFP).
Cultura de células: O rato C17.2 NSCs e suas variantes foram cultivadas em uma placa de seis poços em M2 media (DMEM (Invitrogen) com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Invitrogen), 5% soro de cavalo (HS) (Invitrogen ), e 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen).) As células foram mantidas a 37 º C no ar de 80% e 5% CO 2.
Dispositivo micro: Um colector de plástico, um espaçador PDMS, e um quadro de inox para prender o dispositivo no lugar.
Imagem
Um microscópio invertido fluorescente (Olympus IX-81) é usado, em conexão com um CCD intensificada câmera (Orca, Hamamatsu). O dispositivo micro é montado em um palco xyz automatizados, eo palco está cercada por uma câmara de ambiente que mantém uma temperatura de 37 º C. Normalmente existem dispositivos de 04/03 no mesmo chip que será filmado no ponto mesmo tempo, utilizando o palco xyz automatizado.
Manter o fluxo
A bomba peristáltica com 8 linhas paralelas (Watson-Marlow 205U/CA) auto é usado para manter os fluxos em todos os canais de pia e fonte.
Fig. Motilidade uma de três cepas NSC (parental, wtEGFR e D EGFR) em concentrações EGF vários Todas as trajetórias são tomadas a partir de rastreamento de um filme de 5 horas (exceto para wtEGF 100ng/ml, quatro horas), ea origem de todas as faixas foram reposicionado em (0,0) para fins de comparação.
Fig. 2 Correlação de EGFR nível de expressão e de motilidade (a) duas imagens de NSCs wtEGF na superfície de um canal microfluídicos com 100ng/ml EGF. A imagem da esquerda é uma imagem fluorescente, eo direito é uma imagem transmitida campo brilhante. A barra de escala é 100μm, e os Largura do canal é 400 m. As células são separadas em duas populações pelo brilho da GFP expressa. Células nos círculos azuis são dimmer, portanto, têm menos nível de expressão do EGFR, e as células em círculos vermelhos são brigher, portanto, têm maior nível de expressão de EGFR. (B) Trajetórias de células com nível baixo e alto EGFR expressão. Essas trajetórias são tiradas de um filme de quatro horas de duração.
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Discussion
Fig. 1 mostra as trajetórias de três cepas NSC, as células dos pais, o wtEGFR eo ΔEGFR (controle). Cada conjunto de trajetórias foram obtidos a partir de um filme de cinco horas de comprimento. Para as células dos pais, motilidade celular pico quando a concentração de EGF foi ~ 10ng/ml; para células wtEGFR, pico motilidade celular mudou para 100ng/ml ou acima; para células ΔEGFR, a motilidade celular foi independente da concentração de EGF como esperado.
As células wtEGF com 100ng/ml foram as células mais móveis, eles se mudaram cerca de 1,5 vezes mais rápido que as células dos pais com 10ng/ml. Isso indica que (1) sobre a expressão de EGFR amplia a motilidade células, (2) o número de eventos EGF ligante-receptor biding tem um impacto direto sobre a motilidade celular. ΔEGFR linha celular é um mutante EGFR constitutivamente ativo. Este mutante aparece em ~ 60% de glioblastoma humano. Ele tem um domínio extracelular truncada que se torna um constitutiva quinase ligante-independente ativo. A intensidade da autofosforilação é pequeno (aproximadamente 10%) em comparação com ligante activado tipo selvagem EGFR (wtEGFR) 4. O que reforça a observação de que células ΔEGF têm motilidade ligeiramente superior à dos pais e wtEGFR (na ausência de EGF), mas a motilidade é mantida uma constante em concentrações diferentes EGF.
Uma vez que as células wtEGFR realizado mesmas cópias de GFP (proteína fluorescente verde) e EGFR, a intensidade de fluorescência das células wtEGFR revelar os níveis de expressão do EGFR. Isso nos permite correlacionar diretamente a expressão da proteína EGFR nível (intensidade fluorescente verde) com a motilidade celular. Fig. 2 mostra as trajetórias de dois população de células, as células do círculo vermelho são mais brilhantes, portanto, tem maior nível de expressão do EGFR, e as células em círculo azul estão o jantar, portanto, tem menor nível de expressão de EGFR. Os resultados mais uma vez demonstram que quanto maior o nível de expressão do EGFR, mais móveis estas células são.
Tradicionalmente, a motilidade do NSCs foi determinado utilizando um ensaio de câmara de Boyden, onde a porcentagem de células migram através de uma membrana é avaliado 5. Este é um ensaio de base populacional, onde o comportamento das células não pode ser avaliado individualmente. O dispositivo micro mostrado aqui representa uma oportunidade para estudar o movimento das células em um nível única célula, e em um ambiente químico bem controlada. Ela permite que um, pela primeira vez, para correlacionar diretamente o nível de expressão da proteína EGFR com o fenótipo NSCs motilidade em células vivas. O pequeno tamanho do dispositivo é especialmente útil para experimentos onde as fontes de células são limitados, tais como as células-tronco humanas.
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Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo Escritório Estado de Nova York da Ciência, Tecnologia e Pesquisa Acadêmica (NYSTAR) (na forma de um Centro de Tecnologia Avançada de subvenção) e por concessões do Centro de Nanobiotecnologia (NBTC), um Programa Nacional da STC Science Foundation no âmbito do Acordo No. ECS-9876771, e da Associação Americana Tumor Cerebral e do New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
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- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
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